Summary
Klassisk har endokardiet til musens embryonale ventil primordium blitt analysert ved hjelp av transversale, koronale eller sagittale seksjoner. Vår nye tilnærming til en ansikt, todimensjonal avbildning av endokardiet ved valvulogene regioner tillater plan polaritet og celleomorganiseringsanalyse av endokardiet under ventilutvikling.
Abstract
Studien av de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for utviklingen av pattedyrhjertet, er viktig for å håndtere menneskelig medfødt hjertesykdom. Utviklingen av de primitive hjerteklaffene innebærer epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) av endokardiale celler fra atrioventrikulærkanalen (AVC) og utstrømningskanalen (OFT) i hjertet som respons på lokale induktive myokard- og endokardiale signaler. Når cellene delaminerer og invaderer den ekstracellulære matrisen (hjertegelé) som ligger mellom endokardiet og myokardiet, dannes de primitive endokardputene (EC). Denne prosessen innebærer at endokardiet må fylle hullene som er igjen av de delaminerte cellene og må omorganisere seg for å konvergere (smale) eller forlenge (forlenge) langs en akse. Nåværende forskning har implisert den plane cellepolaritetsveien (PCP) for å regulere den subcellulære lokaliseringen av faktorene som er involvert i denne prosessen. Klassisk har de innledende fasene av hjerteventilutvikling blitt studert i tverrsnitt av embryonale hjerter eller i ex vivo AVC eller OFT-eksplanter dyrket på kollagengeler. Disse tilnærmingene tillater analyse av apico-basal polaritet, men tillater ikke analyse av celleadferd i epitelets plan eller av de morfologiske endringene i migrerende celler. Her viser vi en eksperimentell tilnærming som tillater visualisering av endokardiet ved valvulogene regioner som et planfelt av celler. Denne eksperimentelle tilnærmingen gir mulighet til å studere PCP, plan topologi og intercellulær kommunikasjon innenfor endokardiet til OFT og AVC under ventilutvikling. Dechiffrering av nye cellulære mekanismer involvert i hjerteklaffmorfogenese kan bidra til å forstå medfødt hjertesykdom assosiert med endokardputedefekter.
Introduction
Hjertet er det første funksjonelle organet til et pattedyrembryo. Rundt embryonale dag (E) 7,5 hos mus danner bilaterale prekardiale mesodermceller hjertets halvmåne i ventralsiden1. Hjertets halvmåne inneholder to populasjoner av prekardiale celler som inkluderer forfedre til myokardiet og endokardiet2. Rundt E8.0 smelter hjerteforløperne i midtlinjen og danner det primitive hjerterøret som består av to epitelvev, det ytre myokardiet og det indre endokardiet, som er et spesialisert endotel adskilt av en ekstracellulær matrise kalt hjertegelé. Senere, ved E8.5, gjennomgår hjerterøret høyre sløyfe. Det sløyfede hjertet har forskjellige anatomiske regioner med spesifikke molekylære signaturer som utstrømningskanalen (OFT), ventriklene og atrio-ventrikulærkanalen (AVC)3. Selv om hjerterøret i utgangspunktet utvides ved innstrømningssiden gjennom tilsetning av celler4, ved E9.5, resulterer intensiv hjerteproliferasjon i ballongdannelse av kamrene og etablering av trabekulært nettverk5. Ventildannelse foregår i AVC (fremtidige mitral- og trikuspidalklaffer) og i OFT (fremtidige aorta- og lungeventiler).
Endokardiet spiller avgjørende roller i ventilutvikling. Endokardiale celler gjennomgår epitel-mesenkymal overgang (EMT) i AVC og OFT for å danne endokardiale puter, en struktur som fremkommer ved begynnelsen av ventilutviklingen. Ulike signalveier aktiverer denne prosessen; ved E9.5 hos mus fremmer NOTCH aktivert i endokardiet som respons på myokardavledet BMP2 invasiv EMT av endokardiale celler i AVC- og OFT-regionene gjennom aktivering av TGFβ2 og SNAIL (SNAI1), som direkte undertrykker uttrykket av vaskulær endotelkaderin (VE-cadherin), en transmembrankomponent av adherens junctions (AJs)6,7,8 . I OFT er aktivering av endokardiet for å initiere EMT mediert av FGF8 og BMP4, hvis uttrykk aktiveres av NOTCH 9,10,11,12.
