Summary
ATAC-seqは、多動変異トランスポザーゼTn5を使用して、転写因子によって媒介されるクロマチンアクセシビリティの変化をマッピングするDNAシーケンシング法です。ATAC-seqは、がん細胞の表現型変化の根底にある分子メカニズムの発見を可能にします。このプロトコルは、がん細胞を含む上皮細胞タイプにおけるATAC-seqの最適化手順の概要を示しています。
Abstract
ハイスループットシーケンシング(ATAC-seq)プローブを用いたトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイは、高活性Tn5トランスポザーゼを用いたデオキシリボ核酸(DNA)アクセシビリティです。Tn5は、アダプターを切断およびライゲーションして、アクセス可能なクロマチン領域内でのハイスループットシーケンシングを実現します。真核細胞では、ゲノムDNAは、DNA、ヒストン、およびその他のタンパク質の複合体であるクロマチンにパッケージ化されており、転写機構に対する物理的な障壁として機能します。外因性シグナルに応答して、転写因子はクロマチンリモデリング複合体を動員し、遺伝子活性化のための転写機構へのアクセスを可能にします。したがって、オープンクロマチン領域の同定は、癌の進行などの生物学的事象中のエンハンサーおよび遺伝子プロモーター活性をモニタリングする場合に有用である。このプロトコルは使いやすく、細胞投入要件が低いため、ATAC-seqは、がん細胞を含むさまざまな細胞タイプのオープンクロマチン領域を定義するために広く採用されています。データ集録を成功させるには、ATAC-seqライブラリを準備する際にいくつかのパラメータを考慮する必要があります。その中で、細胞溶解バッファーの選択、Tn5酵素の滴定、および細胞の開始量は、癌細胞におけるATAC-seqライブラリ調製にとって非常に重要です。高品質のデータを生成するには、最適化が不可欠です。ここでは、上皮細胞型に対するATAC-seq最適化法について詳細に説明する。
Introduction
クロマチンアクセシビリティは、ゲノムワイドスケールでの遺伝子発現調節の重要な要件です1。クロマチンアクセシビリティの変化は、癌を含むいくつかの病状と頻繁に関連しています2,3,4。長年にわたり、研究者がクロマチンアクセシビリティの領域をマッピングすることによってクロマチンランドスケープを調査できるようにするために、多くの技術が開発されてきました。その中には、DNase-seq(DNase I過敏性部位シーケンシング)5、FAIRE-seq(ホルムアルデヒドによる調節要素の単離)6、MAPit(個々のテンプレートに対するメチルトランスフェラーゼアクセシビリティプロトコル)7、および本論文の焦点であるATAC-seq(トランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ)8などがあります。DNase-seqは、DNaseの重要な特徴、すなわちヒストンや転写因子5などの他のタンパク質を含まない裸のDNAを優先的に消化することを利用して、アクセス可能な領域をマッピングします。FAIRE-seqは、ChIP-seqと同様に、免疫沈降が関与しないことを除いて、ホルムアルデヒド架橋および超音波処理を利用し、ヌクレオソームを含まない領域はフェノール-クロロホルム抽出によって単離されます6。MAPitメソッドは、GCメチルトランスフェラーゼを使用して、単一分子分解能でクロマチン構造をプローブします7。ATAC-seqは、活性亢進トランスポザーゼTn58に依存しています。Tn5トランスポザーゼは、開いたクロマチン領域に優先的に結合し、シーケンシングアダプターをアクセス可能な領域に挿入します。Tn5は、DNAを介した「カットアンドペースト」メカニズムを介して動作し、アダプターをプリロードしたトランスポザーゼが開いたクロマチン部位に結合し、DNAを切断し、アダプターをライゲーションします8。Tn5結合領域は、これらのアダプターにアニールするプライマーを用いたPCR増幅によって回収される。FAIRE-seqおよびDNase-seqは、大量の出発物質(~100,000細胞から225,000細胞)と、シーケンシング9の前に別のライブラリ調製ステップを必要とします。一方、ATAC-seqプロトコルは比較的単純で、必要な細胞数(<50,000セル)10です。