Summary
Dette papir beskriver anvendelsen af automatiseret udstyr til nemt og effektivt at adskille og indsamle stoffer, såsom cellefrit DNA og cirkulerende tumorceller, fra fuldblod.
Abstract
For nylig er flydende biopsier blevet brugt til at diagnosticere forskellige sygdomme, herunder kræft. Kropsvæsker indeholder mange stoffer, herunder celler, proteiner og nukleinsyrer, der stammer fra normalt væv, men nogle af disse stoffer stammer også fra det syge område. Undersøgelsen og analysen af disse stoffer i kropsvæskerne spiller en afgørende rolle i diagnosen af forskellige sygdomme. Derfor er det vigtigt at adskille de krævede stoffer nøjagtigt, og der udvikles flere teknikker til dette formål.
Vi har udviklet en lab-on-a-disc type enhed og platform ved navn CD-PRIME. Denne enhed er automatiseret og har gode resultater for prøvekontaminering og prøvestabilitet. Desuden har det fordele ved et godt erhvervelsesudbytte, en kort driftstid og høj reproducerbarhed. Afhængigt af hvilken type disk der skal monteres, kan plasma, der indeholder cellefrit DNA, cirkulerende tumorceller, mononukleære celler i perifert blod eller buffy coats, adskilles. Således kan erhvervelsen af en række forskellige materialer, der er til stede i kropsvæskerne, udføres til en række downstream-applikationer, herunder undersøgelse af omics.
Introduction
Tidlig og præcis påvisning af forskellige sygdomme, herunder kræft, er den vigtigste faktor i etableringen af en behandlingsstrategi 1,2,3,4. Især tidlig påvisning af kræft er tæt forbundet med øgede overlevelseschancer for patienten 5,6,7,8. For nylig har flydende biopsier været i søgelyset for tidlig påvisning af kræft. Faste tumorer gennemgår angiogenese og frigiver forskellige stoffer i blodet. Især er cirkulerende DNA'er (ctDNA'er), cirkulerende RNA'er (ctRNA'er), proteiner, vesikler såsom exosomer og cirkulerende tumorceller (CTC'er) fundet i blodet hos kræftpatienter 2,9. Selv om der er forskelle i mængden af disse stoffer, observeres de konsekvent ikke kun i de tidlige stadier, men også i de senere stadier 6,10. Disse individuelle forskelle er imidlertid meget høje; for eksempel er mængden af cellefrit DNA (cfDNA) indeholdende ctDNA mindre end 1.000 ng, og antallet af CTC'er er mindre end 100 ud af 10 ml fuldblod fra kræftpatienter11,12,13. Mange undersøgelser har karakteriseret kræft ved hjælp af disse stoffer, der er til stede i mindre mængder (dvs. cfDNA, ctDNA og CTC'er). For at opnå nøjagtige resultater er det vigtigt nøjagtigt at adskille små mængder stoffer med høj renhed13,14. Konventionelle centrifugeringsmetoder er almindeligt anvendt, men de er vanskelige at håndtere og har lav renhed afhængigt af brugerens færdigheder. Siden opdagelsen af CTC'er er der udviklet flere separationsteknikker, såsom centrifugering eller densitetsseparation, immunoperler og mikrofluidiske metoder. Flere indeslutningsteknikker er blevet udviklet siden opdagelsen af CTC'er. Disse teknikker er imidlertid ofte begrænsede, når det er nødvendigt at isolere celler fra de forskellige chips og membraner, der bruges til at isolere dem15. Mærkningsmetoderne kræver også udstyr såsom FACS, og der er grænser for downstream-processen på grund af mærkning af forurening.
