Summary

Dissekere celle-autonom funksjon av skjøre X mental retardasjon protein i en auditiv krets ved i ovo elektroporering

Published: July 06, 2022
doi:

Summary

Ved hjelp av ovo-elektroporering utviklet vi en metode for selektivt å transfektere det hørbare indre øret og cochleakjernen i kyllingembryoer for å oppnå en cellegruppespesifikk knockdown av skjørt X-mentalt retardasjonsprotein i diskrete perioder med kretsmontering.

Abstract

Fragile X mental retardation protein (FMRP) er et mRNA-bindende protein som regulerer lokal proteinoversettelse. FMRP-tap eller dysfunksjon fører til avvikende nevronale og synaptiske aktiviteter i fragilt X-syndrom (FXS), som er preget av intellektuell funksjonshemming, sensoriske abnormiteter og sosiale kommunikasjonsproblemer. Studier av FMRP-funksjon og FXS-patogenese er primært utført med Fmr1 (genet som koder for FMRP) knockout hos transgene dyr. Her rapporterer vi en in vivo-metode for å bestemme den celle-autonome funksjonen til FMRP i perioden med kretsmontering og synaptisk dannelse ved bruk av kyllingembryoer. Denne metoden benytter scene-, steds- og retningsspesifikk elektroporering av et legemiddelinduserbart vektorsystem som inneholder Fmr1 lite hårnåls-RNA (shRNA) og en EGFP-reporter. Med denne metoden oppnådde vi selektiv FMRP-knockdown i den auditive ganglion (AG) og i et av hjernestammemålene, kjernen magnocellularis (NM), og dermed gi en komponentspesifikk manipulasjon i AG-NM-kretsen. I tillegg tillater mosaikkmønsteret til transfeksjonen kontroller innen dyr og nærliggende nevron / fiber sammenligninger for økt pålitelighet og følsomhet i dataanalyse. Det induserbare vektorsystemet gir tidsmessig kontroll av genredigeringsstart for å minimere akkumulerende utviklingseffekter. Kombinasjonen av disse strategiene gir et innovativt verktøy for å dissekere den celle-autonome funksjonen til FMRP i synaptisk og kretsutvikling.

Introduction

Fragilt X-syndrom (FXS) er en nevroutviklingsforstyrrelse preget av intellektuell funksjonshemming, sensoriske abnormiteter og autistisk atferd. I de fleste tilfeller er FXS forårsaket av et globalt tap av skjøre X-mental retardasjonsprotein (FMRP; kodet av Fmr1-genet) som starter i tidlige embryonale stadier1. FMRP er et RNA-bindende protein som normalt uttrykkes i de fleste nevroner og gliaceller i hjernen, samt i sanseorganer 2,3,4. I pattedyrhjerner er FMRP sannsynligvis forbundet med hundrevis av mRNA som koder for proteiner som er viktige for ulike nevrale aktiviteter5. Studier av konvensjonelle Fmr1 knockout-dyr viste at FMRP-uttrykk er spesielt viktig for montering og plastisitet av synaptisk nevrotransmisjon6. Flere betingede og mosaiske knockoutmodeller har videre vist at FMRP-handlinger og signaler varierer på tvers av hjernegrupper, celletyper og synaptiske steder under flere utviklingshendelser, inkludert aksonal projeksjon, dendritisk mønster og synaptisk plastisitet 7,8,9,10,11,12,13,14 . Akutt funksjon av FMRP i regulering av synaptisk overføring ble studert ved intracellulær levering av hemmende FMRP-antistoffer eller FMRP selv i hjerneskiver eller dyrkede nevroner15,16,17,18. Disse metodene gir imidlertid ikke muligheten til å spore FMRP-feiluttrykksinduserte konsekvenser under utvikling. Dermed er det stort behov for å utvikle in vivo-metoder for å undersøke de celle-autonome funksjonene til FMRP, og forventes å bidra til å avgjøre om de rapporterte anomaliene hos FXS-pasienter er direkte konsekvenser av FMRP-tap i de tilknyttede nevronene og kretsene, eller sekundære konsekvenser avledet av nettverksomfattende endringer under utvikling19.

Den auditive hjernestammen til kyllingembryoer tilbyr en unik fordelaktig modell for dyptgående funksjonelle analyser av FMRP-regulering i krets- og synapseutvikling. Den enkle tilgangen til embryonale kyllinghjerner og den veletablerte i ovo elektroporeringsteknikk for genetisk manipulasjon har bidratt sterkt til vår forståelse av hjernens utvikling i tidlige embryonale stadier. I en nylig publisert studie ble denne teknikken kombinert med avanserte molekylære verktøy som tillater temporal kontroll av FMRP feiluttrykk20,21. Her er metodikken avansert for å indusere selektive manipulasjoner av presynaptiske og postsynaptiske nevroner separat. Denne metoden ble utviklet i den auditive hjernestammekretsen. Akustisk signal oppdages av hårceller i det hørbare indre øret og overføres deretter til den hørbare ganglion (AG; også kalt spiralganglion hos pattedyr). Bipolare nevroner i AG innerverer hårceller med sine perifere prosesser og sender i sin tur en sentral projeksjon (hørselsnerven) til hjernestammen hvor de avsluttes i to primære cochleakjerner, kjernen magnocellularis (NM) og nucleus angularis (NA). Nevroner i NM er strukturelt og funksjonelt sammenlignbare med de sfæriske buskcellene i pattedyrets anteroventrale cochleakjerne. Innenfor NM, auditive nervefibre (ANFs) synapse på somata av NM nevroner via den store endbulb av Held terminaler22. Under utviklingen oppstår NM-nevroner fra rhombomeres 5 og 6 (r5/6) i bakhjernen23, mens AG-nevroner er avledet fra neuroblaster bosatt i otocyst24. Her beskriver vi prosedyren for selektivt å slå ned FMRP-uttrykk i de presynaptiske AG-nevronene og i de postsynaptiske NM-nevronene separat.

