Summary
ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.
Abstract
O ensaio para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) sonda a acessibilidade do ácido desoxirribonucleico (DNA) usando a transposase hiperativa Tn5. Tn5 corta e ligadura adaptadores para sequenciamento de alto rendimento dentro de regiões de cromatina acessíveis. Nas células eucarióticas, o DNA genômico é embalado em cromatina, um complexo de DNA, histonas e outras proteínas, que atua como uma barreira física à maquinaria transcricional. Em resposta a sinais extrínsecos, os fatores de transcrição recrutam complexos de remodelação da cromatina para permitir o acesso à maquinaria transcricional para a ativação do gene. Portanto, a identificação de regiões abertas da cromatina é útil ao monitorar as atividades do potenciador e do promotor de genes durante eventos biológicos, como a progressão do câncer. Uma vez que este protocolo é fácil de usar e tem um baixo requisito de entrada celular, o ATAC-seq tem sido amplamente adotado para definir regiões abertas da cromatina em vários tipos de células, incluindo células cancerígenas. Para uma aquisição de dados bem-sucedida, vários parâmetros precisam ser considerados ao preparar bibliotecas ATAC-seq. Entre eles, a escolha do tampão de lise celular, a titulação da enzima Tn5 e o volume inicial de células são cruciais para a preparação da biblioteca ATAC-seq em células cancerígenas. A otimização é essencial para gerar dados de alta qualidade. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada dos métodos de otimização ATAC-seq para tipos de células epiteliais.
Introduction
A acessibilidade à cromatina é um requisito fundamental para a regulação da expressão gênica em larga escalagenômica 1. Alterações na acessibilidade à cromatina são frequentemente associadas a vários estados de doença, incluindo câncer 2,3,4. Ao longo dos anos, inúmeras técnicas foram desenvolvidas para permitir que os pesquisadores sondem a paisagem da cromatina mapeando regiões de acessibilidade à cromatina. Alguns deles incluem DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (isolamento assistido por formaldeído de elementos reguladores)6, MAPit (protocolo de acessibilidade à metiltransferase para modelos individuais)7 e o foco deste artigo, ATAC-seq (ensaio para cromatina acessível à transposase)8. O DNase-seq mapeia regiões acessíveis empregando uma característica fundamental da DNase, a saber, a digestão preferencial de DNA nu livre de histonas e outras proteínas, como fatores de transcrição5. O FAIRE-seq, semelhante ao ChIP-seq, utiliza reticulação e sonicação de formaldeído, exceto que não há imunoprecipitação envolvida, e as regiões livres de nucleossomos são isoladas por extração de fenol-clorofórmio6. O método MAPit utiliza uma metiltransferase GC para sondar a estrutura da cromatina na resolução de molécula única7. ATAC-seq baseia-se na transposase hiperativa, Tn58. A transposase Tn5 liga-se preferencialmente a regiões de cromatina abertas e insere adaptadores de sequenciamento em regiões acessíveis. O Tn5 opera através de um mecanismo de "cortar e colar" mediado por DNA, pelo qual a transposase pré-carregada com adaptadores se liga a locais de cromatina abertos, corta o DNA e liga-se aos adaptadores8. As regiões ligadas a Tn5 são recuperadas por amplificação por PCR usando primers que recozidos para esses adaptadores. FAIRE-seq e DNase-seq requerem uma grande quantidade de material de partida (~100.000 células a 225.000 células) e uma etapa de preparação de biblioteca separada antes do sequenciamento9. Por outro lado, o protocolo ATAC-seq é relativamente simples e requer um pequeno número de células (<50.000 células)10. Ao contrário das técnicas FAIRE-seq e DNase-seq, a preparação da biblioteca de sequenciamento do ATAC-seq é relativamente fácil, pois a amostra de DNA isolada já está sendo marcada com os adaptadores de sequenciamento por Tn5. Portanto, apenas a etapa de amplificação por PCR com primers apropriados é necessária para concluir a preparação da biblioteca, e as etapas de processamento prévias, como reparo final e ligadura do adaptador, não precisam ser realizadas, economizando tempo11. Em segundo lugar, o ATAC-seq evita a necessidade de conversão, clonagem e amplificação de bissulfito com primers específicos da região necessários para o MAPit7. Devido a essas vantagens, o ATAC-seq tornou-se um método extremamente popular para definir regiões abertas de cromatina. Embora o método ATAC-seq seja simples, várias etapas exigem otimização para obter dados de alta qualidade e reprodutíveis. Este manuscrito discute procedimentos de otimização para a preparação padrão da biblioteca ATAC-seq, destacando especialmente três parâmetros: (1) composição do tampão de lise, (2) concentração de transposase Tn5 e (3) número de células. Além disso, este artigo fornece dados de exemplo das condições de otimização usando células epiteliais aderentes cancerosas e não cancerosas.