For nylig er brugen af flydende biopsier steget, og der udføres forskellige undersøgelser til tidlig påvisning af kræft. Selv om denne metode er enkel, er der stadig vanskeligheder med downstream-analyse, og forskellige undersøgelser forsøger at overvinde disse vanskeligheder16,17. Derudover kræver mange steder, herunder hospitaler, automatiserede, reproducerbare og metoder med høj renhed, der er praktiske at bruge. Her har vi udviklet et lab-on-a-disc til automatiseret adskillelse af stoffer fra blodprøver efter en flydende biopsi. Disse enheder er baseret på princippet om centrifugering, mikrofluidik og celleindfangning i porestørrelse. Der er tre typer diske: LBx-1 kan erhverve plasma og buffy coat, mens LBx-2 kan erhverve plasma og PBMC fra fuldblod med et volumen på mindre end 10 ml; FAST-auto kan også erhverve CTC'er ved hjælp af en membran, der kan fjernes fra disken. Op til fire af hver disk kan bruges i én kørsel. Frem for alt er fordelen ved denne enhed og metode, at den kan opnå en række kræftafledte stoffer fra den samme prøve ved hjælp af en lille mængde blod. Det betyder, at patientens blod kun skal trækkes én gang. Derudover har det den fordel, at det udelukker fejl på grund af forskelle i blodprøvetagningsperioden. Denne platform er nem at bruge og giver nøjagtige resultater for flydende biopsier og downstream-applikationer. I denne protokol introduceres brugen af enheden og patronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle fuldblodprøver blev taget fra lungekræftpatienter. Forskningen og analysen på Clinomics udføres af Cancer Genomics Research Institute, og IRB-forskningsgodkendelse fra regeringen ledes af Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB NR. 2021-0802) med IRB-nummeret registreret til forskning hos Clinomics.
1. Forberedelse af prøver
- Saml 9 ml fuldblod i et EDTA- eller cfDNA-stabilt blodopsamlingsrør.
- Bland godt ved at vende røret op og ned ca. 10 gange.
- Prøverne opbevares ved stuetemperatur (RT; til kortvarig opbevaring) eller 4 °C (til langtidsopbevaring). Må ikke fryses og optøres.
2. Forberedelse af enhed
- Tryk på afbryderen for at tænde instrumentet.
BEMÆRK: Der vises en indlæsningsskærm på touchpad'en, og instrumentet initialiseres. Hold hænderne væk fra instrumentet under initialiseringen. Skærmbilledet til valg af patron vises, når instrumentinitialiseringen er fuldført. - Vælg den prøvetilstand, der skal bruges. Skift antallet af prøver ved at trykke på pilen.
3. Enhedens betjening og prøveindsamling
- Ilægning af LBx-1 patronen
- Vælg patrontypen på instrumentets berøringsskærmpanel. Skift antallet af prøver ved at trykke på pileknappen.
- Åbn døren til instrumentet, og indsæt alle patroner, der skal bruges, i rækkefølge efter nummeret på patronholderen. Sørg for at indsætte patronen og patronholderen korrekt. Hvis patronen ikke er indsat korrekt, kan det forårsage betydelig skade på instrumentet.
- Hvis der er tale om i alt fire cylinderampulenter, skal prøvedukkepatronen placeres i det tomme rum på patronholderen.
- Brug støttehjulet til at montere patronen, og stram låsemøtrikken for at fastgøre den.
- Luk døren, og tryk på RUN-knappen på touchpad-skærmen. Instrumentet lukker ventilerne på patronerne, hvilket tager ca. 30 s.
- Følg meddelelsen for at åbne døren, fjerne støttehjulet og fjerne den ventillukkede patron fra patronholderen.
- Placer cylinderampullen på bordet, og forbered dig på at injicere hele blodprøven. Der pipetteres maksimalt 10 ml fuldblodsprøve med en serologisk pipette.
FORSIGTIG: Farerne ved håndtering af blod. Under hele proceduren for håndtering af blodprøver og reagenser er det vigtigt at bære laboratoriefrakke og laboratoriehandsker. Det udleverede muskel- og skeletbesvær bør undersøges grundigt af laboratoriearbejderne. - Sæt pipettespidsen dybt ind i cylinderampullens prøveindgang, og injicer langsomt hele blodprøven.
