ATAC-Seq optimalisering for kreft epigenetikk forskning
Summary
ATAC-seq er en DNA-sekvenseringsmetode som bruker den hyperaktive mutante transposasen, Tn5, for å kartlegge endringer i kromatintilgjengelighet mediert av transkripsjonsfaktorer. ATAC-seq gjør det mulig å oppdage de molekylære mekanismene som ligger til grunn for fenotypiske endringer i kreftceller. Denne protokollen skisserer optimaliseringsprosedyrer for ATAC-seq i epitelcelletyper, inkludert kreftceller.
Abstract
Analysen for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (ATAC-seq) sonder deoksyribonukleinsyre (DNA) tilgjengelighet ved bruk av hyperaktiv Tn5-transposase. Tn5 kutter og ligaterer adaptere for sekvensering med høy gjennomstrømning innenfor tilgjengelige kromatinområder. I eukaryote celler pakkes genomisk DNA inn i kromatin, et kompleks av DNA, histoner og andre proteiner, som fungerer som en fysisk barriere for transkripsjonsmaskineriet. Som svar på ekstrinsiske signaler rekrutterer transkripsjonsfaktorer kromatinremodelleringskomplekser for å muliggjøre tilgang til transkripsjonsmaskineriet for genaktivering. Derfor er identifisering av åpne kromatinregioner nyttig ved overvåking av forsterker- og genpromotoraktiviteter under biologiske hendelser som kreftprogresjon. Siden denne protokollen er enkel å bruke og har et lavt celleinngangskrav, har ATAC-seq blitt allment vedtatt for å definere åpne kromatinregioner i forskjellige celletyper, inkludert kreftceller. For vellykket datainnsamling må flere parametere vurderes når du forbereder ATAC-seq-biblioteker. Blant dem er valget av cellelysebuffer, titrering av Tn5-enzymet og startvolumet av celler avgjørende for ATAC-seq-bibliotekforberedelse i kreftceller. Optimalisering er viktig for å generere data av høy kvalitet. Her gir vi en detaljert beskrivelse av optimaliseringsmetodene for ATAC-seq for epitelcelletyper.
Introduction
Kromatin tilgjengelighet er et sentralt krav for regulering av genuttrykk på en genom-bred skala1. Endringer i kromatin tilgjengelighet er ofte forbundet med flere sykdomstilstander, inkludert kreft 2,3,4. Gjennom årene har mange teknikker blitt utviklet for å gjøre det mulig for forskere å undersøke kromatinlandskapet ved å kartlegge regioner av kromatintilgjengelighet. Noen av dem inkluderer DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehydassistert isolering av regulatoriske elementer)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, og fokuset i denne artikkelen, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq kartlegger tilgjengelige regioner ved å bruke en nøkkelfunksjon i DNase, nemlig fortrinnsrett fordøyelse av nakent DNA fri for histoner og andre proteiner som transkripsjonsfaktorer5. FAIRE-seq, som ligner på ChIP-seq, benytter formaldehydkryssbinding og sonikering, bortsett fra at ingen immunoprecipitasjon er involvert, og de nukleosomfrie områdene isoleres ved fenol-kloroformekstraksjon6. MAPit-metoden bruker en GC-metyltransferase for å undersøke kromatinstruktur ved enkeltmolekyloppløsning7. ATAC-seq er avhengig av den hyperaktive transposasen, Tn58. Tn5-transposasen binder seg fortrinnsvis til åpne kromatinområder og setter inn sekvenseringsadaptere i tilgjengelige områder. Tn5 opererer gjennom en DNA-mediert “klipp og lim” -mekanisme, hvorved transposasen forhåndslastet med adaptere binder seg til åpne kromatinsteder, kutter DNA og ligaterer adapterne8. Tn5-bundne områder gjenvinnes ved PCR-forsterkning ved hjelp av primere som anneal til disse adapterne. FAIRE-seq og DNase-seq krever en stor mengde utgangsmateriale (~ 100 000 celler til 225 000 celler) og et eget bibliotekforberedelsestrinn før sekvensering9. På den annen side er ATAC-seq-protokollen relativt enkel og krever et lite antall celler (<50 000 celler)10. I motsetning til FAIRE-seq og DNase-seq teknikker, er sekvenseringsbiblioteket forberedelse av ATAC-seq relativt enkelt, da den isolerte DNA-prøven allerede blir merket med sekvenseringsadapterne av Tn5. Derfor er det bare PCR-forsterkningstrinnet med passende primere som trengs for å fullføre bibliotekforberedelsen, og de tidligere behandlingstrinnene som sluttreparasjon og adapterligering trenger ikke utføres, og sparer dermed tid11. For det andre unngår ATAC-seq behovet for bisulfittkonvertering, kloning og forsterkning med regionspesifikke primere som kreves for MAPit7. På grunn av disse fordelene har ATAC-seq blitt en enormt populær metode for å definere åpne kromatinregioner. Selv om ATAC-seq-metoden er enkel, krever flere trinn optimalisering for å oppnå reproduserbare data av høy kvalitet. Dette manuskriptet diskuterer optimaliseringsprosedyrer for standard ATAC-seq biblioteksforberedelse, spesielt fremhever tre parametere: (1) lysisbuffersammensetning, (2) Tn5-transposasekonsentrasjon og (3) cellenummer. I tillegg gir denne artikkelen eksempeldata fra optimaliseringsbetingelsene ved bruk av både kreft- og ikke-kreftadherente epitelceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
ATAC-seq har blitt mye brukt til kartlegging av åpne og aktive kromatinregioner. Kreftcelleprogresjon er ofte drevet av genetiske endringer og epigenetisk omprogrammering, noe som resulterer i endret kromatintilgjengelighet og genuttrykk. Et eksempel på denne omprogrammeringen ses under epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) og dens omvendte prosess, mesenkymal-til-epitelial overgang (MET), som er kjent for å være viktige cellulære omprogrammeringsprosesser under tumormetastase30. Et anne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker UND Genomics kjernefasilitet for fremragende teknisk assistanse.
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health [P20GM104360 til MT, P20 GM104360 til AD] og oppstartsmidler levert av University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Institutt for biomedisinsk vitenskap [til MT].
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific – Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum – TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP – 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | – | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O’Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