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Protocol
1. Preparações antes do início da experiência
- Preparar o depósito regulador de lise.
NOTA: O buffer de isolamento nuclear ideal pode ser diferente para cada tipo de célula. Recomendamos testar tanto o tampão hipotônico utilizado no artigo original8 quanto um tampão CSK12,13 para cada tipo de célula usando a coloração azul de tripano.- Para preparar o tampão hipotônico (tampão Greenleaf), misture 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 e 0,1% NP-40.
- Para preparar o tampão CSK, misture 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 3 mM MgCl2 e 0,1% Triton X-100.
- Garantir que as condições de cultura celular sejam ótimas; examinar as células sob um microscópio de luz para se certificar de que não há níveis elevados de apoptose.
- Ligue a centrífuga para que atinja 4 °C.
2. Colheita de células
- Aspirar meios de uma cultura de células com <80% de confluência. As células são tipicamente cultivadas em um prato de 35 mm ou 60 mm, com base no número de células necessárias, tratamentos, etc.
- Lave as células com 1 mL ou 3 mL de PBS.
- Adicione 0,5 mL ou 1 mL de tripsina e incube por 2-3 min (dependendo dos tipos de células). Use cuidadosamente uma pipeta de 1 mL para misturar bem.
- Adicione 1 mL ou 2 mL de meio ao prato e misture bem. Transferir para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células em um tubo de 15 mL por 3 min a 300 x g.
NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células. - Aspirar o meio e ressuspender as células em 1 mL ou 2 mL de meio.
NOTA: É fundamental preparar uma solução homogênea de célula única. Para tecidos, um homogeneizador Dounce pode ser usado para homogeneizar tecidos e minimizar grandes aglomerados de células ou agregados. Alguns tecidos requerem filtração (por exemplo, filtros celulares) e/ou classificação celular FACS para isolar células viáveis e obter uma única solução celular. - Conte as células usando um contador de células.
NOTA: Neste estudo, foi utilizado um contador de células automatizado (Tabela de Materiais). - Centrifugar o volume celular necessário (por exemplo, um volume contendo 1 x 106 células com base na contagem de células) a 300 x g durante 3 min à temperatura ambiente (RT).
- Ressuspeite o pellet celular contendo 1 x 106 células em 1 mL de PBS frio.
NOTA: Se o número de células for inferior a 1 x 10 6 células, diminua o volume PBS frio para preparar a solução celular na mesma concentração (1 x 106 células/mL).
3. Lise celular
- Transfira 25 μL (= 2,5 x 104 células) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C e eliminar cuidadosamente o sobrenadante
NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células. Deixe cerca de 3 μL de sobrenadante para garantir que as células não estão sendo descartadas. - Adicione 25 μL de tampão de lise e ressuspenda as células por pipetagem suave para cima e para baixo. Incubar no gelo por 5 min
- Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.
NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células. Deixe cerca de 3 μL de sobrenadante para garantir que as células não estão sendo descartadas.