BEMÆRK Når du bruger mere end eller lig med 9 ml fuldblodprøve, er ingen fosfatbufret saltvand (PBS) tilsætning nødvendig. Når du bruger mindre end 9 ml fuldblodprøve, tilsættes PBS for at gøre det samlede volumen til 9 ml. For eksempel, når du bruger 7,2 ml fuldblod, skal du tilføje 1,8 ml PBS i prøveindløbet. En serologisk pipette eller en pipettespids kan anvendes til injektion af fuldblod og PBS. Når der anvendes mindre end 8 ml fuldblodprøve, kan buffy coaten ikke genvindes, selv ved tilsætning af 1 ml PBS. Til gDNA-forberedelse skal du bruge 200 μL fuldblod, som blev adskilt før dette trin. - Indsæt de patroner, der skal bruges, i rækkefølge efter nummeret på patronholderen. Brug støttehjulet til at montere patronen, og stram låsemøtrikken for at fastgøre den. Luk døren, og tryk på knappen OK .
BEMÆRK: Plasma og buffy coat adskilles automatisk fra fuldblod, hvilket tager ca. 30 min.
FORSIGTIG Fare under drift. Åbning af døren eller berøring af instrumentet under højhastighedsrotationsoperationer kan forårsage alvorlige kvæstelser. Der er også risiko for personskade på grund af asymmetrisk belastning af rotoren. Hvis der opstår usædvanlige vibrationer og lyde, når instrumentet starter i assisteret celleberigelse eller eksperttilstand, kan patronens placering være asymmetrisk. Tryk straks på tænd / sluk-tasten for at stoppe og installere patronen korrekt. - Se efter meddelelsen på skærmen ledsaget af en alarmlyd, der vises, når adskillelsen af plasma og buffy coat er afsluttet.
- Stop alarmen ved at åbne døren eller trykke på STOP-knappen . Åbn døren, fjern patronen, og læg den på bordet.
- Genvind 3 ml plasma fra plasmaudløbet ved hjælp af en 1 ml pipettespids. Tag buffy coaten på 3 ml ud af buffy coatens udløb ved hjælp af en pipettespids på 1 ml.
- Isætning af LBx-2-patronen
- Vælg patronnavnet på instrumentets berøringsskærm. Skift antallet af prøver ved at trykke på pileknappen.
- Åbn lågen, og indsæt de patroner, der skal bruges, i rækkefølge efter nummeret på patronholderen.
- Hvis der er tale om i alt fire cylinderampulenter, skal prøvedukkepatronen placeres i det tomme rum på patronholderen.
- Brug støttehjulet til at montere patronen, og stram låsemøtrikken for at fastgøre den. Sørg for, at cylinderampullen er sat korrekt i patronholderen. Hvis patronen ikke er indsat korrekt, kan det forårsage betydelig skade på instrumentet.
- Luk døren, og tryk på RUN-knappen på touchpad-skærmen. Instrumentet lukker ventilerne på patronen, hvilket tager ca. 30 s.
- Følg meddelelsen for at åbne døren, fjerne støttehjulet og fjerne den ventillukkede patron fra patronholderen og placere den på bordet.
- Anbring cylinderampullen på bordet, og forbered injektion af densitetsgradientopløsningen og hele blodprøven. Volumenet af densitetsgradientopløsningen og PBS, der skal injiceres, kontrolleres afhængigt af hele blodprøvens volumen (supplerende tabel 1).
- Densitetsgradientopløsningen pipetteres ved hjælp af en serologisk pipette. Sæt pipettespidsen dybt ind i cylinderampullens indløb, og injicer langsomt densitetsgradientopløsningen.
- Efter injektion af densitetsgradientopløsningen pipetteres hele blodprøven ved hjælp af en serologisk pipette. Sæt pipettespidsen dybt ind i cylinderampullens prøveindgang, og injicer langsomt hele blodprøven.