FAIRE-seqおよびDNase-seq技術とは異なり、単離されたDNAサンプルはすでにTn5によってシーケンシングアダプターでタグ付けされているため、ATAC-seqのシーケンシングライブラリ調製は比較的簡単です。したがって、ライブラリ調製を完了するために適切なプライマーによるPCR増幅ステップのみが必要であり、エンドリペアおよびアダプターライゲーションなどの事前処理ステップを実行する必要はなく、したがって時間を節約する11。第二に、ATAC-seqは、MAPit7に必要な領域特異的プライマーによるバイサルファイト変換、クローニング、および増幅の必要性を回避します。これらの利点により、ATAC-seqはオープンクロマチン領域を定義するための非常に一般的な方法になりました。ATAC-seq法は単純ですが、高品質で再現性のあるデータを得るためには、複数のステップを最適化する必要があります。この原稿では、標準的なATAC-seqライブラリ調製の最適化手順について説明し、特に(1)溶解バッファー組成、(2)Tn5トランスポザーゼ濃度、および(3)細胞数の3つのパラメーターを強調しています。さらに、この論文では、癌性および非癌性の付着上皮細胞の両方を使用した最適化条件からのサンプルデータを提供します。
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Protocol
1.実験開始前の準備
- 溶解バッファーストックを調製します。
注:最適な核分離バッファーは、細胞タイプごとに異なる場合があります。原著論文8で使用した低張バッファーとCSKバッファー12,13の両方を、トリパンブルー染色を使用して各細胞タイプについてテストすることをお勧めします。- 低張緩衝液(グリーンリーフ緩衝液)を調製するには、10 mM トリス塩酸塩 pH 7.4、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、および0.1% NP-40を混合します。
- CSKバッファーを調製するには、10 mM パイプpH 6.8、100 mM NaCl、300 mM スクロース、3 mM MgCl2、および0.1% Triton X-100を混合します。
- 細胞培養条件が最適であることを確認してください。光学顕微鏡で細胞を調べて、アポトーシスのレベルが上昇していないことを確認します。
- 遠心分離機の電源を入れて4°Cにします。
2.細胞収穫
- 細胞の培養物から培地を<80%のコンフルエントで吸引します。細胞は通常、必要な細胞数、処理などに基づいて、35mmまたは60mmのディッシュで増殖します。
- 細胞を1 mLまたは3 mLのPBSで洗浄します。
- 0.5 mLまたは1 mLのトリプシンを加え、2〜3分間インキュベートします(細胞の種類によって異なります)。1 mLピペットを慎重に使用してよく混ぜます。
- 1 mLまたは2 mLの培地をプレートに加え、よく混ぜます。15 mLのコニカルチューブに移します。細胞を15 mLチューブで300 x gで3分間遠心分離します 。
注意: セルの損失を最小限に抑えるために、スイングバケットローターをお勧めします。 - 培地を吸引し、細胞を1 mLまたは2 mLの培地に再懸濁します。
注:均質なシングルセル溶液を調製することが重要です。組織の場合、Dounceホモジナイザーを使用して組織を均質化し、大きな細胞の塊や凝集体を最小限に抑えることができます。一部の組織では、生細胞を単離して単一細胞溶液を得るために、ろ過(セルストレーナーなど)および/またはFACSセルソーティングが必要です。 - セルカウンターを使用してセルをカウントします。
注:この研究では、自動セルカウンター(材料表)を使用しました。 - 必要な細胞量(例えば、細胞数に基づいて1 x 106 細胞を含む体積)を300 x g で室温(RT)で3分間遠心分離します。
- 1 x 106 細胞を含む細胞ペレットを1 mLのコールドPBSに再懸濁します。
注:細胞数が1 x 10 6細胞未満の場合は、冷たいPBS容量を減らして、同じ濃度(1 x 106細胞/ mL)で細胞溶液を調製します。
3.細胞溶解
- 25 μL(= 2.5 x 104 細胞)を新しい1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。4°Cで500 x g で5分間遠心分離し、上清を注意深く廃棄します
注意: セルの損失を最小限に抑えるために、スイングバケットローターをお勧めします。細胞が廃棄されないように、約3μLの上清を残します。 - 25 μLの溶解バッファーを加え、穏やかに上下にピペッティングして細胞を再懸濁します。氷上で5分間インキュベートする
- 4°Cで500 x g で5分間遠心分離し、上清を注意深く廃棄します。
注意: セルの損失を最小限に抑えるために、スイングバケットローターをお勧めします。細胞が廃棄されないように、約3μLの上清を残します。
4. Tn5 タグメンテーション
- 直ちにペレットを25 μLのTn5反応混合物に再懸濁します。Tn5反応混合物は以下の通りである:12.5 μLの2xタグメンテーションDNAバッファー(TDバッファー)、1.25-5 μLのTn5トランスポザーゼ、および11.25-7.5 μLのヌクレアーゼフリー水。
注:Tn5の標準濃度は、2.5 x 104 細胞で2.5μLです。 - 37°Cで30分間インキュベートします。
注意: 10分ごとに溶液を混合します。
5. DNA精製
注:増幅する前に精製が必要です。DNA精製は、MinElute PCR精製キット(材料表)を使用して行われます。
- 5 μLの3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)を加える。
- 直ちに125 μLのバッファーPBを加え、よく混合します。
- ステップ2から始まるPCR精製キットのプロトコルに従ってください。
- スピンカラムを2 mLの収集チューブに入れます。
- サンプルをスピンカラムに適用し、RTで17,900 x g で1分間遠心分離します。
- フロースルーを破棄し、スピンカラムを同じ収集チューブに戻します。
- 750 μLのバッファーPEをスピンカラムに加え、RTで17,900 x g で1分間遠心分離します。
- フロースルーを破棄し、スピンカラムを同じ収集チューブに戻します。
- スピンカラムを5分間遠心分離して、メンブレンを完全に乾燥させます。
- フロースルーを破棄し、スピンカラムを新しい1.7 mLマイクロ遠心チューブに入れます。
- 10 μLのバッファーEBでDNA断片を溶出します。
- カラムをRTで1分間放置します。
- RTで17,900 x g で1分間遠心分離し、DNAを溶出します。
6. PCR増幅
注:配列決定には、転置(タグ付き)DNAのPCR増幅が必要です。この例では、Nexteraキットアダプター(材料表)を使用しました。本研究で用いたプライマーを 表1に列挙する。
- 200 μL PCRチューブ(各サンプルにつき50 μL)で以下のPCR反応をセットアップします。PCR反応混合物は以下の通りである:溶出したDNA10 μL(ステップ5)、2.5 μLの25 mMアダプター1、2.5 μLの25 mMアダプター2、25 μLの2x PCRマスターミックス、および10 μLのヌクレアーゼフリー水
- PCR増幅プログラムパート1を実行します(表2)。
注:初期増幅では、標準のサーマルサイクラーを使用するすべてのサンプルに同じ条件が使用されます。 - リアルタイム qPCR (サンプルあたり合計 14.5 μL)
- PCR増幅パート1からの5 μLの生成物(ステップ6.2)を使用して、今度はSYBR金を含む以下の反応を設定し、リアルタイムPCRマシンで検出します。
- ステップ6.2のPCR産物5 μL、SYBR金0.75 μL(希釈1000倍)、2倍PCRマスターミックス5 μL、ヌクレアーゼフリー水3.75 μLのPCR反応混合物を調製します。
注:各サンプルの飽和に達する前のライブラリ増幅の正確なサイクル数は、PCR10のGCおよびサイズバイアスを低減するためにqPCR(表3)によって決定されます。SYBR金をヌクレアーゼフリー水で希釈した。希釈液を作るために、1 μLのSYBR Gold(ストック濃度10,000倍)を999 μLのヌクレアーゼフリー水に加えました。表3に記載されているRT-qPCRの実行時間は約60分です。
- ステップ 6.3 の実行パラメーターを使用して、必要な追加 PCR サイクル数を決定します。
- サイクル数 = 1/4 最大(飽和)蛍光強度(通常 3 または 4 PCR サイクル)