4. Marcação Tn5
- Ressuspender imediatamente o pellet em 25 μL de mistura de reacção Tn5. A mistura de reação Tn5 é a seguinte: 12,5 μL de 2x tampão de DNA de tagmentação (tampão TD), 1,25-5 μL de transposase Tn5 e 11,25-7,5 μL de água livre de nuclease.
NOTA: A concentração padrão de Tn5 é de 2,5 μL para 2,5 x 104 células. - Incubar durante 30 min a 37 °C.
NOTA: Misture a solução a cada 10 minutos.
5. Purificação do DNA
NOTA: A purificação é necessária antes da amplificação. A purificação do DNA é feita usando o kit de purificação MinElute PCR (Tabela de Materiais).
- Adicionar 5 μL de acetato de sódio 3 M (pH 5,2).
- Adicione imediatamente 125 μL de Buffer PB e misture bem.
- Siga o protocolo do kit de purificação por PCR a partir da etapa 2.
- Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta de 2 mL.
- Aplicar a amostra na coluna de rotação e na centrífuga durante 1 min a 17.900 x g a RT.
- Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação de volta no mesmo tubo de coleta.
- Adicionar 750 μL de Buffer PE à coluna de rotação e centrifugar durante 1 min a 17.900 x g a RT.
- Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação de volta no mesmo tubo de coleta.
- Centrifugar a coluna de rotação por 5 minutos para secar completamente a membrana.
- Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação em um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
- Eluir os fragmentos de DNA com 10 μL de tampão EB.
- Deixe a coluna repousar por 1 min em RT.
- Centrífuga por 1 min a 17.900 x g em RT para eluír o DNA.
6. Amplificação por PCR
NOTA: A amplificação por PCR de DNAs transpostos (marcados) é necessária para o sequenciamento. Os adaptadores de kit Nextera (Tabela de Materiais) foram usados neste exemplo. Os primers utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1.
- Configure a seguinte reação de PCR em tubos de PCR de 200 μL (50 μL para cada amostra). A mistura de reação de PCR é a seguinte: 10 μL de DNA eluído (etapa 5.), 2,5 μL de 25 mM Adapter 1, 2,5 μL de 25 mM Adapter 2, 25 μL de 2x PCR master mix e 10 μL de água livre de nuclease
- Executar o programa de amplificação por PCR parte 1 (Tabela 2).
NOTA: Para a amplificação inicial, as mesmas condições são usadas para todas as amostras que usam um termociclador padrão. - QPCR em tempo real (total de 14,5 μL por amostra)
- Usando 5 μL do produto da parte 1 de amplificação de PCR (etapa 6.2.), configure a seguinte reação, desta vez incluindo ouro SYBR e detecção em uma máquina de PCR em tempo real.
- Preparar a mistura de reação de PCR da seguinte forma: 5 μL de produto de PCR da etapa 6.2., 0,75 μL de ouro SYBR (diluído 1000x), 5 μL de mistura mestre de PCR 2x e 3,75 μL de água livre de nuclease.
NOTA: Os números de ciclo precisos para amplificação de biblioteca antes de atingir a saturação para cada amostra são determinados por qPCR (Tabela 3) para reduzir o viés de GC e tamanho na PCR10. O SYBR Gold foi diluído com água isenta de nuclease. Para a confecção da solução diluída, 1 μL de SYBR Gold (concentração estoque de 10.000x) foi adicionado a 999 μL de água isenta de nuclease. O tempo de execução do RT-qPCR mencionado na Tabela 3 é de cerca de 60 min.
- Determine o número necessário de ciclos de PCR adicionais usando os parâmetros de execução da etapa 6.3.
- Número de ciclos = 1/4 de intensidade máxima (saturada) de fluorescência (tipicamente 3 ou 4 ciclos de PCR)
- Programa de amplificação por PCR parte 2 (volume = 45 μL; Tabela 4): Depois de determinar o número do ciclo, configure os PCRs com ciclos adicionais calculados na etapa 6.4.1. Por exemplo, se o número de ciclo calculado for 3, configure 3 ciclos no programa abaixo. O total de ciclos seria 8 (5 na etapa 6.2., mais 3 ciclos adicionais na etapa 6.5.)
