Summary
تصف هذه الورقة تطبيق المعدات الآلية لفصل وجمع المواد بسهولة وكفاءة ، مثل الحمض النووي الخالي من الخلايا والخلايا السرطانية المنتشرة ، من الدم الكامل.
Abstract
في الآونة الأخيرة ، تم استخدام الخزعات السائلة لتشخيص الأمراض المختلفة ، بما في ذلك السرطان. تحتوي سوائل الجسم على العديد من المواد ، بما في ذلك الخلايا والبروتينات والأحماض النووية الناشئة من الأنسجة الطبيعية ، ولكن بعض هذه المواد تنشأ أيضا من المنطقة المريضة. يلعب فحص وتحليل هذه المواد في سوائل الجسم دورا محوريا في تشخيص الأمراض المختلفة. لذلك ، من المهم فصل المواد المطلوبة بدقة ، ويتم تطوير العديد من التقنيات لاستخدامها لهذا الغرض.
لقد قمنا بتطوير نوع مختبر على قرص من الأجهزة والنظام الأساسي المسمى CD-PRIME. هذا الجهاز آلي وله نتائج جيدة لتلوث العينات واستقرار العينة. علاوة على ذلك ، فهي تتمتع بمزايا عائد الاستحواذ الجيد ، ووقت التشغيل القصير ، وقابلية التكاثر العالية. بالإضافة إلى ذلك ، اعتمادا على نوع القرص المراد تركيبه ، يمكن فصل البلازما التي تحتوي على الحمض النووي الخالي من الخلايا أو الخلايا السرطانية المنتشرة أو خلايا الدم الطرفية أحادية النواة أو المعاطف المفرغة. وبالتالي ، يمكن الحصول على مجموعة متنوعة من المواد الموجودة في سوائل الجسم لمجموعة متنوعة من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك دراسة omics.
Introduction
يعد الكشف المبكر والدقيق عن الأمراض المختلفة ، بما في ذلك السرطان ، أهم عامل في وضع استراتيجية العلاج1،2،3،4. على وجه الخصوص ، يرتبط الكشف المبكر عن السرطان ارتباطا وثيقا بزيادة فرص البقاء على قيد الحياة للمريض5،6،7،8. في الآونة الأخيرة ، كانت الخزعات السائلة في دائرة الضوء للكشف المبكر عن السرطان. تخضع الأورام الصلبة لتكوين الأوعية الدموية وتطلق مواد مختلفة في الدم. على وجه الخصوص ، تم العثور على الحمض النووي المتداول (ctDNAs) ، والحمض النووي الريبي المتداول (ctRNAs) ، والبروتينات ، والحويصلات مثل exosomes ، والخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) في دم مرضى السرطان 2,9. على الرغم من وجود اختلافات في كمية هذه المواد ، إلا أنها تلاحظ باستمرار ليس فقط في المراحل المبكرة ولكن أيضا في المراحل اللاحقة 6,10. ومع ذلك ، فإن هذه الفروق الفردية عالية جدا. على سبيل المثال ، كمية الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) التي تحتوي على ctDNA أقل من 1,000 نانوغرام ، وعدد CTCs أقل من 100 في 10 مل من الدم الكامل من مرضى السرطان11،12،13. وصفت العديد من الدراسات السرطان باستخدام هذه المواد الموجودة بكميات أقل (أي cfDNA و ctDNA و CTCs). للحصول على نتائج دقيقة ، من المهم فصل كميات صغيرة من المواد بدقة عالية النقاء13,14. تستخدم طرق الطرد المركزي التقليدية بشكل شائع ، ولكن يصعب التعامل معها ولها نقاء منخفض اعتمادا على مهارة المستخدم. منذ اكتشاف CTCs ، تم تطوير العديد من تقنيات الفصل ، مثل الطرد المركزي أو فصل درجة الكثافة ، والمناعة ، وطرق الموائع الدقيقة. تم تطوير العديد من تقنيات الاحتواء منذ اكتشاف CTCs. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هذه التقنيات محدودة عندما يكون من الضروري عزل الخلايا عن الرقائق والأغشية المختلفة المستخدمة لعزلها15. أيضا ، تتطلب طرق وضع العلامات معدات مثل FACS ، وهناك حدود لعملية المصب بسبب تلوث العلامات.
