Ved hjelp av ovo-elektroporering utviklet vi en metode for selektivt å transfektere det hørbare indre øret og cochleakjernen i kyllingembryoer for å oppnå en cellegruppespesifikk knockdown av skjørt X-mentalt retardasjonsprotein i diskrete perioder med kretsmontering.
Fragile X mental retardation protein (FMRP) er et mRNA-bindende protein som regulerer lokal proteinoversettelse. FMRP-tap eller dysfunksjon fører til avvikende nevronale og synaptiske aktiviteter i fragilt X-syndrom (FXS), som er preget av intellektuell funksjonshemming, sensoriske abnormiteter og sosiale kommunikasjonsproblemer. Studier av FMRP-funksjon og FXS-patogenese er primært utført med Fmr1 (genet som koder for FMRP) knockout hos transgene dyr. Her rapporterer vi en in vivo-metode for å bestemme den celle-autonome funksjonen til FMRP i perioden med kretsmontering og synaptisk dannelse ved bruk av kyllingembryoer. Denne metoden benytter scene-, steds- og retningsspesifikk elektroporering av et legemiddelinduserbart vektorsystem som inneholder Fmr1 lite hårnåls-RNA (shRNA) og en EGFP-reporter. Med denne metoden oppnådde vi selektiv FMRP-knockdown i den auditive ganglion (AG) og i et av hjernestammemålene, kjernen magnocellularis (NM), og dermed gi en komponentspesifikk manipulasjon i AG-NM-kretsen. I tillegg tillater mosaikkmønsteret til transfeksjonen kontroller innen dyr og nærliggende nevron / fiber sammenligninger for økt pålitelighet og følsomhet i dataanalyse. Det induserbare vektorsystemet gir tidsmessig kontroll av genredigeringsstart for å minimere akkumulerende utviklingseffekter. Kombinasjonen av disse strategiene gir et innovativt verktøy for å dissekere den celle-autonome funksjonen til FMRP i synaptisk og kretsutvikling.
Fragilt X-syndrom (FXS) er en nevroutviklingsforstyrrelse preget av intellektuell funksjonshemming, sensoriske abnormiteter og autistisk atferd. I de fleste tilfeller er FXS forårsaket av et globalt tap av skjøre X-mental retardasjonsprotein (FMRP; kodet av Fmr1-genet) som starter i tidlige embryonale stadier1. FMRP er et RNA-bindende protein som normalt uttrykkes i de fleste nevroner og gliaceller i hjernen, samt i sanseorganer 2,3,4. I pattedyrhjerner er FMRP sannsynligvis forbundet med hundrevis av mRNA som koder for proteiner som er viktige for ulike nevrale aktiviteter5. Studier av konvensjonelle Fmr1 knockout-dyr viste at FMRP-uttrykk er spesielt viktig for montering og plastisitet av synaptisk nevrotransmisjon6. Flere betingede og mosaiske knockoutmodeller har videre vist at FMRP-handlinger og signaler varierer på tvers av hjernegrupper, celletyper og synaptiske steder under flere utviklingshendelser, inkludert aksonal projeksjon, dendritisk mønster og synaptisk plastisitet 7,8,9,10,11,12,13,14 . Akutt funksjon av FMRP i regulering av synaptisk overføring ble studert ved intracellulær levering av hemmende FMRP-antistoffer eller FMRP selv i hjerneskiver eller dyrkede nevroner15,16,17,18. Disse metodene gir imidlertid ikke muligheten til å spore FMRP-feiluttrykksinduserte konsekvenser under utvikling. Dermed er det stort behov for å utvikle in vivo-metoder for å undersøke de celle-autonome funksjonene til FMRP, og forventes å bidra til å avgjøre om de rapporterte anomaliene hos FXS-pasienter er direkte konsekvenser av FMRP-tap i de tilknyttede nevronene og kretsene, eller sekundære konsekvenser avledet av nettverksomfattende endringer under utvikling19.
Den auditive hjernestammen til kyllingembryoer tilbyr en unik fordelaktig modell for dyptgående funksjonelle analyser av FMRP-regulering i krets- og synapseutvikling. Den enkle tilgangen til embryonale kyllinghjerner og den veletablerte i ovo elektroporeringsteknikk for genetisk manipulasjon har bidratt sterkt til vår forståelse av hjernens utvikling i tidlige embryonale stadier. I en nylig publisert studie ble denne teknikken kombinert med avanserte molekylære verktøy som tillater temporal kontroll av FMRP feiluttrykk20,21. Her er metodikken avansert for å indusere selektive manipulasjoner av presynaptiske og postsynaptiske nevroner separat. Denne metoden ble utviklet i den auditive hjernestammekretsen. Akustisk signal oppdages av hårceller i det hørbare indre øret og overføres deretter til den hørbare ganglion (AG; også kalt spiralganglion hos pattedyr). Bipolare nevroner i AG innerverer hårceller med sine perifere prosesser og sender i sin tur en sentral projeksjon (hørselsnerven) til hjernestammen hvor de avsluttes i to primære cochleakjerner, kjernen magnocellularis (NM) og nucleus angularis (NA). Nevroner i NM er strukturelt og funksjonelt sammenlignbare med de sfæriske buskcellene i pattedyrets anteroventrale cochleakjerne. Innenfor NM, auditive nervefibre (ANFs) synapse på somata av NM nevroner via den store endbulb av Held terminaler22. Under utviklingen oppstår NM-nevroner fra rhombomeres 5 og 6 (r5/6) i bakhjernen23, mens AG-nevroner er avledet fra neuroblaster bosatt i otocyst24. Her beskriver vi prosedyren for selektivt å slå ned FMRP-uttrykk i de presynaptiske AG-nevronene og i de postsynaptiske NM-nevronene separat.
For å bestemme den celle-autonome funksjonen til FMRP, er det nødvendig å manipulere uttrykket i individuelle cellegrupper eller celletyper. Siden en av hovedfunksjonene til FMRP er å regulere synaptisk formasjon og plastisitet, er selektiv manipulering av hver synaptisk komponent i en bestemt krets en forutsetning for en full forståelse av FMRP-mekanismen i synaptisk kommunikasjon. Ved hjelp av ovo-elektroporering av kyllingembryoer demonstrerte vi en metode for å målret…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av: et National Natural Science Foundation of China-stipend (nr. 32000697); vitenskaps- og teknologiprogrammet i Guangzhou (202102080139); Guangdong naturvitenskapelige stiftelse (2019A1515110625, 2021A1515010619); de grunnleggende forskningsfondene for de sentrale universitetene (11620324); et forskningsstipend fra Key Laboratory of Regenerative Medicine, Utdanningsdepartementet, Jinan University (nr. ZSYXM202107); de grunnleggende forskningsfondene for de sentrale universitetene i Kina (21621054); og Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen i Kina (20191118142729581). Vi takker det medisinske eksperimentelle senteret ved Jinan University. Vi takker Dr. Terra Bradley for nøye redigering av manuskriptet.
Egg incubation | |||
16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
Plasmid preparation | |||
Centrifuge | Sigma | 10016 | |
Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
Electroporation and Doxycycline Administration | |||
Electroporator | BTX | ECM399 | |
1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Tissue Dissection and Fixation | |||
Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
Other surgery tools | RWD | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
Sectioning | |||
Cryostat | LEICA | CM1850 | |
Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
Immunostaining | |||
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
Netwell plate | Corning | 3478 | |
Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
Imaging | |||
Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |