Summary
ATAC-seq er en DNA-sekvenseringsmetode som bruker den hyperaktive mutante transposasen, Tn5, for å kartlegge endringer i kromatintilgjengelighet mediert av transkripsjonsfaktorer. ATAC-seq gjør det mulig å oppdage de molekylære mekanismene som ligger til grunn for fenotypiske endringer i kreftceller. Denne protokollen skisserer optimaliseringsprosedyrer for ATAC-seq i epitelcelletyper, inkludert kreftceller.
Abstract
Analysen for transposase-tilgjengelig kromatin med høy gjennomstrømningssekvensering (ATAC-seq) sonder deoksyribonukleinsyre (DNA) tilgjengelighet ved bruk av hyperaktiv Tn5-transposase. Tn5 kutter og ligaterer adaptere for sekvensering med høy gjennomstrømning innenfor tilgjengelige kromatinområder. I eukaryote celler pakkes genomisk DNA inn i kromatin, et kompleks av DNA, histoner og andre proteiner, som fungerer som en fysisk barriere for transkripsjonsmaskineriet. Som svar på ekstrinsiske signaler rekrutterer transkripsjonsfaktorer kromatinremodelleringskomplekser for å muliggjøre tilgang til transkripsjonsmaskineriet for genaktivering. Derfor er identifisering av åpne kromatinregioner nyttig ved overvåking av forsterker- og genpromotoraktiviteter under biologiske hendelser som kreftprogresjon. Siden denne protokollen er enkel å bruke og har et lavt celleinngangskrav, har ATAC-seq blitt allment vedtatt for å definere åpne kromatinregioner i forskjellige celletyper, inkludert kreftceller. For vellykket datainnsamling må flere parametere vurderes når du forbereder ATAC-seq-biblioteker. Blant dem er valget av cellelysebuffer, titrering av Tn5-enzymet og startvolumet av celler avgjørende for ATAC-seq-bibliotekforberedelse i kreftceller. Optimalisering er viktig for å generere data av høy kvalitet. Her gir vi en detaljert beskrivelse av optimaliseringsmetodene for ATAC-seq for epitelcelletyper.
Introduction
Kromatin tilgjengelighet er et sentralt krav for regulering av genuttrykk på en genom-bred skala1. Endringer i kromatin tilgjengelighet er ofte forbundet med flere sykdomstilstander, inkludert kreft 2,3,4. Gjennom årene har mange teknikker blitt utviklet for å gjøre det mulig for forskere å undersøke kromatinlandskapet ved å kartlegge regioner av kromatintilgjengelighet. Noen av dem inkluderer DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehydassistert isolering av regulatoriske elementer)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, og fokuset i denne artikkelen, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq kartlegger tilgjengelige regioner ved å bruke en nøkkelfunksjon i DNase, nemlig fortrinnsrett fordøyelse av nakent DNA fri for histoner og andre proteiner som transkripsjonsfaktorer5. FAIRE-seq, som ligner på ChIP-seq, benytter formaldehydkryssbinding og sonikering, bortsett fra at ingen immunoprecipitasjon er involvert, og de nukleosomfrie områdene isoleres ved fenol-kloroformekstraksjon6. MAPit-metoden bruker en GC-metyltransferase for å undersøke kromatinstruktur ved enkeltmolekyloppløsning7. ATAC-seq er avhengig av den hyperaktive transposasen, Tn58. Tn5-transposasen binder seg fortrinnsvis til åpne kromatinområder og setter inn sekvenseringsadaptere i tilgjengelige områder. Tn5 opererer gjennom en DNA-mediert "klipp og lim" -mekanisme, hvorved transposasen forhåndslastet med adaptere binder seg til åpne kromatinsteder, kutter DNA og ligaterer adapterne8. Tn5-bundne områder gjenvinnes ved PCR-forsterkning ved hjelp av primere som anneal til disse adapterne. FAIRE-seq og DNase-seq krever en stor mengde utgangsmateriale (~ 100 000 celler til 225 000 celler) og et eget bibliotekforberedelsestrinn før sekvensering9. På den annen side er ATAC-seq-protokollen relativt enkel og krever et lite antall celler (<50 000 celler)10. I motsetning til FAIRE-seq og DNase-seq teknikker, er sekvenseringsbiblioteket forberedelse av ATAC-seq relativt enkelt, da den isolerte DNA-prøven allerede blir merket med sekvenseringsadapterne av Tn5. Derfor er det bare PCR-forsterkningstrinnet med passende primere som trengs for å fullføre bibliotekforberedelsen, og de tidligere behandlingstrinnene som sluttreparasjon og adapterligering trenger ikke utføres, og sparer dermed tid11. For det andre unngår ATAC-seq behovet for bisulfittkonvertering, kloning og forsterkning med regionspesifikke primere som kreves for MAPit7. På grunn av disse fordelene har ATAC-seq blitt en enormt populær metode for å definere åpne kromatinregioner. Selv om ATAC-seq-metoden er enkel, krever flere trinn optimalisering for å oppnå reproduserbare data av høy kvalitet. Dette manuskriptet diskuterer optimaliseringsprosedyrer for standard ATAC-seq biblioteksforberedelse, spesielt fremhever tre parametere: (1) lysisbuffersammensetning, (2) Tn5-transposasekonsentrasjon og (3) cellenummer. I tillegg gir denne artikkelen eksempeldata fra optimaliseringsbetingelsene ved bruk av både kreft- og ikke-kreftadherente epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelser før du begynner eksperimentet
- Forbered lysisbufferlager.
MERK: Den optimale kjernefysiske isolasjonsbufferen kan være forskjellig for hver celletype. Vi anbefaler å teste både den hypotoniske bufferen som brukes i originalpapiret8 og en CSK-buffer12,13 for hver celletype ved hjelp av trypanblå farging.- For å forberede hypotonisk buffer (Greenleaf buffer), bland 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 og 0,1% NP-40.
- For å klargjøre CSK-buffer blander du 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM sukrose, 3 mM MgCl2 og 0,1 % Triton X-100.
- Sørg for at cellekulturforholdene er optimale; Undersøk cellene under et lysmikroskop for å sikre at det ikke er forhøyede nivåer av apoptose.
- Slå på sentrifugen for å la den nå 4 °C.
2. Cell høsting
- Aspirere media fra en kultur av celler ved <80% sammenløp. Celler dyrkes vanligvis i en 35 mm eller 60 mm tallerken, basert på antall celler som trengs, behandlinger, etc.
- Vask cellene med 1 ml eller 3 ml PBS.
- Tilsett 0,5 ml eller 1 ml trypsin og rug i 2-3 minutter (avhengig av celletyper). Bruk forsiktig en 1 ml pipette til å blande godt.
- Tilsett 1 ml eller 2 ml media på tallerkenen og bland godt. Overfør til et 15 ml konisk rør. Sentrifuge cellene i et 15 ml rør i 3 minutter ved 300 x g.
MERK: En svingende bøtterotor anbefales for å minimere celletap. - Aspirer media og resuspender cellene i 1 ml eller 2 ml medium.
MERK: Det er viktig å fremstille en homogen encellet løsning. For vev kan en Dounce homogenisator brukes til å homogenisere vev og minimere store celleklumper eller aggregater. Noen vev krever filtrering (f.eks. Cellesiler) og / eller FACS-cellesortering for å isolere levedyktige celler og oppnå en enkeltcelleløsning. - Tell cellene ved hjelp av en celleteller.
MERK: I denne studien ble en automatisert celleteller (Table of Materials) brukt. - Sentrifuge det nødvendige cellevolumet (f.eks. et volum som inneholder 1 x 106 celler basert på celletall) ved 300 x g i 3 minutter ved romtemperatur (RT).
- Resuspender cellepelleten som inneholder 1 x 106 celler i 1 ml kald PBS.
MERK: Hvis cellenumrene er mindre enn 1 x 106 celler, reduser det kalde PBS-volumet for å klargjøre celleoppløsningen i samme konsentrasjon (1 x 106 celler / ml).
3. Cellelyse
- Overfør 25 μL (= 2,5 x 104 celler) til et nytt 1,7 ml mikrosentrifugerør. Sentrifuge i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C og kast supernatanten forsiktig
MERK: En svingende bøtterotor anbefales for å minimere celletap. La ca 3 μL supernatant for å sikre at cellene ikke blir kassert. - Tilsett 25 μL lysisbuffer og resuspender cellene ved forsiktig pipettering opp og ned. Inkuber på is i 5 min
- Sentrifuge i 5 minutter ved 500 x g ved 4 °C og kast supernatanten forsiktig.
MERK: En svingende bøtterotor anbefales for å minimere celletap. La ca 3 μL supernatant for å sikre at cellene ikke blir kassert.
4. Tn5 tagmentation
- Resuspender pelleten umiddelbart i 25 μL Tn5 reaksjonsblanding. Tn5-reaksjonsblandingen er som følger: 12,5 μL 2x Tagmentation DNA-buffer (TD-buffer), 1,25-5 μL Tn5-transposase og 11,25-7,5 μL nukleasefritt vann.
MERK: Standardkonsentrasjonen av Tn5 er 2,5 μL for 2,5 x 104 celler. - Inkuber i 30 minutter ved 37 °C.
MERK: Bland oppløsningen hvert 10. minutt.
5. DNA-rensing
MERK: Rensing er nødvendig før forsterkning. DNA-rensing gjøres ved hjelp av MinElute PCR-rensesett (materialtabell).
- Tilsett 5 μL 3 M natriumacetat (pH 5,2).
- Tilsett umiddelbart 125 μL buffer PB og bland godt.
- Følg PCR-rensesettprotokollen som starter i trinn 2.
- Plasser spinnsøylen i et 2 ml oppsamlingsrør.
- Påfør prøven på spinnsøylen og sentrifugen i 1 min ved 17 900 x g ved RT.
- Kast gjennomstrømningen og plasser spinnsøylen tilbake i samme oppsamlingsrør.
- Tilsett 750 μL buffer PE i spinnsøylen og sentrifugen i 1 min ved 17 900 x g ved RT.
- Kast gjennomstrømningen og plasser spinnsøylen tilbake i samme oppsamlingsrør.
- Sentrifuge spinnsøylen i 5 minutter for å tørke membranen helt.
- Kast gjennomstrømningen og plasser spinnsøylen i et nytt 1,7 ml mikrosentrifugerør.
- Eluter DNA-fragmentene med 10 μL buffer EB.
- La kolonnen stå i 1 min på RT.
- Sentrifuge i 1 min ved 17 900 x g ved RT for å eluere DNA.
6. PCR-forsterkning
MERK: PCR-forsterkning av transponerte (tagmentede) DNA-er er nødvendig for sekvensering. Nextera kit adaptere (Table of Materials) ble brukt i dette eksemplet. Primerne som ble brukt i denne studien er listet opp i tabell 1.
- Sett opp følgende PCR-reaksjon i 200 μL PCR-rør (50 μL for hver prøve). PCR-reaksjonsblandingen er som følger: 10 μL eluert DNA (trinn 5.), 2,5 μL 25 mM adapter 1, 2,5 μL 25 mM adapter 2, 25 μL 2x PCR-masterblanding og 10 μL nukleasefritt vann
- Utfør PCR-forsterkningsprogram del 1 (tabell 2).
MERK: For innledende forsterkning brukes de samme forholdene for alle prøver ved bruk av en standard termisk syklus. - Sanntids qPCR (totalt 14,5 μL per prøve)
- Ved å bruke 5 μL av produktet fra PCR-forsterkningsdel 1 (trinn 6.2), sett opp følgende reaksjon, denne gangen inkludert SYBR-gull og deteksjon i en sanntids PCR-maskin.
- Forbered PCR-reaksjonsblandingen som følger: 5 μL PCR-produkt fra trinn 6.2., 0.75 μL SYBR-gull (1000x fortynnet), 5 μL 2x PCR-masterblanding og 3.75 μL nukleasefritt vann.
MERK: De nøyaktige syklustallene for bibliotekforsterkning før metning når metning for hver prøve bestemmes av qPCR (tabell 3) for å redusere GC og størrelsesskjevhet i PCR10. SYBR Gold ble fortynnet med nukleasfritt vann. For å lage den fortynnede oppløsningen ble 1 μL SYBR Gold (lagerkonsentrasjon 10.000x) tilsatt til 999 μL nukleasefritt vann. Kjøretiden for RT-qPCR nevnt i tabell 3 er ca. 60 min.
- Bestem det nødvendige antallet ekstra PCR-sykluser ved hjelp av kjøreparameterne fra trinn 6.3.
- Antall sykluser = 1/4 maksimal (mettet) fluorescensintensitet (vanligvis 3 eller 4 PCR-sykluser)
- PCR-forsterkningsprogram del 2 (volum = 45 μL; Tabell 4): Når du har bestemt syklusnummeret, konfigurerer du PCR-er med flere sykluser beregnet i trinn 6.4.1. Hvis for eksempel det beregnede syklusnummeret er 3, setter du opp 3 sykluser i programmet nedenfor. De totale syklusene vil være 8 (5 i trinn 6.2., pluss 3 ekstra sykluser i trinn 6.5.)
7. Rensing av perler
MERK: Her ble AMPure XP (Table of Materials) perler brukt.
- Til PCR-produktene forsterket i forrige trinn, tilsett 150 μL perler ved RT.
MERK: Hjemmelagde AMPure-perler14 kan brukes i denne prosessen. - Inkuber i 15 min ved RT.
- Plasser rørene på et magnetisk stativ i 5 minutter.
- Fjern supernatanten forsiktig.
- Vask perlene med 200 μL 80% etanol.
MERK: 80% etanol skal tilberedes fersk. - Gjenta trinn 7.4.
- Fjern etanolen helt.
- Lufttørk prøvene i 10 min ved RT.
- Resuspendere med 50 μL elueringsbuffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
- Gjenta rensingen av perlene (trinn 7.1.-7.9.) for ytterligere å minimere primerkontaminering.
8. DNA-konsentrasjon og kvalitetskontroll
- Mål DNA-konsentrasjonen ved å bruke et nukleinsyrekvantifiseringssett (materialtabell).
- Kontroller de forsterkede DNA-fragmentene ved gelelektroforese ved hjelp av SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% agarosegel) eller et automatisert elektroforesesystem (f.eks. TapeStation, bioanalyzer).
9. Sekvensering
- Utfør sekvensering med høy gjennomstrømning ved hjelp av de forsterkede DNA-prøvene12,13.
MERK: Forsterkede DNA-prøver er klare for sekvensering med høy gjennomstrømning. For å beholde nukleosomal DNA-fragmentinformasjon, anbefales parret sekvensering fremfor single-end sekvensering. Begge ender av DNA-fragmentene indikerer hvor transposasen binder seg. For kartlegging av åpne kromatinregioner er 30 millioner avlesninger / utvalg vanligvis tilstrekkelig.
10. Analyse av data
- Datafiltrering basert på grunnleggende samtalekvalitet: Angi minimum gjennomsnittlig grunnkvalitetspoengsum til 20 (99 % nøyaktighet).
- Adaptertrimming: Fjern adaptersekvensene ved hjelp av et passende verktøy.
MERK: Trim Galore wrapper verktøyet (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) ble brukt til å fjerne adaptersekvenser. For ATAC-seq-biblioteker utarbeidet av Illumina Tn5 brukes følgende sekvens som adaptersekvens: CTGTCTTATACACATCT. Minste sekvenslengde for å gjenkjenne adapterkontaminering er satt til 5. - Genomkartlegging: Kartlegg lesningene til riktig genom med Bowtie ved å bruke følgende parametere "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Et eksempel på kartlegging av kvalitet fra MDA-MB-231 basale brystkreftceller er nedenfor:
Leser med minst én rapportert justering: 52,79 %
Leser som ikke ble justert: 13.10%
Leser med justeringer undertrykt på grunn av -m: 34.11% - Deduplisering: Merk PCR-duplikatene med Picard-verktøy16.
- Generere en genomdekningsfil for datavisualisering: Konverter de dedupliserte parede end-lesingene til single-end lesefragmenter. Genomdekningsspor oppnås ved hjelp av genomeCoverageBed fra bedtools17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å oppnå vellykkede ATAC-seq-data av høy kvalitet, er det viktig å optimalisere eksperimentelle forhold. Forberedelse av ATAC-seq-biblioteket kan deles inn i de fem hovedtrinnene (figur 1), nemlig cellelyse, tagmentasjon (fragmentering og adapterinnsetting ved Tn5), genomisk DNA-rensing, PCR-amplifisering og dataanalyse. Som en innledende prosess må cellelysebufferen (nukleær isolasjon) først optimaliseres for hver celletype. Enten ble den hypotoniske bufferen beskrevet i det opprinnelige ATAC-seq-papiret8 eller CSK-bufferen12,13 brukt til å lyse brystkreftceller. Trypanblå farging kan brukes til å bekrefte kjerneisolasjon18. For ATAC-seq-bibliotekforberedelse i humane kreftcellelinjer som MDA-MB-231, T47D, MCF7 og A375-celler, har CSK-buffer blitt brukt av flere grupper12,13,19,20. CSK-buffer ble også brukt til ATAC-seq-biblioteksforberedelse i andre celletyper som embryonale stamceller 21,22 og Drosophila S2-celler 23. For lysisbufferoptimalisering er Trypan blå farging nyttig for å vurdere cellelysiseffektiviteten. Når NMuMG, ikke-kreftfremkallende brystkjertelepitelceller, ble behandlet med hypoton buffer8 (se trinn 1) og CSK-buffer, ble det observert høyere cellelyseeffektivitet i CSK-behandlede celler (figur 2). For frosset vev har Omni-ATAC vist seg å forbedre ATAC-seq-signaler24. I Omni-ATAC brukes en buffer som inneholder 0,1% NP40, 0,1% Tween-20 og 0,01% Digitonin for cellelyse. Selv om Digitonin-basert buffer er kjent for å redusere fraksjonen av mitokondrielt DNA, ble signal-til-støy-forholdene og TSS-lesetellingene fra ATAC-seq med CSK-buffer vist å være bedre enn de fra Omni-ATAC i brystkreftceller12. Derfor er resten av dette manuskriptet hovedsakelig fokusert på resultatene fra ATAC-seq-data med CSK-buffer.
Etter bestemmelse av de beste cellelysebufferbetingelsene (nukleær isolasjon), er det viktig å optimalisere forholdet mellom inngangscellenummer og Tn5-transposasekonsentrasjon12,25. Vanligvis kan Tn5-konsentrasjonen titreres ved å variere volumet av Tn5 fra 1,25 μL, 2,5 μL, til 5 μL i et totalt volum på 25 μL reaksjonsblanding. Alternativt kan inndatacellenumre endres (f.eks. fra 10 000 til 100 000), mens Tn5-enzymet holdes uendret ved 2,5 μL for å optimalisere Tn5-tagmentasjonsreaksjonen. For å evaluere kvaliteten på ATAC-seq-biblioteker og effektiviteten av Tn5-indusert kromatinfordøyelse, kan bibliotekets PCR-produkter analyseres ved agarosegelelektroforese. Figur 3 viser eksempler på vellykkede ATAC-seq-biblioteker. Vanligvis resulterer PCR-forsterkning på 8 eller 9 sykluser (totale PCR-sykluser inkludert innledende PCR) i 3-6 ng / μL ATAC-seq bibliotekkonsentrasjon. Da Tn5 fortrinnsvis "angriper" nukleosomfrie regioner ved åpent kromatin (figur 1), bør nukleosomstigene være åpenbare på gelbildet (figur 3). Ethidiumbromid eller SYBR Gold kan brukes til å oppdage forsterkede DNAer på agarosegelen.
Deretter kan qPCR-analyse ved hjelp av ATAC-seq-biblioteker brukes til å kort sjekke kvaliteten på bibliotekene og fragmentberikelsen ved åpne kromatinregioner som promotorer av aktive gener (figur 4). Primere kan utformes for å generere <80 bp amplikoner ved å bruke promotorer av kjente aktive gener som positive kontroller og kjente "lukkede" (inaktive) kromatinregioner som negative kontroller (figur 4A). Blant de testede forholdene ble det observert høyere anrikning i T47D ATAC-seq-bibliotekene med CSK-buffer (figur 4B). Som forventet fant vi mer anrikning ved bruk av primere K og L ved østrogenreseptor alfa (ESR1) genpromotorregion i forhold til et lukket område oppstrøms for ESR1 med primer C (figur 4B) 26. Figur 5 viser eksempler på ATAC-seq-data med forskjellige Tn5-konsentrasjoner (25 000 celler ble brukt). I dette tilfellet ble det påvist høyere bakgrunnsstøy i laveste (1,25 μL av Tn5) Tn5-tilstand (figur 5, vertikale stenger). ATAC-seq-data fra 2,5 μL eller 5 μL Tn5 viste lignende nivåer av ATAC-seq-signaler i åpne kromatinregioner med lavere bakgrunnssignaler. Med tanke på potensiell overfordøyelse av Tn5 ved høyere konsentrasjon, kan det konkluderes med at 2,5 μL Tn5 er egnet for denne celletypen.