في الآونة الأخيرة ، زاد استخدام الخزعات السائلة ، وتجري دراسات مختلفة للكشف المبكر عن السرطان. على الرغم من أن هذه الطريقة بسيطة ، إلا أنه لا تزال هناك صعوبات في التحليل النهائي ، وتحاول دراسات مختلفة التغلب على هذه الصعوبات16,17. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب العديد من المواقع ، بما في ذلك المستشفيات ، طرقا آلية وقابلة للتكرار وعالية النقاء ملائمة للاستخدام. هنا ، قمنا بتطوير مختبر على قرص للفصل الآلي للمواد من عينات الدم بعد خزعة سائلة. تعتمد هذه الأجهزة على مبدأ الطرد المركزي ، الموائع الدقيقة ، والتقاط الخلايا بحجم المسام. هناك ثلاثة أنواع من الأقراص: يمكن ل LBx-1 الحصول على البلازما ومعطف بافي ، بينما يمكن ل LBx-2 الحصول على البلازما و PBMC من الدم الكامل بحجم أقل من 10 مل ؛ يمكن ل FAST-auto أيضا الحصول على CTCs باستخدام غشاء قابل للإزالة من القرص. يمكن استخدام ما يصل إلى أربعة من كل قرص في تشغيل واحد. قبل كل شيء ، تتمثل ميزة هذا الجهاز والطريقة في أنه يمكنه الحصول على مجموعة متنوعة من المواد المشتقة من السرطان من نفس العينة باستخدام كمية صغيرة من الدم. هذا يعني أن دم المريض يحتاج إلى سحب مرة واحدة فقط. بالإضافة إلى ذلك ، لديها ميزة استبعاد الأخطاء بسبب الاختلافات في فترة أخذ عينات الدم. هذه المنصة سهلة الاستخدام وتوفر نتائج دقيقة للخزعات السائلة والتطبيقات النهائية. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم استخدام الجهاز والخرطوشة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على جميع عينات الدم الكاملة من مرضى سرطان الرئة. يتم إجراء البحث والتحليل في Clinomics من قبل معهد أبحاث جينوم السرطان ، وتقود موافقة الحكومة على أبحاث IRB لجنة المراجعة المؤسسية لمركز أسان الطبي (IRB NO. 2021-0802) مع رقم IRB المسجل للبحث في Clinomics.
1. إعداد عينة
- اجمع 9 مل من الدم الكامل في أنبوب جمع الدم المستقر EDTA أو cfDNA.
- امزج جيدا عن طريق قلب الأنبوب لأعلى ولأسفل حوالي 10 مرات.
- قم بتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة (RT ؛ للتخزين قصير الأجل) أو 4 درجات مئوية (للتخزين طويل الأجل). لا تجمد وتذوب.
2. إعداد الجهاز
- اضغط على مفتاح الطاقة لتشغيل الجهاز.
ملاحظة: تظهر شاشة تحميل على لوحة اللمس، ويتم تهيئة الجهاز. أبق يديك بعيدا عن الجهاز أثناء التهيئة. تظهر شاشة اختيار الخرطوشة بعد اكتمال تهيئة الجهاز. - حدد وضع العينة المراد استخدامه. قم بتغيير عدد العينات بالضغط على السهم.
3. تشغيل الجهاز وجمع العينات
- تحميل خرطوشة LBx-1
- حدد نوع الخرطوشة على لوحة شاشة اللمس الخاصة بالجهاز. قم بتغيير عدد العينات بالضغط على زر السهم.
- افتح باب الجهاز وأدخل جميع الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة. تأكد من إدخال الخرطوشة وحامل الخرطوشة بشكل صحيح. إذا لم يتم إدخال الخرطوشة بشكل صحيح ، فقد يتسبب ذلك في تلف كبير للأداة.
- للحصول على إجمالي أربع خراطيش ، ضع الخرطوشة الوهمية في المساحة الفارغة لحامل الخرطوشة.
- استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها.
- أغلق الباب واضغط على زر RUN على شاشة لوحة اللمس. تغلق الأداة الصمامات الموجودة على الخراطيش ، والتي تستغرق حوالي 30 ثانية.
- اتبع الرسالة لفتح الباب وإزالة عجلة الدعم وإزالة الخرطوشة المغلقة بالصمام من حامل الخرطوشة.
- ضع الخرطوشة على الطاولة واستعد لحقن عينة الدم بأكملها. ماصة بحد أقصى 10 مل من عينة الدم الكاملة باستخدام ماصة مصلية.
تنبيه: مخاطر التعامل مع الدم. خلال الإجراء الكامل للتعامل مع عينات الدم والكواشف ، من المهم ارتداء معطف المختبر والقفازات المختبرية. يجب دراسة MSDS المقدمة بدقة من قبل عمال المختبر. - أدخل طرف الماصة في عمق مدخل عينة الخرطوشة وحقن عينة الدم بأكملها ببطء.
ملاحظة عند استخدام أكثر من أو يساوي 9 مل من عينة الدم الكاملة ، لا يلزم إضافة محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). عند استخدام أقل من 9 مل من عينة الدم الكاملة ، أضف PBS لجعل الحجم الإجمالي 9 مل. على سبيل المثال ، عند استخدام 7.2 مل من الدم الكامل ، يرجى إضافة 1.8 مل من PBS إلى مدخل العينة. يمكن استخدام ماصة مصلية أو طرف ماصة لحقن الدم الكامل و PBS. عند استخدام أقل من 8 مل من عينة الدم الكاملة ، قد لا يتم استرداد معطف بافي حتى بإضافة 1 مل من PBS. لإعداد gDNA ، استخدم 200 ميكرولتر من الدم الكامل ، والذي تم فصله قبل هذه الخطوة. - أدخل الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة. استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها. أغلق الباب، ثم اضغط على الزر موافق ( OK ) .
ملاحظة: يتم فصل البلازما ومعطف بافي عن الدم الكامل تلقائيا ، الأمر الذي يستغرق حوالي 30 دقيقة.
تنبيه خطر أثناء العملية. يمكن أن يؤدي فتح الباب أو لمس الجهاز أثناء عمليات الدوران عالية السرعة إلى حدوث إصابات خطيرة. هناك أيضا خطر الإصابة بسبب التحميل غير المتماثل للدوار. في حالة حدوث اهتزازات وضوضاء غير عادية عند بدء الجهاز في إثراء الخلايا المساعدة أو وضع الخبير ، فقد يكون وضع الخرطوشة غير متماثل. اضغط على الفور على مفتاح التشغيل لإيقاف الخرطوشة وتثبيتها بشكل صحيح. - ابحث عن الرسالة التي تظهر على الشاشة مصحوبة بصوت إنذار ، والذي يظهر عند اكتمال فصل البلازما ومعطف بافي.
- أوقف المنبه عن طريق فتح الباب أو الضغط على زر STOP . افتح الباب ، وأزل الخرطوشة ، وضعها على الطاولة.
- استرجع 3 مل من البلازما من مخرج البلازما باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل. استرجع طبقة بافي 3 مل من مخرج المعطف بافي باستخدام طرف ماصة 1 مل.
- تحميل خرطوشة LBx-2
- حدد اسم الخرطوشة على لوحة شاشة اللمس الخاصة بالجهاز. قم بتغيير عدد العينات بالضغط على زر السهم.
- افتح الباب وأدخل الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة.
- للحصول على إجمالي أربع خراطيش ، ضع الخرطوشة الوهمية في المساحة الفارغة لحامل الخرطوشة.
- استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها. تأكد من إدخال الخرطوشة بشكل صحيح في حامل الخرطوشة. إذا لم يتم إدخال الخرطوشة بشكل صحيح ، فقد يتسبب ذلك في تلف كبير للأداة.
- أغلق الباب واضغط على زر RUN على شاشة لوحة اللمس. تغلق الأداة الصمامات الموجودة على الخرطوشة ، والتي تستغرق حوالي 30 ثانية.
- اتبع الرسالة لفتح الباب وإزالة عجلة الدعم وإزالة الخرطوشة المغلقة بالصمام من حامل الخرطوشة ووضعها على الطاولة.
- ضع الخرطوشة على الطاولة واستعد لحقن محلول تدرج الكثافة وعينة الدم بأكملها. تحقق من حجم محلول تدرج الكثافة و PBS المراد حقنه اعتمادا على حجم عينة الدم الكاملة (الجدول التكميلي 1).
- ماصة محلول تدرج الكثافة باستخدام ماصة مصلية. أدخل طرف الماصة بعمق في مدخل الخرطوشة وقم بحقن محلول تدرج الكثافة ببطء.
- بعد حقن محلول تدرج الكثافة ، ماصة عينة الدم بأكملها باستخدام ماصة مصلية. أدخل طرف الماصة في عمق مدخل عينة الخرطوشة وحقن عينة الدم بأكملها ببطء.