7. Purificação de contas
NOTA: Aqui, foram utilizadas contas AMPure XP (Table of Materials).
- Aos produtos de PCR amplificados na etapa anterior, adicione 150 μL de contas em RT.
NOTA: As contas caseiras AMPure14 podem ser usadas neste processo. - Incubar por 15 min no RT.
- Coloque os tubos em um suporte magnético por 5 min.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante.
- Lave as contas com 200 μL de etanol a 80%.
NOTA: 80% de etanol deve ser preparado fresco. - Repita a etapa 7.4.
- Remova o etanol completamente.
- Secar as amostras ao ar por 10 min no RT.
- Ressuspender com 50 μL de tampão de eluição (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
- Repita a purificação das esferas (etapas 7.1.-7.9.) para minimizar ainda mais a contaminação do primer.
8. Concentração de DNA e verificação de qualidade
- Meça a concentração de DNA usando um kit de quantificação de ácido nucleico (Tabela de Materiais).
- Verifique os fragmentos de DNA amplificados por eletroforese em gel usando SYBR Gold (0,5x TBE, gel de agarose a 1,5%) ou um sistema de eletroforese automatizado (por exemplo, TapeStation, bioanalisador).
9. Sequenciamento
- Realizar o sequenciamento de alto rendimento utilizando as amostras de DNA amplificado12,13.
NOTA: As amostras de DNA amplificado estão prontas para sequenciamento de alto rendimento. Para reter informações de fragmentos de DNA nucleossomal, recomenda-se o sequenciamento de extremidade emparelhada sobre o sequenciamento de extremidade única. Ambas as extremidades dos fragmentos de DNA indicam onde a transposase se liga. Para mapear regiões abertas de cromatina, 30 milhões de leituras/amostra são normalmente suficientes.
10. Análise dos dados
- Filtragem de dados com base na qualidade da chamada base: Defina a pontuação média mínima de qualidade da base para 20 (99% de precisão).
- Aparamento do adaptador: remova as sequências do adaptador usando uma ferramenta apropriada.
Observação : A ferramenta wrapper Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) foi usada para remover sequências de adaptador. Para bibliotecas ATAC-seq preparadas pelo Illumina Tn5, a seguinte sequência é usada como uma sequência adaptadora: CTGTCTCTTATACACATCT. O comprimento mínimo da sequência para reconhecer a contaminação do adaptador é definido como 5. - Mapeamento do genoma: Mapeie as leituras para o genoma apropriado com Bowtie usando os seguintes parâmetros "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Um exemplo de mapeamento da qualidade das células basais de câncer de mama MDA-MB-231 está abaixo:
Leituras com pelo menos um alinhamento relatado: 52,79%
Leituras que não conseguiram alinhar: 13,10%
Leituras com alinhamentos suprimidos devido a -m: 34,11% - Eliminação de duplicação: Marque as duplicatas de PCR pelas ferramentas Picard16.
- Gerando um arquivo de cobertura de genoma para visualização de dados: converta as leituras de extremidade emparelhadas desduplicadas em fragmentos de leitura de extremidade única. Os rastros de cobertura do genoma são obtidos utilizando-se o genomeCoverageBed from bedtools17.