Vi utførte også ATAC-seq med ulike celletall i NMuMG-celler, som ofte ble brukt til å studere epitel-mesenkymal overgang (figur 6). For å optimalisere startvolumet ble fire forskjellige cellenumre (25 000, 50 000, 75 000 og 100 000) brukt til optimalisering av ATAC-seq-biblioteket. Cellene ble lysnet med CSK-buffer, og kjerner ble inkubert med 2,5 μL Tn5-transposase i 25 μL av reaksjonsblandingen. For å undersøke effekten av Tn5 fordøyelse og nukleosomale stiger, ble størrelsesfordelingen av innsatte DNAer bioinformatisk analysert (figur 6A). Når lavere celletall ble brukt, ble nukleosomfrie DNA-fragmenter (<100 bp) mer beriket i sekvenseringsdataene. På den annen side var fraksjonen av mono-nukleosomale DNA-fragmenter (175-225 bp) mindre i de lave celleinngangsprøvene (25.000 celler og 50.000 celler) sammenlignet med høyere celleinngangsbetingelser (75.000 celler og 100.000 celler). Selv om differensielle DNA-fragmentmønstre ble observert mellom prøvene, synes inngangscellenummer å ha minimal innvirkning på anrikningen av ATAC-seq-signaler hos promotorer og andre åpne kromatinregioner (figur 6B). For ytterligere å undersøke virkningen av inngangscellenumre på nedstrømsanalyse, ble ATAC-seq-topper definert. ATAC-seq-toppene ble bestemt av PeaKDEck-toppanropsprogrammet27 ved hjelp av følgende parametere: -sig 0.0001 -bin 300 -back 3,000 -npBack 2,500,000. Fra ~ 4,9 millioner unikt kartlagte avlesninger ble 38 878, 43 832, 41 509 og 45 530 topper observert i ATAC-seq-data fra henholdsvis 25 000, 50 000, 75 000 og 100 000 celleinnganger. Inngangstilstanden på 100 000 celler viste det høyeste antallet topper. Siden transkripsjonsstartstedet (TSS) anrikningsscore har blitt brukt til å vurdere kvaliteten på ATAC-seq-data, ble TSS-poengsummen for hver ATAC-seq-tilstand beregnet ved hjelp av GitHub-programmet: Jiananlin / TSS_enrichment_score_calculation28. TSS-poengene for 25 000, 50 000, 75 000 og 100 000 celleinngangsbetingelser var henholdsvis 9,03, 9,02, 8,82 og 8,28 (TSS-anrikningspoengene anses som ideelle hvis den er større enn 728). Dette indikerte en gradvis reduksjon i TSS-anrikningsskåren med økende celletall. Mens det største topptallet ble observert i inngangstilstanden på 100 000 celler, ga inngangstilstanden på 25 000 celler en bedre TSS-score. Peak annotation analyse av Homer29 indikerte at flertallet av de økte toppene er kategorisert som promotor distale topper (figur 6C). Basert på disse resultatene kan det konkluderes med at de høyere cellenummerinngangene kan produsere et høyere antall topper og oftere oppdage ikke-promotortopper sammenlignet med de lavere cellenummerinngangene i denne tilstanden.