ملاحظة: عند استخدام أقل من 9 مل من عينة الدم الكاملة ، أضف برنامج تلفزيوني بالرجوع إلى هذا الجدول (الجدول التكميلي 1). - أدخل الخراطيش المراد استخدامها بالترتيب وفقا للرقم الموجود على حامل الخرطوشة. استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها. أغلق الباب، ثم اضغط على الزر موافق ( OK ) .
- يتم فصل البلازما و PBMC عن الدم الكامل تلقائيا ، الأمر الذي يستغرق حوالي 30 دقيقة. ابحث عن الرسالة التي تظهر مصحوبة بصوت إنذار ، عند اكتمال فصل البلازما و PBMC.
- أوقف المنبه عن طريق فتح الباب أو الضغط على زر STOP . افتح الباب ، وأزل الخرطوشة ، وضعها على الطاولة.
- استرجع 3 مل من البلازما من مخرج البلازما باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل. استرجع 3 مل من PBMC من منفذ PBMC باستخدام طرف ماصة 1 مل.
- تحميل خرطوشة FAST-auto
- حدد الخرطوشة على لوحة الشاشة التي تعمل باللمس الخاصة بالجهاز. قم بتغيير عدد العينات بالضغط على زر السهم.
- افتح الباب وأدخل الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة. للحصول على إجمالي أربع خراطيش ، ضع الخرطوشة الوهمية في المساحة الفارغة لحامل الخرطوشة.
- استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها.
- أغلق الباب واضغط على زر RUN على شاشة لوحة اللمس. تغلق الأداة الصمامات الموجودة على الخرطوشة ، والتي تستغرق حوالي 30 ثانية.
- اتبع الرسالة لفتح الباب وإزالة عجلة الدعم وإزالة الخرطوشة المغلقة بالصمام من حامل الخرطوشة.
- ضع الخرطوشة على الطاولة واستعد لحقن محلول PBS وعينة الدم الكاملة. ماصة 6 مل من محلول PBS باستخدام ماصة مصلية. أدخل طرف الماصة في عمق مدخل PBS للخرطوشة وحقن ببطء 6 مل من محلول PBS.
- بعد حقن محلول PBS ، ماصة 3 مل من الدم الكامل أو عينة PBMC التي تم الحصول عليها من LBx-2 باستخدام ماصة مصلية ، والتي تم شطفها مسبقا بنسبة 1٪ BSA لمنع الالتصاق بالبقايا. أدخل طرف الماصة في عمق مدخل عينة الخرطوشة وحقن عينة الدم بأكملها ببطء.
- أدخل الخراطيش المراد استخدامها بترتيب الرقم الموجود على حامل الخرطوشة. استخدم عجلة الدعم لتركيب الخرطوشة وإحكام ربط صامولة القفل لتثبيتها. أغلق الباب، ثم اضغط على الزر موافق ( OK ) .
- يتم إثراء CTCs من الدم الكامل تلقائيا ، الأمر الذي يستغرق حوالي 15 دقيقة. ابحث عن رسالة تظهر مصحوبة بصوت إنذار عند اكتمال إثراء CTCs. أوقف المنبه عن طريق فتح الباب أو الضغط على زر STOP .
- افتح الباب ، وأزل الخرطوشة ، وضعها على الطاولة. أدخل مزيل اللوحة الخلفية (BPR) في الثقوب الأربعة الموجودة في مقدمة الخرطوشة. اضغط على الجناح الأزرق الداكن بإبهام كلتا يديه ، ثم اضغط على الجسم الأزرق الفاتح حتى ينقر.
- قم بإزالة جسم الخرطوشة بعناية عن طريق رفعه لأعلى. التقط غشاء المرشح برفق شديد من الحافة باستخدام ملقط. يرجى التأكد من استخدام الحافة الخارجية (جزء الحافة العريضة 1 مم) لغشاء المرشح لقرص غشاء المرشح وتثبيته.
- ضع بعناية غشاء المرشح (الذي توجد عليه CTCs المخصبة) في أنبوب سعة 1.5 مل لتحضير الحمض النووي. إذا لزم الأمر ، قم باستعادة الدم المصفى إلى مخرج الدم باستخدام طرف ماصة 1 مل.