Protocol

Egg og kyllingembryoer ble håndtert med forsiktighet og respekt i samsvar med dyreprotokollene godkjent av Jinan University Animal Care and Use Committee. 1. Egg- og plasmidpreparat Egg forberedelseFå ferske befruktede kyllingegg (Gallus gallus) fra South China Agricultural University og oppbevar ved 16 ° C før inkubasjon. For optimal levedyktighet, sett alle egg til inkubasjon innen en uke etter ankomst. Legg egg horisontalt og rug ve…

Representative Results

Ved å utføre i ovo-elektroporering på forskjellige steder og på forskjellige utviklingsstadier, oppnådde vi selektiv FMRP-knockdown enten i den hørbare periferien eller i den auditive hjernestammen. FMRP knockdown i NMLiten hårnål RNA (shRNA) mot kyllingen Fmr1 ble designet og klonet inn i Tet-On vektorsystemet som beskrevet tidligere20. Oppsettet for in ovo elektroporering er vist i figur 1A</…

Discussion

For å bestemme den celle-autonome funksjonen til FMRP, er det nødvendig å manipulere uttrykket i individuelle cellegrupper eller celletyper. Siden en av hovedfunksjonene til FMRP er å regulere synaptisk formasjon og plastisitet, er selektiv manipulering av hver synaptisk komponent i en bestemt krets en forutsetning for en full forståelse av FMRP-mekanismen i synaptisk kommunikasjon. Ved hjelp av ovo-elektroporering av kyllingembryoer demonstrerte vi en metode for å målret…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av: et National Natural Science Foundation of China-stipend (nr. 32000697); vitenskaps- og teknologiprogrammet i Guangzhou (202102080139); Guangdong naturvitenskapelige stiftelse (2019A1515110625, 2021A1515010619); de grunnleggende forskningsfondene for de sentrale universitetene (11620324); et forskningsstipend fra Key Laboratory of Regenerative Medicine, Utdanningsdepartementet, Jinan University (nr. ZSYXM202107); de grunnleggende forskningsfondene for de sentrale universitetene i Kina (21621054); og Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen i Kina (20191118142729581). Vi takker det medisinske eksperimentelle senteret ved Jinan University. Vi takker Dr. Terra Bradley for nøye redigering av manuskriptet.

Materials

Egg incubation
16 °C refrigerator MAGAT Used for fertilized egg storage.
Egg incubator SHANGHAI BOXUN GZX-9240MBE
Fertilized eggs Farm of South China Agricultural University Eggs must be used in one week for optimal viability.
Plasmid preparation
Centrifuge Sigma 10016
Fast green Solarbio G1661 Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.
Plasmid Maxi-prep kit QIAGEN 12162 Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889 Make 7.5M working solution in nuclase-free water.
Electroporation and Doxycycline Administration
Electroporator BTX ECM399
1 mL / 5 mL Syringe GUANGZHOU KANGFULAI
Dissecting microscope CNOPTEC SZM-42
Doxcycline Sigma-Aldrich D9891 Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C.
Glass capillary BEIBOBOMEI RD0910 0.9-1.1 mm*100 mm
Laboratory parafilm PARAFILM PM996 transparent film
Pipette puller CHENGDU INSTRUMENT FACTORY WD-2 Pulling condition: 500 °C for 15 s
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Platinum elctrodes Home made 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.
Rubber tube Sigma-Aldrich A5177
Tissue Dissection and Fixation
Forceps RWD F11020-11 Tip size: 0.05*0.01 mm
Other surgery tools RWD
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week.
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW 01673921 For black background plates, food-grade carbon powder is applied.
Sectioning
Cryostat LEICA CM1850
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 From bovine skin.
Sliding microtome LEICA SM2010
Immunostaining
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse Abcam ab150113 1:500 dilution, RRID: AB_2576208
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit Abcam ab150078 1:500 dilution, RRID: AB_2722519
DAPI Abcam ab285390 1: 1000 dilution
Fluoromount-G mounting medium Southern Biotech Sb-0100-01
FMRP antibody Y. Wang, Florida State University #8263 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242
Islet-1 antibody DSHB 39.3F7 1:100 dilution, RRID: AB_1157901
Netwell plate Corning 3478
Neurofilament antibody Sigma-Aldrich N4142 1:1000 dilution, RRID: AB_477272
Parvalbumin antibody Sigma-Aldrich P3088 1:10000 dilution, RRID: AB_477329
SNAP25 antibody Abcam ab66066 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052
Imaging
Adobe photoshop ADOBE image editing software
Confocal microscope LEICA SP8
Fluorescent stereomicroscope OLYMPUS MVX10
Olympus Image-Pro Plus 7.0 OlYMPUS commercial image processing software package

References

  1. Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
  2. Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
  3. Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
  4. Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
  5. Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
  6. Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
  7. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  8. Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
  9. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  10. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  11. Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
  12. Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
  13. Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
  14. Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
  15. Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
  16. Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
  17. Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
  18. Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
  19. Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
  20. Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
  21. Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
  22. Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
  23. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
  24. Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
  25. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  26. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
  27. Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
  28. Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  29. Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
  30. Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
  31. Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
  32. Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
  33. Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
  34. Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
  35. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
  36. Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).

Play Video

Cite This Article
Fan, Q., Zhang, X., Wang, Y., Wang, X. Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation. J. Vis. Exp. (185), e64187, doi:10.3791/64187 (2022).

View Video