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Representative Results
Para obter dados ATAC-seq bem-sucedidos e de alta qualidade, é importante otimizar as condições experimentais. A preparação da biblioteca ATAC-seq pode ser separada em cinco etapas principais (Figura 1), a saber, lise celular, tagmentação (fragmentação e inserção do adaptador por Tn5), purificação do DNA genômico, amplificação por PCR e análise de dados. Como um processo inicial, o tampão de lise celular (isolamento nuclear) deve ser primeiro otimizado para cada tipo de célula. O tampão hipotônico descrito no artigo original ATAC-seq8 ou o tampão CSK12,13 foi usado para lisar células de câncer de mama. A coloração azul de tripano pode ser utilizada para confirmar o isolamento dos núcleos18. Para a preparação da biblioteca ATAC-seq em linhagens celulares de câncer humano, como MDA-MB-231, T47D, MCF7 e células A375, o tampão CSK tem sido usado por vários grupos12,13,19,20. O tampão CSK também foi utilizado para a preparação da biblioteca ATAC-seq em outros tipos de células, como células-tronco embrionárias 21,22 e células Drosophila S2 23. Para a otimização do tampão de lise, a coloração azul de tripano é útil para avaliar a eficiência da lise celular. Quando NMuMG, células epiteliais da glândula mamária de camundongos não cancerosas, foram tratadas com o tampão hipotônico8 (ver etapa 1) e o tampão CSK, observou-se maior eficiência de lise celular em células tratadas com CSK (Figura 2). Para tecidos congelados, o Omni-ATAC demonstrou melhorar os sinais ATAC-seq24. No Omni-ATAC, um tampão contendo 0,1% NP40, 0,1% Tween-20 e 0,01% Digitonina é usado para lise celular. Embora o tampão baseado em Digitonina seja conhecido por diminuir a fração de DNA mitocondrial, as relações sinal-ruído e as contagens de leitura de TSS de ATAC-seq com tampão CSK mostraram-se melhores do que as de Omni-ATAC em células de câncer de mama12. Portanto, o restante deste manuscrito é focado principalmente nos resultados dos dados ATAC-seq com buffer CSK.
Após a determinação das melhores condições de tampão de lise celular (isolamento nuclear), é importante otimizar as razões entre o número de células de entrada e a concentração de transposase de Tn512,25. Normalmente, a concentração de Tn5 pode ser titulada variando o volume de Tn5 de 1,25 μL, 2,5 μL a 5 μL em um volume total de mistura de reação de 25 μL. Alternativamente, os números de células de entrada podem ser alterados (por exemplo, de 10.000 para 100.000), mantendo a enzima Tn5 inalterada em 2,5 μL para otimizar a reação de marcação Tn5. Para avaliar a qualidade das bibliotecas ATAC-seq e a eficiência da digestão de cromatina induzida por Tn5, os produtos de PCR da biblioteca podem ser analisados por eletroforese em gel de agarose. A Figura 3 mostra exemplos de bibliotecas ATAC-seq bem-sucedidas. Normalmente, a amplificação por PCR de 8 ou 9 ciclos (ciclos totais de PCR, incluindo PCR inicial) resulta em concentração de biblioteca ATAC-seq de 3-6 ng/μL. Como a Tn5 "ataca" preferencialmente regiões livres de nucleossomos na cromatina aberta (Figura 1), as escadas de nucleossomo devem ser óbvias na imagem em gel (Figura 3). O brometo de etídio ou SYBR Gold pode ser usado para detectar DNAs amplificados no gel de agarose.
Em seguida, a análise de qPCR usando bibliotecas ATAC-seq pode ser usada para verificar brevemente a qualidade das bibliotecas e o enriquecimento de fragmentos em regiões abertas da cromatina, como promotores de genes ativos (Figura 4). Os primers podem ser projetados para gerar amplificadores de <80 pb usando promotores de genes ativos conhecidos como controles positivos e regiões de cromatina "fechadas" (inativas) conhecidas como controles negativos (Figura 4A). Dentre as condições testadas, observou-se maior enriquecimento nas bibliotecas ATAC-seq T47D com buffer CSK (Figura 4B). Como esperado, encontramos maior enriquecimento utilizando os primers K e L na região promotora do gene do Receptor de Estrogênio alfa (ESR1) em relação a uma região fechada a montante da ESR1 com primer C (Figura 4B)26. A Figura 5 mostra exemplos de dados ATAC-seq com diferentes concentrações de Tn5 (25.000 células foram usadas). Nesse caso, o maior ruído de fundo foi detectado na condição mais baixa (1,25 μL de Tn5) Tn5 (Figura 5, barras verticais). Dados ATAC-seq de 2,5 μL ou 5 μL de Tn5 mostraram níveis semelhantes de sinais ATAC-seq em regiões abertas de cromatina com sinais de fundo mais baixos. Considerando a potencial superdigestão por Tn5 na concentração mais alta, pode-se concluir que 2,5 μL de Tn5 é adequado para este tipo de célula.