4. صيانة النظام
- التحضير لتنظيف وتطهير الأداة
- قم بتنظيف جميع الأسطح التي يمكن الوصول إليها للأداة والملحقات مرة واحدة في الأسبوع باستخدام الإيثانول والأنسجة المجففة ، وكذلك على الفور عند تلوثها.
- نظف الوعاء وعمود الدوار بانتظام باستخدام الكحول (الإيثانول والأيزوبروبانول) أو المطهرات الكحولية.
- تنظيف وتطهير الأداة
ملاحظة: للاطلاع على استكشاف الأخطاء وإصلاحها بشكل عام والملاحظات الأخرى الموجودة على الجهاز، راجع الجدول التكميلي 2.- قم بإيقاف تشغيل الجهاز باستخدام مفتاح الطاقة الرئيسي. افصل قابس الطاقة عن مصدر الطاقة.
- افتح الباب وقم بتنظيف وتطهير جميع الأسطح التي يمكن الوصول إليها للأداة ، بما في ذلك كابل الطاقة ، باستخدام قطعة قماش مبللة وعوامل التنظيف الموصى بها.
- افحص عمود الدوار بحثا عن التلف. افحص الأداة بحثا عن التآكل والتلف.
- قم بتوصيل الجهاز بمصدر الطاقة فقط إذا كان جافا تماما من الداخل والخارج.
- افصل قابس الطاقة الرئيسي وقم بإزالة حامل المصاهر. يقع حامل المصهر فوق مقبس الطاقة. استبدل المصهر المستخدم بآخر احتياطي من الحاوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الهدف من هذه التقنية هو عزل المواد المرتبطة بالسرطان بسهولة وبشكل تلقائي من الدم الكامل. على وجه الخصوص ، يمكن لأي شخص استخدام هذه التقنية في جميع مجالات البحث والتحليل المناسبة. يعد الفصل المتزامن والقابل للتكرار لمواد متعددة في عينة دم واحدة أمرا مهما في الخزعات السائلة. تستخدم أقراص LBx-1 و LBx-2 لعزل البلازما ومعطف بافي أو PBMC من الدم الكامل. يوضح الشكل 1 المواد المفصولة بواسطة تطبيق هذا الجهاز. أولا ، تم الحصول على البلازما من 10 مل من الدم باستخدام LBx-1 أو تم الحصول على PBMCs باستخدام LBx-2. ثانيا ، تم إعادة حقن 3 مل من معطف بافي المنفصل مع PBS في FAST-auto ، وتم ترشيح CTCs من خلال الغشاء. ثالثا ، تم نقل الغشاء إلى أنبوب مملوء بمخزن مؤقت للتخزين أو استخدامه على الفور للتلطيخ. بالنسبة للتطبيقات الأخرى أو التخزين طويل الأجل ، يمكن إزالة CTCs بسهولة من الغشاء عن طريق الدوامة.
تم استخراج cfDNA من البلازما باستخدام عزل الحمض النووي القائم على الخرزة المغناطيسية القادرة على التقاط حجم بحجم الحمض النووي عن طريق تركيز الخرزة. تم قياس تركيز ونقاء cfDNA باستخدام المحلل الحيوي. من المعروف أن تركيز cfDNA ، بما في ذلك ctDNA ، يختلف باختلاف نوع ومرحلة السرطان18. بالإضافة إلى ذلك ، يبلغ طول معظم cfDNA 166 نقطة أساس ، وبعضها يبلغ طوله مرتين أو ثلاث مرات. على الرغم من وجود اختلاف في الكمية التي تم الحصول عليها من كل عينة على حدة ، مثل 8.47 نانوغرام / مل و 5.2 نانوغرام / مل ، كانت نتائج استخراج cfDNA جيدة لكل من التركيز وتوزيع الحجم في جميع الحالات (الشكل 2). تشير هذه النتائج إلى أن طريقة LBx-1 تفصل بدقة البلازما المحتوية على cfDNA.