Progresjon av EMT innebærer cellulær dynamikk som celler endrer form, bryter og remake kryss med sine naboer, delamin, og begynner å migrere13. Disse endringene inkluderer AJ-ombygging og gradvis demontering av 14,15, lineær cellepolaritet (PCP) signalering, tap av apico-basal polaritet (ABP), apikal innsnevring og cytoskeletal organisasjon 16,17. ABP refererer til fordelingen av proteiner langs den fremre-bakre aksen til en celle. I utviklingshjertet er ABP-regulering i kardiomyocytter nødvendig for ventrikulær utvikling18. PCP refererer til en polarisert fordeling av proteiner i celler over vevets plan og regulerer cellulær distribusjon; Epithelia med stabil geometri består av sekskantformede celler, hvor bare tre celler konvergerer ved hjørnene 19,20,21,22. Ulike cellulære prosesser, for eksempel celledeling, naboutveksling eller delaminering som forekommer under epitelmorfogenese, produserer en økning i antall celler som konvergerer på et toppunkt og antall naboceller som en gitt celle har22. Disse cellulære atferdene relatert til PCP kan reguleres av forskjellige signalveier, aktindynamikk eller intracellulær handel23.
Dataene som genereres som studerer ventilutvikling hos mus, er hentet fra transversale, koronale eller sagittale seksjoner av E8.5 og E9.5 embryonale hjerter, hvor endokardiet er vist som en cellelinje i stedet for som et felt av celler - endokardiet dekker hele den indre overflaten av hjerterøret24. Embryonale seksjoner tillater ikke analyse av PCP i endokardiet til museembryoer. Vår nye eksperimentelle metode tillater analyse av endokardial cellefordeling, AJ-anisotropi og enkeltcelleformanalyse, som vist i de representative resultatene. Denne typen data er nødvendig for PCP-analyse, sammen med beskrivelsen av andre molekyler relatert til PCP, som ikke er vist i denne rapporten. Helmontert immunfluorescens, spesifikk prøvepreparering og bruk av genmodifiserte mus muliggjør plan polaritetsanalyse i endokardiet ved starten av ventilutvikling hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier ble godkjent av Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Animal Experimentation Ethics Committee og av Madrid-regionen (ref. PROEX 155.7/20). Alle dyreprosedyrer i samsvar med EU-direktiv 2010/63EU og anbefaling 2007/526/EF om beskyttelse av dyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål, vedtatt i spansk lov under Real Decreto 1201/2005.
1. Obtention av AVC og / eller OFTs (tilpasset fra Xiao et al. 25)
- Sett opp kryss på ettermiddagen mellom kvinnelig mTmG og mannlig VE-Cadherin-Cre-ERT/+.
- Neste morgen, sjekk for en vaginal plugg. Hvis det er en vaginal plugg, telle det som en halv dag (E0.5). Avhengig av eksperimentet av interesse, teller 8 dager eller 9 dager.
- 24 timer før disseksjon, gavage den gravide kvinnen oralt med 50 μL 5 mg / ml 4-OH-Tamoxifen fortynnet i maisolje.
MERK: Denne dosen vil indusere en begrenset mengde CRE-mediert rekombinasjon avslørt av tilstedeværelsen av GFP-positive kloner. Den passende dosen må bestemmes med hver ny batch av 4-OH-Tamoxifen. - Ofre den gravide kvinnen ved E8.5 eller E9.5 ved cervikal dislokasjon.
- Åpne magen til de gravide musene ved å bruke saks og fjern livmoren som inneholder embryoene ved hjelp av saks og fine tang.
- Plasser livmoren i en petriskål som inneholder iskald 1x fosfatbufret saltvann (PBS) med 0,1% Tween-20 (PBT).
- Fjern den enkelte deciduae fra livmoren under et dissekeringsmikroskop og bruk fine tang.
- Bruk fin pinsett, gjør et snitt i den hvite delen av deciduaen, som er der embryoet er, fjern det forsiktig, unngå å trekke, og overfør embryoene til en ny petriskål med fersk PBT ved hjelp av en P1000 med spissen avskåret, og la en diameter stor nok til at et embryo kan passere uten å bryte.
- For genotyping, ta et lite stykke eggeplomme sac (0,5 mm2) eller et stykke av halen (fra den bakre enden, teller 5 til 10 somitter mot hodet) og fordøye det i 100 μL passende buffer.