- PCR増幅プログラムパート2(容量= 45 μL; 表 4): サイクル番号を決定したら、手順 6.4.1 で計算された追加のサイクルを使用して PCR を設定します。たとえば、計算されたサイクル数が3の場合、以下のプログラムで3サイクルを設定します。合計サイクルは 8 (手順 6.2 では 5 回、手順 6.5 ではさらに 3 回) になります。
7.ビーズ精製
注:ここでは、AMPure XP(材料表)ビーズを使用しました。
- 前のステップで増幅したPCR産物に、RTで150 μLのビーズを加えます。
注:このプロセスでは、自家製のAMPureビーズ14 を使用できます。 - RTで15分間インキュベートします。
- チューブを磁気スタンドに5分間置きます。
- 上清を慎重に取り除きます。
- ビーズを200μLの80%エタノールで洗浄します。
注:80%エタノールは新鮮に調製する必要があります。 - 手順 7.4 を繰り返します。
- エタノールを完全に除去します。
- サンプルをRTで10分間風乾します。
- 50 μLの溶出バッファー(10 mM Tris-HCL pH 8.0)で再懸濁します。
- ビーズ精製(ステップ7.1.-7.9)を繰り返して、プライマーの汚染をさらに最小限に抑えます。
8. DNA濃度と品質チェック
- 核酸定量キット(材料表)を用いてDNA濃度を測定する。
- SYBR Gold(0.5x TBE、1.5%アガロースゲル)または自動電気泳動システム(TapeStation、バイオアナライザーなど)を使用したゲル電気泳動によって、増幅されたDNA断片を確認します。
9. シーケンシング
- 増幅されたDNAサンプル12、13を用いてハイスループットシーケンシングを行う。
注:増幅されたDNAサンプルは、ハイスループットシーケンシングの準備ができています。ヌクレオソームDNAフラグメント情報を保持するには、シングルエンドシーケンシングよりもペアエンドシーケンシングが推奨されます。DNA断片の両端は、トランスポザーゼが結合する場所を示す。オープンクロマチン領域のマッピングには、通常、サンプルあたり3,000万リードで十分です。
10.データ分析
- 基本通話品質に基づくデータ フィルタリング: 最小平均基本品質スコアを 20 (99% の精度) に設定します。
- アダプターのトリミング: 適切なツールを使用してアダプターのシーケンスを削除します。
注: Trim Galore ラッパー ツール (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) を使用してアダプタ シーケンスを削除しました。イルミナTn5によって調製されたATAC-seqライブラリでは、次の配列がアダプタ配列として使用されます:CTGTCTCTTATACACATCT。アダプターの汚染を認識するための最小シーケンス長は 5 に設定されています。 - ゲノムマッピング:以下のパラメータ「-I 0 -X 2000 -m 1」15を使用して、Bowtieでリードを適切なゲノムにマッピングします。MDA-MB-231基底乳がん細胞からのマッピング品質の例を以下に示します。
少なくとも1つのアライメントが報告された読み取り:52.79%
アライメントに失敗した読み取り数: 13.10%
-m が原因でアライメントが抑制された読み取り: 34.11% - 重複排除:ピカードツール16でPCRの重複をマークします。
- データ可視化用のゲノムカバレッジファイルの生成:重複排除されたペアエンドリードをシングルエンドリードフラグメントに変換します。ゲノムカバレッジトラックは、ベッドツール17からゲノムカバレッジベッドを使用して取得されます。
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Representative Results