Também foi realizado o ATAC-seq utilizando diferentes números celulares em células NMuMG, frequentemente utilizados para estudar a transição epitelial-mesenquimal (Figura 6). Para otimizar o volume inicial, quatro números de células diferentes (25.000, 50.000, 75.000 e 100.000) foram usados para a otimização da biblioteca ATAC-seq. As células foram lisadas com tampão CSK e os núcleos incubados com 2,5 μL de Tn5 transposase em 25 μL da mistura reacional. Para explorar a eficácia da digestão de Tn5 e das escadas nucleossômicas, a distribuição de tamanho dos DNAs inseridos foi analisada bioinformaticamente (Figura 6A). Quando menores números celulares foram usados, fragmentos de DNA livre de nucleossomos (<100 pb) foram mais enriquecidos nos dados de sequenciamento. Por outro lado, a fração de fragmentos de DNA mononucleossomal (175-225 pb) foi menor nas amostras de baixa entrada celular (25.000 células e 50.000 células) em comparação com condições de entrada celular mais altas (75.000 células e 100.000 células). Embora tenham sido observados padrões diferenciais de fragmentos de DNA entre as amostras, o número de células de entrada parece ter um impacto mínimo no enriquecimento dos sinais ATAC-seq em promotores e outras regiões abertas da cromatina (Figura 6B). Para investigar melhor o impacto do número de células de entrada na análise a jusante, foram definidos picos ATAC-seq. Os picos ATAC-seq foram determinados pelo programa de chamada de pico PeaKDEck27 usando os seguintes parâmetros: -sig 0,0001 -bin 300 -back 3,000 -npBack 2,500,000. De ~4,9 milhões de leituras exclusivamente mapeadas, 38.878, 43.832, 41.509 e 45.530 picos foram observados em dados ATAC-seq de 25.000, 50.000, 75.000 e 100.000 entradas de células, respectivamente. A condição de entrada de 100.000 células mostrou o maior número de picos. Como o escore de enriquecimento do Transcription Start Site (TSS) tem sido usado para avaliar a qualidade dos dados ATAC-seq, o escore TSS de cada condição ATAC-seq foi calculado usando o programa GitHub: Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28. Os escores do TSS para as condições de entrada de 25.000, 50.000, 75.000 e 100.000 células foram 9,03, 9,02, 8,82 e 8,28, respectivamente (o escore de enriquecimento do TSS é considerado ideal se for maior que 728). Isso indicou uma diminuição gradual no escore de enriquecimento da SST com o aumento do número de células. Enquanto o maior número de pico foi observado na condição de entrada de 100.000 células, a condição de entrada de 25.000 células deu uma pontuação melhor de SST. A análise de anotação de pico por Homer29 indicou que a maioria dos picos aumentados é categorizada como picos distais promotores (Figura 6C). Com base nesses resultados, pode-se concluir que as entradas de maior número de células podem produzir um maior número de picos e detectar com mais frequência picos não promotores em comparação com as entradas de menor número de células nessa condição.