- Under avtrekksviften overføres embryoene til iskaldt 4 % paraformaldehyd (4 % PFA) i sterilfiltrert PBS i et mikrosentrifugerør (2 ml) ved 4 °C. Fest embryoene fra 2 timer til over natten (O / N) ved 4 ° C på en nutator.
- Under avtrekkshetten, fjern 4% PFA-fiksativet fra mikrosentrifugerørene uten å berøre embryoene. Kast PFA i en egnet beholder.
- Vask embryoene 5x i kald PBT i 10 minutter hver ved romtemperatur (RT).
- Bruk fine tang, fjern hjertet og overfør det til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør med fersk PBT.
2. Hele fjellet immunfluorescens av musens embryonale hjerte
- Erstatt PBT med PBSTr (0,4% Triton X-100 i PBS) og vask prøvene 3x, 5 min hver, ved RT på en orbital shaker.
- Erstatt PBSTr med blokkerende løsning (PBSTr med 10% varmeinaktivert bovint serum). Inkuber fra 2 timer til O/N ved 4 °C på en orbital shaker.
- Erstatt blokkeringsløsningen med blokkeringsoppløsning som inneholder primært antistoff ved ønsket konsentrasjon (for anti-GFP eller anti-VE-Cadherin antistoff, bruk 1: 1000 fortynning). Inkuber O/N på en orbital shaker ved 4 °C.
- Etter O/N-inkubasjon ved 4 °C, inkuber i 1,5 timer ved RT på en orbital shaker. Dette trinnet er svært viktig for å øke signal-til-støy-forholdet.
- Fjern og hold den primære antistoffløsningen ved 4 °C i opptil tre fremtidige eksperimenter (tilsett natriumazid til en endelig konsentrasjon på 0,02 % for best mulig bevaring).
- Vask embryoene 3x med PBSTr i 3 minutter hver.
- Vask embryoene med PBSTr 3x i 30 minutter hver på en orbital shaker ved 4 °C.
- Etter siste vask, tilsett 1 ml blokkeringsoppløsning inneholdende 1:1000 fluorescenskonjugert sekundært antistoff mot de primære antistoffvertsartene. Tilsett også 1:3000 DAPI til løsningen og inkuber embryoene O/N på en orbital shaker ved 4 °C.
- Etter O/N-inkubasjon ved 4 °C, inkuber i 1,5 timer ved RT på en orbital shaker. Dette trinnet er svært viktig for å øke signal-til-støy-forholdet.
- Vask embryoene 3x med PBSTr i 3 minutter hver.
- Vask embryoene med PBSTr 3x-5x i 30 minutter hver på en orbital shaker ved RT.
3. Montering av musens embryonale AVC eller OFT-er
- Legg hjertene på en petriskål (35 mm) som inneholder PBS.
- Bruk en wolframtråd og fine tang, isoler AVC eller OFT, og kutt dem i lengderetningen26.
- Forbered deksler (22 mm x 22 mm), lysbilder (60 mm x 24 mm), tang, en P200-pipette med passende spisser, papirhåndkle og eventuelle vandige glyserolbaserte monteringsmedier for fluorescens, uten DAPI.
- Ved å bruke en lignende tilnærming som i Xiao, C. et al.25, hold to striper tape på et lysbilde, atskilt med 0,3-0,6 cm for å skape et 3D-romrom som gjør at prøvene kan bevare den opprinnelige formen uten å klemme dem.
- Forsiktig, og bruk minimumsvolumet av buffer, slipp prøvene på lysbildet mellom båndstripene ved hjelp av en kuttet P200-spisspipette. Bruk et dissekeringsmikroskop for å øke nøyaktigheten.
- Bruk fine tang, plasser prøvene med endokardiet vendt opp (myokard ned på lysbildet).
- Fjern overflødig PBS med et papirhåndkle (unngå å berøre prøven), og tørk deretter prøvene i 1-2 minutter ved RT for å få prøvene til å feste seg til lysbildet.
- Tilsett 40 μL vandige monteringsmedier på vevet.
- Plasser dekselet over de to tapestykkene og senk det sakte ned på vevet med en nål eller tang. Unngå å skape luftbobler.
- Forsegl dekselet med en dråpe neglelakk på hvert toppunkt på dekselet.
- Når neglelakken er tørr, rengjør du overflødig monteringsmedium fra sidene av dekselet ved å bruke et absorberende papirhåndkle. Unngå å flytte dekselet.