ATAC-seqデータを高品質で得るためには、実験条件を最適化することが重要です。ATAC-seqライブラリの調製は、細胞溶解、タグメンテーション(Tn5によるフラグメンテーションとアダプター挿入)、ゲノムDNA精製、PCR増幅、データ解析の5つの主要ステップ(図1)に分けることができます。初期プロセスとして、細胞溶解(核分離)バッファーを最初に各細胞タイプに最適化する必要があります。元のATAC-seq論文8に記載されている低張緩衝液またはCSK緩衝液12,13のいずれかを使用して、乳癌細胞を溶解しました。トリパンブルー染色は、核単離の確認に使用できます18。MDA-MB-231、T47D、MCF7、およびA375細胞などのヒト癌細胞株におけるATAC-seqライブラリ調製のために、CSKバッファーは複数のグループによって使用されています12、13、19、20。CSKバッファーは、胚性幹細胞21、22およびショウジョウバエS2細胞23などの他の細胞型におけるATAC-seqライブラリ調製にも使用されました。溶解バッファーの最適化には、トリパンブルー染色が細胞溶解効率の評価に有用です。NMuMGを、非癌性マウス乳腺上皮細胞、低張緩衝液8(工程1参照)およびCSK緩衝液で処理したところ、CSK処理細胞においてより高い細胞溶解効率が観察された(図2)。凍結組織の場合、Omni-ATACはATAC-seqシグナル24を改善することが示されている。Omni-ATACでは、0.1%NP40、0.1%Tween-20、および0.01%ジギトニンを含むバッファーが細胞溶解に使用されます。ジギトニンベースのバッファーはミトコンドリアDNAの画分を減少させることが知られていますが、CSKバッファーを使用したATAC-seqからのシグナル対ノイズ比およびTSSリードカウントは、乳がん細胞におけるOmni-ATACからのものよりも優れていることが示されました12。したがって、この原稿の残りの部分は、主にCSKバッファーを使用したATAC-seqデータの結果に焦点を当てています。
最良の細胞溶解バッファー(核分離)条件の決定に続いて、入力細胞数とTn5トランスポザーゼ濃度12,25との間の比を最適化することが重要である。典型的には、Tn5濃度は、総容量25 μLの反応混合物中でTn5の容量を1.25 μL、2.5 μLから5 μLまで変化させることによって滴定できます。あるいは、Tn5の定型化反応を最適化するために、Tn5酵素を2.5μLで変化させずに、入力細胞数を変更することができます(例えば、10,000から100,000)。ATAC-seqライブラリの品質とTn5誘導クロマチン消化の効率を評価するために、ライブラリPCR産物をアガロースゲル電気泳動で分析できます。図 3 は、成功した ATAC-seq ライブラリの例を示しています。通常、8または9サイクルのPCR増幅(初期PCRを含む合計PCRサイクル)は、3〜6 ng / μL ATAC-seqライブラリ濃度をもたらします。Tn5はオープンクロマチンでヌクレオソームフリー領域を優先的に「攻撃」するため(図1)、ゲル画像上ではヌクレオソームのはしごが明らかになります(図3)。臭化エチジウムまたはSYBR金は、アガロースゲル上の増幅DNAを検出するために使用できます。
次に、ATAC-seqライブラリを用いたqPCR解析を使用して、ライブラリの品質および活性遺伝子のプロモーターなどのオープンクロマチン領域でのフラグメント濃縮を簡単に確認できます(図4)。プライマーは、既知の活性遺伝子のプロモーターをポジティブコントロールとして、既知の「閉鎖」(不活性)クロマチン領域をネガティブコントロールとして使用して、<80 bpアンプリコンを生成するように設計できます(図4A)。試験条件の中で、CSKバッファーを用いたT47D ATAC-seqライブラリでは、より高い濃縮が観察されました(図4B)。予想通り、プライマーCを用いたESR1の上流の閉鎖領域と比較して、エストロゲン受容体α(ESR1)遺伝子プロモーター領域でプライマーKおよびLを使用すると、より多くの濃縮が見られました(図4B)26。図5は、異なるTn5濃度(25,000細胞を使用した)を有するATAC-seqデータの例を示す。この場合、最も低い(1.25μLのTn5)Tn5条件でより高いバックグラウンドノイズが検出されました(図5、垂直バー)。2.5 μLまたは5 μLのTn5からのATAC-seqデータは、バックグラウンドシグナルが低いオープンクロマチン領域で同様のレベルのATAC-seqシグナルを示しました。高濃度でのTn5による潜在的な過剰消化を考慮すると、2.5μLのTn5がこの細胞型に適していると結論付けることができます。