Figura 1: Esboço do método ATAC-seq. (A) O ATAC-seq mede a acessibilidade à cromatina usando uma transposase Tn5 hiperativa pré-carregada com adaptadores para frente e para trás. As várias etapas do processo incluem (B) lise celular (incluindo otimização da composição do tampão de lise, titulação de Tn5 e o número de células usadas); (C) transposição (ligação de Tn5 à cromatina aberta/acessível); D) Etiquetagem da cromatina; (E) purificação de fragmentos de DNA e amplificação de bibliotecas, e (F) sequenciamento de bibliotecas e análise de dados. A análise da distribuição do comprimento dos fragmentos das bibliotecas ATAC-seq normalmente mostra um pico inicial em torno de ~ 50 pb (regiões livres de nucleossomos) e outro pico em ~ 200 pb (mononucleossomo). Portanto, sem filtração computacional ou experimental de tamanho, os sinais ATAC-seq contêm regiões livres de nucleossomos e nucleossomas na cromatina aberta. Criado com BioRender.com. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação da eficiência de lise celular utilizando azul de tripano. (A) As células NMuMG foram tratadas com o tampão hipotônico8 e coradas com azul de tripano. (B) As células NMuMG foram tratadas com tampão CSK e coradas com azul de tripano. As barras de escala indicam 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise de fragmentos de DNA amplificados de bibliotecas ATAC-seq. As bibliotecas ATAC-seq foram preparadas a partir de células de câncer de mama MDA-MB-231. (A) Após a amplificação por PCR, os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose a 0,5x TBE e 1,5% antes e após a purificação das contas. Os primers são removidos principalmente pela purificação inicial das contas. Padrões de banda de DNA de (B) 1x TAE, eletroforese em gel de agarose a 1% e (C) eletroforese automatizada também são indicados. O SYBR Gold foi utilizado para visualizar os fragmentos de DNA mostrados em A e B. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise de enriquecimento das bibliotecas ATAC-seq . (A) Trilha do navegador do genoma mostrando o locus ESR1. A cobertura do genoma dos dados ATAC-seq em células T47D20 é mostrada. Foram utilizados cartilhas de uma publicação anterior26, e suas regiões-alvo são destacadas em amarelo. (B) Gráfico de barras representando o enriquecimento do primer amplicon em bibliotecas ATAC-seq. As bibliotecas ATAC-seq foram preparadas pelo buffer hipotônico ou buffer CSK. Diferentes concentrações de Tn5 também foram usadas para gerar bibliotecas ATAC-seq. 1 ng de cada biblioteca foi utilizado para a realização da qPCR. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Visualização do navegador do genoma para otimização ATAC-seq. Diferentes quantidades de transposase Tn5 foram adicionadas durante a preparação da biblioteca. A condição de 1,25 μL de Tn5 mostra sinais de fundo mais altos (destacados em amarelo), enquanto as outras duas condições parecem semelhantes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Distribuição do tamanho do fragmento de DNA das bibliotecas ATAC-seq. (A) As bibliotecas ATAC-seq foram preparadas usando os números celulares indicados. Os dados ATAC-seq da condição de entrada de 25.000 células mostraram o maior enriquecimento de fragmentos livres de nucleossomos, enquanto a condição de entrada de 100.000 células apresentou os DNAs mononucleossômicos mais altos. (B) Rastreia o navegador do genoma mostrando dados ATAC-seq de diferentes números de células. (C) Análise de anotação de pico de Homero. Cada pico foi classificado como pico promotor-proximal ou distal por Homer29. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Seqüenciar |
| ESR1 C Forward | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C Reverso | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K Avançar | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K Reverso | TGTCTCTCTTTCTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L para a frente | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L Reverso | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Tabela 1: Lista de primers utilizados neste estudo.
| Passos | Temperatura | Hora | Ciclo |
| Preenchimento de lacunas | 72 °C | 5 min | 1 |
| Desnaturação Inicial | 98 °C | 30 s | 1 |
| Desnaturação | 98 °C | 10 s | 5 |
| Recozimento | 63 °C | 30 s | |
| Extensão | 72 °C | 1 min | |
| Segurar | 4 °C | eternamente |
Tabela 2: Programa de amplificação por PCR parte 1.
| Passos | Temperatura | Ciclo |
| Desnaturação Inicial | 98 °C 30 s | 1 |
| Desnaturação | 98 °C 10 s | 20 |
| Recozimento | 63 °C 30 s | |
| Extensão | 72 °C 1 min | |
| Leitura da placa |
Tabela 3: Configurações de qPCR.
| Passos | Temperatura | Hora | Ciclo |
| Desnaturação Inicial | 98 °C | 30 s | 1 |
| Desnaturação | 98 °C | 10 s | Total de ciclos calculados na etapa 6.4 |
| Recozimento | 63 °C | 30 s | |
| Extensão | 72 °C | 1 min | |
| Segurar | 4 °C | eternamente |
Tabela 4: Programa de amplificação por PCR parte 2.