BEMÆRK: Når du bruger mindre end 9 ml af fuldblodprøven, tilsættes PBS ved at henvise til denne tabel (supplerende tabel 1). - Indsæt de patroner, der skal bruges, i rækkefølge i henhold til nummeret på patronholderen. Brug støttehjulet til at montere patronen, og stram låsemøtrikken for at fastgøre den. Luk døren, og tryk på knappen OK .
- Plasma og PBMC adskilles automatisk fra fuldblod, hvilket tager ca. 30 minutter. Se efter meddelelsen, der vises ledsaget af en alarmlyd, når adskillelsen af plasma og PBMC er afsluttet.
- Stop alarmen ved at åbne døren eller trykke på STOP-knappen . Åbn døren, fjern patronen, og læg den på bordet.
- Genvind 3 ml plasma fra plasmaudløbet ved hjælp af en 1 ml pipettespids. Genvind 3 ml af PBMC fra PBMC-udløbet ved hjælp af en 1 ml pipettespids.
- Isætning af FAST-auto patronen
- Vælg patronen på instrumentets berøringsskærmpanel. Skift antallet af prøver ved at trykke på pileknappen.
- Åbn lågen, og indsæt de patroner, der skal bruges, i rækkefølge efter nummeret på patronholderen. Hvis der er tale om i alt fire cylinderampulenter, skal prøvedukkepatronen placeres i det tomme rum på patronholderen.
- Brug støttehjulet til at montere patronen, og stram låsemøtrikken for at fastgøre den.
- Luk døren, og tryk på RUN-knappen på touchpad-skærmen. Instrumentet lukker ventilerne på patronen, hvilket tager ca. 30 s.
- Følg meddelelsen for at åbne døren, fjerne støttehjulet og fjerne den ventillukkede patron fra patronholderen.
- Cylinderampullen lægges på bordet, og PBS-opløsningen og fuldblodprøven gøres klar til injektion. 6 ml PBS-opløsning pipetteres ved hjælp af en serologisk pipette. Sæt pipettespidsen dybt ind i cylinderampullens PBS-indgang, og injicer langsomt 6 ml PBS-opløsningen.
- Efter injektion af PBS-opløsningen pipetteres 3 ml fuldblodsprøve eller PBMC-prøve fra LBx-2 ved hjælp af en serologisk pipette, som tidligere blev skyllet med 1 % BSA for at forhindre klæbning af resten. Sæt pipettespidsen dybt ind i cylinderampullens prøveindgang, og injicer langsomt hele blodprøven.
- Indsæt de patroner, der skal bruges, i rækkefølge efter nummeret på patronholderen. Brug støttehjulet til at montere patronen, og stram låsemøtrikken for at fastgøre den. Luk døren, og tryk på knappen OK .
- CTC'er beriges automatisk fra fuldblod, hvilket tager ca. 15 minutter. Se efter en meddelelse, der vises ledsaget af en alarmlyd, når berigelsen af CTC'er er fuldført. Stop alarmen ved at åbne døren eller trykke på STOP-knappen .
- Åbn døren, fjern patronen, og læg den på bordet. Indsæt bagpladefjerneren (BPR) i de fire huller på forsiden af patronen. Tryk på den mørkeblå vinge med tommelfingrene på begge hænder, og tryk derefter på den lyseblå krop, indtil den klikker.
- Fjern forsigtigt patronhuset ved at løfte det op. Tag forsigtigt filtermembranen op ved kanten ved hjælp af en pincet. Sørg for at bruge filtermembranens ydre kant (den 1 mm brede kantdel) til at klemme og holde filtermembranen.
- Anbring forsigtigt filtermembranen (hvorpå berigede CTC'er er tilbage) i et 1,5 ml rør til nukleinsyrepræparation. Hvis det er nødvendigt, genvindes det filtrerede blod til blodudløbet ved hjælp af en 1 ml pipettespids.