また、上皮間葉転換の研究に頻繁に使用されるNMuMG細胞の異なる細胞番号を使用してATAC-seqを実行しました(図6)。開始ボリュームを最適化するために、ATAC-seqライブラリの最適化に4つの異なるセル番号(25,000、50,000、75,000、および100,000)を使用しました。細胞をCSKバッファーで溶解し、核を25 μLの反応混合物中の2.5 μLのTn5トランスポザーゼとともにインキュベートしました。Tn5消化およびヌクレオソームラダーの有効性を調べるために、挿入されたDNAのサイズ分布をバイオインフォマティクス的に分析しました(図6A)。より低い細胞数を使用した場合、ヌクレオソームを含まないDNA断片(<100 bp)は、シーケンシングデータにおいてより濃縮されました。一方、モノヌクレオソームDNA断片の割合(175-225 bp)は、高細胞投入条件(75,000細胞および100,000細胞)と比較して、低細胞投入サンプル(25,000細胞および50,000細胞)で少なかった。サンプル間で異なるDNA断片パターンが観察されましたが、入力細胞数は、プロモーターおよび他のオープンクロマチン領域でのATAC-seqシグナルの濃縮に最小限の影響を与えているようです(図6B)。ダウンストリーム解析に対するインプトセル数の影響をさらに調査するために、ATAC-seqピークを定義しました。ATAC-seqピークは、以下のパラメータを用いてPeaKDEckピーク呼出プログラム27 によって決定された:-sig 0.0001 -bin 300 -back 3,000 -npBack 2,500,000。~490万の一意マッピングリードから、それぞれ25,000、50,000、75,000、および100,000のセル入力からのATAC-seqデータで38,878、43,832、41,509、および45,530のピークが観察されました。100,000セルの入力条件は、ピークの数が最も多かった。転写開始部位(TSS)エンリッチメントスコアはATAC-seqデータの品質を評価するために使用されているため、各ATAC-seq条件のTSSスコアはGitHubプログラムを使用して計算されました:Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28。25,000、50,000、75,000、および100,000セル入力条件のTSSスコアは、それぞれ9.03、9、02、8.82、および8.28でした(TSSエンリッチメントスコアは、728より大きい場合に理想的と見なされます)。これは、細胞数の増加に伴ってTSS濃縮スコアが徐々に減少することを示した。100,000セル入力条件で最大のピーク数が観測されたのに対し、25,000セル入力条件ではTSSスコアが良好であった。ホーマー29 によるピークアノテーション分析は、増加したピークの大部分がプロモーター遠位ピークとして分類されることを示した(図6C)。これらの結果に基づいて、より高い細胞数の入力は、この条件のより低い細胞数の入力と比較して、より高い数のピークを生成し、より頻繁に非プロモーターピークを検出することができると結論付けることができる。
図1:ATAC-seq法の概要 。 (A)ATAC-seqは、順方向および逆方向のアダプターをプリロードした高活性Tn5トランスポザーゼを使用してクロマチンアクセシビリティを測定します。プロセスの様々なステップには、(B)細胞溶解(溶解バッファー組成の最適化、Tn5の滴定、および使用される細胞数を含む)が含まれる。(C)転位(Tn5のオープン/アクセス可能なクロマチンへの結合);(d)クロマチンのタグ化;(E)ライブラリーのDNA断片精製および増幅、および(F)ライブラリーのシーケンシングおよびデータ解析。ATAC-seqライブラリのフラグメント長分布解析では、通常、~50 bp付近(ヌクレオソームフリー領域)に初期ピークがあり、~200 bp(モノヌクレオソーム)に別のピークが見られます。したがって、計算または実験サイズフィルタリングなしで、ATAC-seqシグナルはオープンクロマチンにヌクレオソームフリー領域とヌクレオソーム領域の両方を含みます。BioRender.com で作成。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:トリパンブルーを用いた細胞溶解効率の比較 。 (a)NMuMG細胞を低張緩衝液8 で処理し、トリパンブルーで染色した。(b)NMuMG細胞をCSK緩衝液で処理し、トリパンブルーで染色した。スケールバーは50μmを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ATAC-seqライブラリの増幅DNAフラグメント解析。 