في FAST-auto ، تمت إزالة الغشاء وتلطيخه بالأجسام المضادة الفلورية للكشف عن CTCs وخلايا الدم البيضاء (WBCs). لوحظ الغشاء الملون الموضوع على شرائح زجاجية تحت مجهر مضان. أجريت دراسات تلطيخ ومجهرية بعد دراسة سابقة19. يمكن تمييز CTCs فقط على وجه التحديد باستخدام الأجسام المضادة EpCAM / Cytokeratin (علامة إيجابية CTC) و CD45 (علامة إيجابية WBC). التقط كل غشاء ما مجموعه 310 و 998 خلية على التوالي. من بينها ، تم حساب ما مجموعه 3 و 43 CTCs في العينات 1 و 2 ، على التوالي (الشكل 3). الطريقة المستخدمة في هذه الدراسة تجعل من السهل تحديد وجود وعدد CTCs. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام التغييرات في تركيز cfDNA ورقم CTC لمراقبة وجود وتكرار السرطان بسهولة في هذا المجال. على وجه الخصوص ، نظرا لأن هذه الطرق لا تستخدم كواشف أخرى قد تؤثر على النتائج ، فإن تجارب المصب ممكنة مع المواد التي تم الحصول عليها.
الشكل 1: سير عمل طريقة خلط القرص للفصل المتزامن للمواد من الدم الكامل . (أ) يتم الحصول على البلازما التي تحتوي على cfDNA. (ب) تتم إزالة CTCs من معطف بافي. (ج، د) بعد الدوامة ، يتم فصل CTCs عن الغشاء ، ولا تزال كمية صغيرة من CTC على الغشاء. يمكن أن تخضع كل من الخلايا التي تم الحصول عليها والغشاء للتخزين طويل الأجل عن طريق تجميد العينات في مخزن التخزين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: نقاء وكمية cfDNA المستخرج. تم تقييم cfDNAs المستخرجة باستخدام Bioanalyzer ، وتم استخدام أشرطة شاشة cfDNA مع سلم إلكتروني. تم استخدام الخط الأخضر للمحاذاة بين السلم (يسار) والعينة (يمين). تشير علامات المثلث إلى نطاق الحمض النووي. معظم cfDNA هو 166 bp ، وبعضها موجود في مضاعفات الطول الصحيحة. عادة ، يصل تركيز cfDNA إلى حجم 50 نقطة أساس إلى 700 نقطة أساس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: عد CTCs باستخدام تلطيخ الغشاء. بعد تلطيخ الكيمياء المناعية الغشائية ، تظهر الخلايا إشارات DAPI (إيجابية نووية) باللون الأزرق ، بينما يتم تمييز EpCAM / CK (CTCs إيجابية) و CD45 (إيجابية WBC) باللون الأخضر والأحمر ، على التوالي. تم قياس إشارات التألق باستخدام مجهر مضان. يشير شريط المقياس إلى 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول التكميلي 1: تكوين الحجم النهائي لاستخدام محلول تدرج الكثافة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 2: قضايا عامة وتحذيرات للصيانة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعتمد كمية وتركيز cfDNA و CTC على الفرد والمرحلة ونوع السرطان. كما يعتمد على حالة المريض2،4،5،10،20. على وجه الخصوص ، في المراحل المبكرة أو السرطانية ، تكون تركيزات المواد المرتبطة بالسرطان منخفضة للغاية ، لذلك هناك احتمال كبير أنه لا يمكن اكتشافها. ومع ذلك ، فإن الاكتشاف المبكر له تأثير إيجابي للغاية على بقاء المريض ووضع استراتيجية العلاج. نظرا لأن cfDNA و CTC لهما فترات نصف عمر قصيرة في الدم ، فإنهما يعكسان معلومات في الوقت الفعلي حول السرطان21،22،23،24،25. لذلك ، للحصول على العديد من المواد المرتبطة بالسرطان في وقت واحد ، هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الدم في ظل نفس الظروف. يوفر النظام الموضح هنا للمستخدمين طريقة بسيطة. يمكن للمستخدم اختيار واستخدام القرص المقابل للمادة المطلوبة من الدم الكامل. باستخدام إحدى الخراطيش المعطاة ، يمكن الحصول على البلازما التي تحتوي على cfDNA ، ويمكن جمع CTCs من نفس عينة الدم ، أو معطف بافي الضائع ، أو PBMC عن طريق إعادة الحقن في قرص FAST-auto (الشكل 1).