- Tilsett neglelakk langs kantene på dekselet for å forsegle den helt, og forhindre fordampning av monteringsmedier.
- Bruk et oppreist eller et omvendt konfokalt mikroskop, ta bilder på 10x for generell visning og ved 63x med 3x zoom for detaljerte bilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dataene som genereres ved hjelp av denne protokollen viser at det er mulig å utføre en ansiktsavbildning av endokardiet til AVC. Det første målet var å analysere endokardets celleform under dannelsen av ventilene med en cellulær oppløsning (figur 1). For å synliggjøre individuelle endokardceller ved E9.5 brukte vi to transgene musestammer. (1) ROSA mT / mG er et tofarget fluorescerende Cre reporter allel (tdTomato / mT og EGFP / mG) hvis fluorescens oppdages ved cellemembranen. Uten Cre-mediert aktivering uttrykker transgenet tdTomato (mT). Ved Cre-mediert aktivering erstattes tdTomato-uttrykk med EGFP-fluorescensuttrykk (mG) i spesifikke celler og klonale derivater27. (2) Cdh5CreERT2/+-muselinjen uttrykker tamoksifeninduserbar CRE-rekombinase (CreERT2) under regulering av vaskulær endotelial cadherinpromotor (Cdh5), som uttrykkes i det vaskulære endotelet og endokardiet i embryonale stadier28. Vi krysset en mann og en kvinne av hver genotype for å oppnå embryoer som bærer de to transgenene for å aktivere uttrykket av GFP i individuelle celler i endokardiet. For å oppnå dette inokulerte vi lave doser av tamoxifen for å aktivere CRE-uttrykk i et redusert antall celler. Som et resultat uttrykte enkeltceller, eller kloner av få celler, GFP i endokardiet (figur 1A). GFP-uttrykk (figur 1A, B) i kombinasjon med VE-Cadherin subcellulær lokalisering (figur 1C) er en effektiv tilnærming for å studere forholdet mellom AJ-dynamikk og filopodidannelse i pre-EMT-celler siden disse cellene utvikler membranfremspring når AJs oppløses29. PCP-signaler kan gi anisotropisk kontraktilitet på AJs, og produserer cellulære krefter som fremmer polarisert morfogenese i epithelia30. Vi fant forskjeller i intensiteten av VE-Cadherin-farging i endokardiet (figur 2), noe som indikerer at vi ikke kan forkaste anisotrop kontraktilitet i det embryonale endokardiet til AVC i prevalvulære stadier.
Det andre målet var å analysere endokardets plane topologi under ventilutvikling (figur 2). For å definere antall celler som konvergerer i et enkelt toppunkt, farget vi hele hjertet med VE-Cadherin-antistoff ved E8.5 og E9.5 (figur 2A, B). Andre molekyler lokalisert ved cellecellekontakter i endokardialcellen vil også være nyttige for det formålet (f.eks. β-Catenin). Ved E8.5 har endokardiet til AVC en tendens til å ha en stabil epitelorganisasjon, og vi kunne ikke oppdage hjørner dannet av mer enn fire celler (figur 2A, C). Senere på E9.5 fant vi hjørner som består av opptil seks celler som danner rosettlignende strukturer (figur 2B, D), lik den cellulære organisasjonen som tidligere er beskrevet i epitel som gjennomgår aktive celleomorganiseringer31, noe som tyder på at AVC-endokardiet gjennomgår aktiv cellulær omorganisering under ventilutvikling.