ATAC-seqライブラリーは、MDA-MB-231乳癌細胞から調製した。(A)PCR増幅後、ビーズ精製前後のPCR産物を0.5倍TBE、1.5%アガロースゲルで分析した。プライマーは、最初のビーズ精製によってほとんど除去されます。(B)1x TAE、1%アガロースゲル電気泳動および(C)自動電気泳動からのDNAバンドパターンも示される。SYBRゴールドは、 A および Bに示すDNA断片を視覚化するために使用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ATAC-seqライブラリのエンリッチメント解析 。 (A)ESR1遺伝子座を示すゲノムブラウザトラック。T47D細胞20 におけるATAC-seqデータのゲノムカバレッジが示されている。以前の出版物からのプライマーは26を使用し、それらの標的領域は黄色で強調表示されています。(B)ATAC-seqライブラリにおけるプライマーアンプリコン濃縮を示す棒グラフ。ATAC-seqライブラリは、低張緩衝液またはCSK緩衝液により調製した。異なる濃度のTn5も、ATAC-seqライブラリの生成に使用されました。各ライブラリの1 ngを使用してqPCRを実行しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ATAC-seq最適化のためのゲノムブラウザの可視化。 ライブラリー調製中に異なる量のTn5トランスポザーゼを添加した。1.25 μLのTn5条件は、より高いバックグラウンド信号(黄色で強調表示)を示しますが、他の2つの条件は類似しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ATAC-seqライブラリのDNAフラグメントサイズ分布 。 (a)ATAC-seqライブラリーは、示された細胞番号を用いて調製した。25,000細胞インプット条件のATAC-seqデータは、ヌクレオソームフリーフラグメントの最も高い濃縮を示し、100,000セルインプット条件は最も高いモノヌクレオソームDNAを示しました。(B)異なる細胞番号からのATAC-seqデータを示すゲノムブラウザトラック。(C)ホーマーピークアノテーション分析。各ピークは、ホーマー29によってプロモーター近位または遠位ピークとして分類された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 名前 | 順序 |
| ESR1 C フォワード | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C リバース | CTCCTCCGTTGAATGTCTCC |
| ESR1 K フォワード | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K リバース | TGTCTCTCTTTCTCTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L フォワード | TGTGCCTGGAGGGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L リバース | CATTACAAAGGTGCTGGAGAC |
表1:本研究で使用したプライマーのリスト。
| ステップス | 温度 | 時間 | サイクル |
| ギャップ充填 | 72 °C | 5 ミン | 1 |
| 初期変性 | 98 °C | 30秒 | 1 |
| 変性 | 98 °C | 10秒 | 5 |
| アニーリング | 63 °C | 30秒 | |
| 延長 | 72 °C | 1 ミン | |
| 持つ | 4 °C | 絶えず |
表2:PCR増幅プログラムパート1。
| ステップス | 温度 | サイクル |
| 初期変性 | 98 °C 30 s | 1 |
| 変性 | 98 °C 10 s | 20 |
| アニーリング | 63 °C 30 s | |
| 延長 | 72 °C 1 分 | |
| プレート読み取り |
表 3: qPCR 設定。
| ステップス | 温度 | 時間 | サイクル |
| 初期変性 | 98 °C | 30秒 | 1 |