يعد التقاط CTC القائم على الحجم أمرا بسيطا ، ولكن له قيود على النقاء. هناك العديد من الأشكال والأحجام المختلفة للخلايا في الدم26. تختلف كرات الدم البيضاء في الحجم من 8 إلى 16 ميكرومتر27. في دراسة أخرى ، كان متوسط حجم WBC المقاس 9 ميكرومتر. من ناحية أخرى ، فإن الحد الأدنى لحجم CTCs المعزول هو 16 ميكرومتر ، ومتوسط الحجم هو 30 ميكرومتر28. علاوة على ذلك ، توجد CTCs بكمية صغيرة جدا في دم المريض مقارنة بخلايا الدم الأخرى. يعد تقليل تلوث كرات الدم البيضاء أمرا مهما لتحليلات المصب. على الرغم من أن الكشف القائم على الأجسام المضادة يمكن أن يلتقط CTCs ، إلا أن التحليل عالي الدقة مثل NGS يتطلب تقنيات انتقاء خلية واحدة إضافية أو مستوى عال من تحليل المعلوماتية الحيوية.
في الآونة الأخيرة ، تم تنفيذ طرق لمراقبة وجود CTCs بشكل حدسي قبل التحليل عالي الدقة باستخدام تقنيات التقاط مختلفة29. كما هو موضح في النتائج ، يمكن تلطيخ الغشاء المكتسب من خرطوشة FAST-auto مباشرة للكشف عن CTC. يمكن أيضا إعادة تعليق CTCs الملتقطة بسهولة من الغشاء عن طريق الدوامة للتخزين أو تطبيقات أخرى مثل زراعة الخلايا (الشكل 1).
تستخدم هذه الطريقة مبادئ الطرد المركزي وعلم الموائع الدقيقة. لذلك ، فإن توازن الجهاز والقرص مهم ، ومن المهم أيضا تأمينه بحامل القرص. من المهم ملء أي حجم إجمالي أولي غير كاف باستخدام برنامج تلفزيوني. إذا كان المبلغ الأولي غير كاف ، فقد تكون هناك مشكلة تؤدي إلى صعوبات في الانتقال إلى المساحة التالية. أخرج حامل القرص على سطح الطاولة لمنع تلوث الجهاز ونقل السوائل داخل القرص وخارجه. في حالة قرص FAST-auto ، قم بمعالجة العينات بسرعة لتقليل الضرر الذي يلحق ب CTC في الغشاء. على وجه الخصوص ، كن حذرا لمنع التلوث عند التعامل مع الغشاء واتباع البروتوكول المعمول به للتخزين طويل الأجل.
ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة سهلة الاستخدام ويمكنها معالجة عينة إلى أربع عينات في وقت واحد. أيضا ، يمكن الحصول على ركائز مختلفة من السائل ببساطة عن طريق استبدال القرص. علاوة على ذلك ، لا يلزم وجود كواشف إضافية بخلاف استخدام محلول تدرج الكثافة للحصول على PBMCs. لذلك ، فإن المواد التي تم الحصول عليها جيدة للاستخدام النهائي.
هذه الطريقة لا تزال لديها بعض القيود. لا يمكن للمستخدم تعديل القرص بشكل تعسفي ، ولا يمكن استخدام أنواع مختلفة من الأقراص في نفس الوقت. أيضا ، هناك حدود للحد الأقصى للحجم ، لذلك يجب استخدام أقراص متعددة لكميات كبيرة من الدم. لا تزال هناك حاجة إلى طرق إضافية للحصول على cfDNA. باستخدام الغشاء ، من الصعب الحصول على CTCs فقط باستخدام طريقة الالتقاط بحجم المسام. لذلك ، يلزم اختيار الخلية أو فرزها لتجارب التطبيقات الخاصة ب CTC.
هناك سوائل مختلفة في الجسم ، ويرتبط إنتاج بعض سوائل الجسم بالمرض30. حاليا ، تم استخدام سوائل الدم في الجسم فقط للتحليل. في المستقبل ، يمكن إنشاء بروتوكول مثالي من خلال تأكيد الأداء في سوائل الجسم المختلفة مثل البول والاستسقاء والسائل الجنبي والسائل الشوكي. لتوفير طريقة أكثر ملاءمة للمستخدمين ، يتم حاليا تطوير الأجهزة التي تستخرج cfDNA تلقائيا من القرص. علاوة على ذلك ، فإن المعدات القادرة على إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مباشرة داخل القرص بعد الاستخراج قيد التطوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا العمل.
Acknowledgments
تم دعم هذه المخطوطة جزئيا من قبل الصندوق الكوري لتطوير الأجهزة الطبية (KMDF، المنحة رقم. RS-2020-KD000019) والمعهد الكوري لتطوير الصناعة الصحية (KHIDI، رقم المنحة. HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