Figur 1: Enkeltcelleformanalyse i prevalvulært endokardium. (A) AVC fra E9.5 museembryo åpnet i lengderetningen og viste spredte GFP-positive celler. (B) GFP-uttrykk i enkeltceller definerer celleform ved cellulær oppløsning. (C) Helmontert farging av VE-Cadherin fremhever AJs. Filopodia genereres i domener i cellen som ikke lokaliserer VE-Cadherin (lilla piler), og omvendt lokaliserer VE-Cadherin i domener av cellen som er glatte og ikke danner filopodia (blå pilspisser). v, ventral; d, dorsal. Skala bar i A er 100 μm; i B og C er 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Planartopologi og anisotropi av plane lokaliserte proteiner kan defineres i en-face bilder av endokard ved AV-kanalen . VE-Cadherin er lokalisert ved cellecellekontaktene til endokardiet. (A) E8.5 og (B) E9.5 AVC fra embryoer ble åpnet i lengderetningen. Forstørrelser i (C) og (D) tillot oss å observere antall celler som konvergerer i et toppunkt. I tillegg kan vi skille forskjellige intensiteter i VE-Cadherin-fargingen, noe som indikerer at plasseringen i AVC er anisotropisk. Skala bar i A og B er 100 μm; i C og D er 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endokardiet er et epitelial monolag som dekker hele den indre overflaten av det embryonale hjerterøret. Under ventilutvikling gjennomgår endokardiale celler ved de potensielle valvulære områdene EMT, og dermed transformerer endokardceller og omorganiserer cytoskelettet til delaminering fra endokardiet mot hjertegeléen. Vi og andre har innhentet relevante data om ventilutvikling i museembryoer ved å analysere tverrgående seksjoner av E8.5 og E9.5 embryonale hjerter, hvor endokardiet er vist som en rad med celler 6,8,24,32. Denne tilnærmingen tillot analyse av uttrykket av signalveier og andre molekyler involvert i ventilutvikling, men det var ikke mulig å analysere romlige aspekter av pre-valvulært endokardium.
AVC- eller OFT-eksplanter ble hovedsakelig brukt til å studere transformerende EC på en 3D kollagengel. Eksplanter er nyttige for EMT-kvantifisering, analyse av transformasjonskapasitet eller testing av narkotika etter få dager i kultur 6,7,11,33. Disse ex vivo-eksperimentene tillater også utvidelse av endokardiet på toppen av kollagengelen som et monolag, men miljøforholdene der ex vivo hjerteeksplanter dyrkes, er forskjellige fra i utero-forhold. For eksempel er ensrettet blodstrøm avgjørende for riktig ventilutvikling34,35 og oppnås bare i in utero, ikke i ex vivo, eksplanter.
Denne nye tilnærmingen tillater oss å observere det intakte valvulære endokardiet en face under starten av ventilutviklingen uten miljømanipulering. Det tillater analyse av den cellulære fordelingen av valvulært endokardium, samt enkeltcelleformanalyse før og under EMT i in utero-forhold . Vi kan også observere og analysere intensiteten og organiseringen av cellekontaktene og den subcellulære fordelingen av relevante molekyler under EMT. Denne teknikken gir også mulighet for å analysere subcellulære strukturer i endokardiet, aktivering av signalveier ved bruk av reportergener, effekten som geninaktivering kan ha på cellulær oppførsel, og hvordan det kan påvirke nærliggende celler av villtype.
For å oppnå prøver av høy kvalitet er det viktig å være veldig forsiktig når du håndterer dem, siden urenheter (f.eks. Mikrofibre) som fester seg til vevet kan føre til artefakter under opptak av bilder. I tillegg, da de er svært små prøver, er risikoen for å bryte høy, så man må vaske vevet (trinn 1. og trinn 2.) i langsomme shakere. Under bytte av medier med pipetter anbefaler vi å kutte av spissen for å forhindre at vevet kollapser når det passerer gjennom spissen i tilfelle det absorberes ved et uhell. For å bli ekspert på denne teknikken er det nødvendig med en læringskurve, som vil være lengre eller kortere avhengig av forskerens tidligere erfaring med mikromanipulering.
Å velge riktig fikseringsmiddel og fikseringstid kan være viktig ved bruk av transgener som uttrykker fluorescerende proteiner. Den anatomiske strukturen påvirkes ikke av forskjellige fikseringsmidler som etanol 70%, metanol, PFA 4% eller formalin 10%.
For motfarging av kjerner anbefaler vi inkubering av prøver med DAPI fordi penetrasjon er mye mer effektivt enn å bruke monteringsmedier med DAPI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd PID2019-104776RB-I00 og CB16/11/00399 (CIBER CV) fra MCIN/AEI/10.13039/501100011033 til J. L. P. J.G.-B. ble finansiert av Programa de Atracción de Talento fra Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. ble finansiert av Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Vi takker CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, delfinansiert av MCIN/AEI /10.13039/501100011033 og FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Vi takker også A. Galicia og L. Méndez for musehold. Kostnaden for denne publikasjonen ble delvis støttet av midler fra Det europeiske regionale utviklingsfondet. CNIC støttes av ISCIII, MCIN og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (stipend CEX2020-001041-S) finansiert av MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
- Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
- Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
- Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
- Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
- Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
- MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
- de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
- Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
- Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
- Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
- Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
- Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
- Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
- Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
- Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
- Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
- Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
- Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
- Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
- Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
- Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
- Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
- Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).