| 変性 | 98 °C | 10秒 | ステップ6.4で計算された合計サイクル |
| アニーリング | 63 °C | 30秒 | |
| 延長 | 72 °C | 1 ミン | |
| 持つ | 4 °C | 絶えず |
表4:PCR増幅プログラムパート2。
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Discussion
ATAC-seqは、オープンクロマチン領域と活性クロマチン領域のマッピングに広く使用されています。がん細胞の進行は、遺伝子の変化やエピジェネティックなリプログラミングによって駆動されることが多く、その結果、クロマチンへのアクセス可能性と遺伝子発現が変化します。このリプログラミングの例は、腫瘍転移中の重要な細胞リプログラミングプロセスであることが知られている上皮間葉転換(EMT)およびその逆プロセスである間葉系から上皮への移行(MET)の間に見られる30。別の例は、ホルモン療法に対する薬剤耐性の獲得であり、管腔乳房腫瘍31においてしばしば観察される。ATAC-seqは、このような細胞表現型の変化をクロマチンレベルでモニターするのに有用であり、起源の細胞および癌サブタイプを予測するために使用することができる4。
ATAC-seqによるクロマチンリモデリングを正確に測定するには、再現性のある一貫したプロトコルの確立が必要です。この原稿では、ATAC-seqライブラリ最適化の標準的な戦略について説明します。MDA-MB-231およびNMuMG細胞株からのATAC-seqデータを最適化プロセスの例として使用します。NMuMG細胞はEMTの研究に使用され、MDA-MB-231細胞はその逆プロセスであるMETの研究に使用されています。これらの細胞モデルは、EMTおよびMET中のエピジェネティックな変化を研究するために以前に使用されてきました13,32。細胞溶解とTn5濃度に適切なバッファーを使用することは、ATAC-seqライブラリ調製を成功させるための重要な要素です。これらの成分に加えて、高い割合(>90%)の細胞生存率、溶解バッファー中の適切な濃度の界面活性剤、および単一細胞懸濁液の調製も非常に重要です。Tn5の消化効率がサンプル間で大きく異なる場合、データのばらつきを修正することは困難です。これは、消化効率を定量的に評価するための内部および外部の制御がないためです。細胞の特性または特性は、対照群の細胞と試験群の細胞の間でも異なる場合があります。したがって、両方の実験グループから高品質のATAC-seqデータを取得するには、溶解バッファーの選択を含む実験条件を慎重に検討する必要があります(図5および図6)。
オープンクロマチンプロファイリングに加えて、ATAC-seqは転写因子のフットプリントとヌクレオソームの位置を特定するために使用されています8,33。このような情報は主にオープンクロマチン領域に由来することに注意することが重要です(図1F)。したがって、結果はオープンクロマチン領域に偏ります。それにもかかわらず、ATAC-seqはクロマチン構造を研究するための強力なツールです。この革新的なツールは、最近ではシングルセルゲノミクスに採用されており、遺伝子制御とクロマチン生物学の理解の向上に貢献し続けています。
データの可用性:
このプロトコルで提示されたデータは、アクセッション番号GSE202791で遺伝子発現オムニバスで入手できます。GSE72141およびGSE99479のATAC-seqデータも分析に使用しました。
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Disclosures
著者らは、この論文で説明されている研究に関連する関連または重要な金銭的利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
優れた技術支援を提供してくれたUNDゲノミクスコア施設に感謝します。
この研究は、国立衛生研究所[P20GM104360からM.T.、P20 GM104360からA.D.]によって資金提供され、ノースダコタ大学医学部および健康科学部、生物医科学部[M.T.へ]から提供されたスタートアップ資金によって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
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