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Discussion
ATAC-seq tem sido amplamente utilizado para mapear regiões de cromatina abertas e ativas. A progressão das células cancerígenas é frequentemente impulsionada por alterações genéticas e reprogramação epigenética, resultando em acessibilidade alterada da cromatina e expressão gênica. Um exemplo dessa reprogramação é visto durante a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e seu processo reverso, a transição mesenquimal-epitélica (MET), que são conhecidos por serem os principais processos de reprogramação celular durante a metástase tumoral30. Outro exemplo é a aquisição de resistência medicamentosa contra terapias hormonais é frequentemente observada em tumores de mama luminais31. O ATAC-seq é útil para monitorar tais alterações fenotípicas celulares no nível da cromatina e pode ser usado para prever uma célula de origem e subtipos de câncer4.
Para medir com precisão o remodelamento da cromatina por ATAC-seq, é necessário o estabelecimento de um protocolo reprodutível e consistente. Neste manuscrito, uma estratégia padrão para otimização da biblioteca ATAC-seq é descrita. Os dados ATAC-seq das linhagens celulares MDA-MB-231 e NMuMG são usados como exemplos de processos de otimização. As células NMuMG têm sido usadas para estudar EMT, e as células MDA-MB-231 têm sido usadas para estudar seu processo reverso, o MET. Esses modelos celulares já foram utilizados anteriormente para estudar alterações epigenéticas durante EMT e MET 13,32. O uso de um tampão apropriado para lise celular e concentração de Tn5 é o componente-chave da preparação bem-sucedida da biblioteca ATAC-seq. Além desses componentes, uma alta porcentagem (>90%) de viabilidade celular, concentrações adequadas de detergente no tampão de lise e a preparação da suspensão unicelular também são muito importantes. Quando a eficiência da digestão de Tn5 é significativamente diferente entre as amostras, é um desafio corrigir as variações de dados. Isso se deve à falta de controles internos e externos para avaliar quantitativamente a eficiência da digestão. As características ou propriedades celulares também podem ser diferentes entre as células do grupo controle versus as células do grupo de teste. Portanto, é necessária uma consideração cuidadosa das condições experimentais, incluindo a escolha do tampão de lise, para obter dados ATAC-seq de alta qualidade de ambos os grupos experimentais (Figura 5 e Figura 6).
Além do perfil aberto da cromatina, o ATAC-seq tem sido utilizado para identificar pegadas do fator de transcrição e posicionamento do nucleossomo 8,33. É importante notar que tais informações são derivadas principalmente de regiões abertas da cromatina (Figura 1F). Portanto, os resultados seriam tendenciosos para regiões abertas de cromatina. No entanto, o ATAC-seq é uma ferramenta poderosa para estudar a arquitetura da cromatina. Esta ferramenta revolucionária foi mais recentemente adotada para a genômica de célula única e continua a contribuir para melhorar nossa compreensão da regulação gênica e da biologia da cromatina.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Os dados apresentados neste protocolo estão disponíveis no Gene Expression Omnibus sob o Número de Adesão GSE202791. Os dados ATAC-seq do GSE72141 e GSE99479 também foram utilizados na análise.
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Disclosures
Os autores declaram que não há interesses financeiros relevantes ou materiais que se relacionem com a pesquisa descrita neste artigo.
Acknowledgments
Agradecemos à instalação da UND Genomics Core pela excelente assistência técnica.
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [P20GM104360 a M.T., P20 GM104360 a A.D.] e fundos iniciais fornecidos pela Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade de Dakota do Norte, Departamento de Ciências Biomédicas [a M.T.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
References
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