Figur 1: Oversikt over ATAC-seq-metoden. (A) ATAC-seq måler kromatintilgjengelighet ved hjelp av en hyperaktiv Tn5-transposase forhåndslastet med adaptere forover og bakover. De forskjellige trinnene i prosessen inkluderer (B) cellelyse (inkludert optimalisering av lysisbuffersammensetning, titrering av Tn5 og antall celler som brukes); (C) transposisjon (binding av Tn5 til åpen/tilgjengelig kromatin); (D) merking av kromatin; (E) DNA-fragmentrensing og forsterkning av biblioteker, og (F) sekvensering av biblioteker og dataanalyse. Fragmentlengdefordelingsanalyse av ATAC-seq-biblioteker viser vanligvis en innledende topp rundt ~ 50 bp (nukleosomfrie regioner) og en annen topp på ~ 200 bp (mono-nukleosom). Derfor, uten beregningsmessig eller eksperimentell størrelsesfiltrering, inneholder ATAC-seq-signaler både nukleosomfrie og nukleosomale regioner i åpent kromatin. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sammenligning av cellelyseeffektivitet ved bruk av trypanblå. (A) NMuMG-celler ble behandlet med hypotonisk buffer8 og farget med trypanblå. (B) NMuMG-celler ble behandlet med CSK-buffer og farget med trypanblått. Vektstengene indikerer 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Forsterket DNA-fragmentanalyse av ATAC-seq-biblioteker. ATAC-seq biblioteker ble utarbeidet fra MDA-MB-231 brystkreftceller. (A) Etter PCR-forsterkning ble PCR-produkter analysert på en 0,5x TBE, 1,5% agarosegel før og etter rensing av perler. Primere fjernes for det meste ved den første rensingen av perler. DNA-båndmønstre fra (B) 1x TAE, 1% agarosegelelektroforese og (C) en automatisert elektroforese er også indikert. SYBR Gold ble brukt til å visualisere DNA-fragmentene vist i A og B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Berikelsesanalyse av ATAC-seq-biblioteker . (A) Genome-nettleserspor som viser ESR1-lokuset. Genomdekningen av ATAC-seq-dataene i T47D-celler20 er vist. Primere fra en tidligere publikasjon ble brukt26, og deres målregioner er uthevet i gult. (B) Søylediagram som viser primer amplicon anrikning i ATAC-seq biblioteker. ATAC-seq-biblioteker ble utarbeidet av den hypotoniske bufferen eller CSK-bufferen. Ulike konsentrasjoner av Tn5 ble også brukt til å generere ATAC-seq biblioteker. 1 ng av hvert bibliotek ble brukt til å utføre qPCR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Genom nettleservisualisering for ATAC-seq optimalisering. Ulike mengder Tn5 transposase ble lagt til under bibliotekets forberedelse. 1,25 μL av Tn5-tilstanden viser høyere bakgrunnssignaler (uthevet i gult), mens de to andre forholdene ser like ut. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: DNA-fragmentstørrelsesfordeling av ATAC-seq-biblioteker. (A) ATAC-seq-biblioteker ble utarbeidet ved hjelp av de angitte cellenumrene. ATAC-seq-dataene fra 25.000-celleinngangstilstanden viste den høyeste anrikningen av nukleosomfrie fragmenter, mens 100.000-celleinngangsbetingelsen presenterte de høyeste mono-nukleosomale DNAene. (B) Genom-nettleserspor som viser ATAC-seq-data fra forskjellige cellenumre. (C) Homer peak merknad analyse. Hver topp ble klassifisert som en promotor-proksimal eller distal topp av Homer29. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Navn | Sekvens |
| ESR1 C fremover | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C revers | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K fremover | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K revers | TGTCTCTCTTTCTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L fremover | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L revers | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Tabell 1: Liste over primere brukt i denne studien.
| Trinn | Temperatur | Tid | Sykkel |
| Fylling av gap | 72 °C | 5 minutter | 1 |
| Innledende denaturering | 98 °C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 °C | 10 s | 5 |
| Annealing | 63 °C | 30 s | |
| Forlengelse | 72 °C | 1 min | |
| Holde | 4 °C | for alltid |
Tabell 2: PCR-forsterkningsprogram del 1.
| Trinn | Temperatur | Sykkel |
| Innledende denaturering | 98 °C 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 °C 10 s | 20 |
| Annealing | 63 °C 30 s | |
| Forlengelse | 72 °C 1 min | |
| Plate lest |
Tabell 3: qPCR-innstillinger.
| Trinn | Temperatur | Tid | Sykkel |
| Innledende denaturering | 98 °C | 30 s | 1 |
| Denaturering | 98 °C | 10 s | Totalt antall sykluser beregnet i trinn 6.4 |
| Annealing | 63 °C | 30 s | |
| Forlengelse | 72 °C | 1 min | |
| Holde | 4 °C | for alltid |
Tabell 4: PCR-forsterkningsprogram del 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ATAC-seq har blitt mye brukt til kartlegging av åpne og aktive kromatinregioner. Kreftcelleprogresjon er ofte drevet av genetiske endringer og epigenetisk omprogrammering, noe som resulterer i endret kromatintilgjengelighet og genuttrykk. Et eksempel på denne omprogrammeringen ses under epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) og dens omvendte prosess, mesenkymal-til-epitelial overgang (MET), som er kjent for å være viktige cellulære omprogrammeringsprosesser under tumormetastase30. Et annet eksempel er oppkjøpet av stoffresistens mot hormonbehandlinger observeres ofte i luminale brysttumorer31. ATAC-seq er nyttig for å overvåke slike cellefenotypiske endringer på kromatinnivå og kan brukes til å forutsi en opprinnelsescelle og kreftundertyper4.
For å nøyaktig måle kromatinremodellering ved ATAC-seq, er etablering av en reproduserbar og konsistent protokoll nødvendig. I dette manuskriptet beskrives en standardstrategi for optimalisering av ATAC-seq-biblioteket. ATAC-seq-dataene fra MDA-MB-231- og NMuMG-cellelinjer brukes som eksempler på optimaliseringsprosesser. NMuMG-celler har blitt brukt til å studere EMT, og MDA-MB-231-celler har blitt brukt til å studere den omvendte prosessen, MET. Disse cellulære modellene har tidligere blitt brukt til å studere epigenetiske endringer under EMT og MET13,32. Bruk av en passende buffer for cellelyse og Tn5-konsentrasjon er nøkkelkomponenten i vellykket ATAC-seq-bibliotekforberedelse. I tillegg til disse komponentene er en høy prosentandel (>90%) av cellens levedyktighet, passende konsentrasjoner av vaskemiddel i lysisbufferen og fremstillingen av enkeltcellesuspensjonen også svært viktig. Når Tn5 fordøyelseseffektiviteten er signifikant forskjellig på tvers av prøver, er det utfordrende å korrigere datavariasjoner. Dette skyldes mangel på interne og eksterne kontroller for kvantitativt å vurdere fordøyelseseffektiviteten. Cellulære egenskaper eller egenskaper kan også være forskjellige mellom cellene fra kontrollgruppen kontra cellene fra testgruppen. Derfor er nøye vurdering av eksperimentelle forhold, inkludert valg av lysisbuffer, nødvendig for å oppnå høykvalitets ATAC-seq-data fra begge eksperimentelle grupper (figur 5 og figur 6).
I tillegg til åpen kromatinprofilering har ATAC-seq blitt brukt til å identifisere transkripsjonsfaktoravtrykk og nukleosomposisjonering 8,33. Det er viktig å merke seg at slik informasjon hovedsakelig er avledet fra åpne kromatinregioner (figur 1F). Derfor vil resultatene være partiske mot åpne kromatinregioner. Likevel er ATAC-seq et kraftig verktøy for å studere kromatinarkitektur. Dette revolusjonerende verktøyet har nylig blitt tatt i bruk for encellet genomikk og fortsetter å bidra til å forbedre vår forståelse av genregulering og kromatinbiologi.
DATA TILGJENGELIGHET:
Dataene som presenteres i denne protokollen er tilgjengelige på Gene Expression Omnibus under tiltredelsesnummer GSE202791. ATAC-seq-dataene fra GSE72141 og GSE99479 ble også brukt i analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at det ikke er relevante eller materielle økonomiske interesser som relaterer seg til forskningen beskrevet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Vi takker UND Genomics kjernefasilitet for fremragende teknisk assistanse.
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health [P20GM104360 til MT, P20 GM104360 til AD] og oppstartsmidler levert av University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Institutt for biomedisinsk vitenskap [til MT].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
- Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J.
- Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
- Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
- Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
- Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
- Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
- Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
- Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
- Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
- Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
- Rohland, N., Reich, D. C. ost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
- Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository. , Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
- Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
- Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
- Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
- Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
- Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
- Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
- Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
- McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
- Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R.
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
- Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
- Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).