4. Vedligeholdelse af systemet
- Forberedelse til rengøring og desinfektion af instrumentet
- Rengør alle tilgængelige overflader på instrumentet og tilbehøret en gang om ugen med ethanol og tørret væv, og også straks, når de er forurenet.
- Rengør skålen og rotorakslen regelmæssigt med alkohol (ethanol og isopropanol) eller alkoholbaserede desinfektionsmidler.
- Rengøring og desinficering af instrumentet
BEMÆRK: For generel fejlfinding og andre bemærkninger om maskinen henvises til supplerende tabel 2.- Sluk for instrumentet ved hjælp af hovedafbryderen. Tag strømstikket ud af strømforsyningen.
- Åbn lågen, og rengør og desinficer alle tilgængelige overflader på instrumentet, herunder strømkablet, med en fugtig klud og de anbefalede rengøringsmidler.
- Kontroller rotorakslen for skader. Undersøg instrumentet for korrosion og skader.
- Tilslut kun instrumentet til strømforsyningen, hvis det er helt tørt indvendigt og udvendigt.
- Tag hovedstikket ud, og fjern sikringsholderen. Sikringsholderen er placeret over stikkontakten. Udskift den brugte sikring med en ekstra fra beholderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne teknik er nemt og automatisk at isolere kræftassocierede stoffer fra fuldblod. Især kan enhver bruge denne teknik inden for alle egnede forsknings- og analyseområder. Den samtidige og reproducerbare adskillelse af flere stoffer i en enkelt blodprøve er signifikant i flydende biopsier. LBx-1- og LBx-2-diskene bruges til isolering af plasma og buffy coat eller PBMC fra fuldblod. Figur 1 viser materialerne adskilt ved anvendelse af denne enhed. For det første blev plasmaet opnået fra 10 ml blod ved anvendelse af LBx-1, eller PBMC'erne blev opnået under anvendelse af LBx-2. For det andet blev 3 ml af den adskilte buffy coat geninjiceret med PBS i FAST-auto, og CTC'er blev filtreret gennem membranen. For det tredje blev membranen overført til et rør fyldt med opbevaringsbuffer eller straks anvendt til farvning. Til andre applikationer eller langtidsopbevaring kan CTC'er let fjernes fra membranen ved hvirvelstrøm.
cfDNA blev ekstraheret fra plasmaet ved hjælp af magnetisk perlebaseret DNA-isolation, der var i stand til størrelse-for-størrelse indfangning af DNA ved perlekoncentration. Koncentrationen og renheden af cfDNA blev målt ved hjælp af bioanalysatoren. Det er velkendt, at koncentrationen af cfDNA, herunder ctDNA, varierer afhængigt af kræftens type og stadium18. Derudover har de fleste cfDNA en længde på 166 bp, og nogle er omkring to eller tre gange så lange. Selvom der er en forskel i mængden opnået fra hver enkelt prøve, såsom 8,47 ng / ml og 5,2 ng / ml, var resultaterne af cfDNA-ekstraktion gode for både koncentration og størrelsesfordeling i alle tilfælde (figur 2). Disse resultater indikerer, at LBx-1-metoden nøjagtigt adskiller plasma indeholdende cfDNA.
I FAST-auto blev membranen fjernet og farvet med fluorescerende antistoffer til påvisning af CTC'er og hvide blodlegemer (WBC'er). Den farvede membran placeret på glasskinner blev observeret under et fluorescensmikroskop. Farvning og mikroskopiske undersøgelser blev udført efter en tidligere undersøgelse19. Kun CTC'er kan specifikt skelnes ved hjælp af EpCAM / Cytokeratin (CTC-positiv markør) og CD45 (WBC-positiv markør) antistoffer. Hver membran fangede i alt henholdsvis 310 og 998 celler. Blandt dem blev i alt 3 og 43 CTC'er talt i henholdsvis prøve 1 og 2 (figur 3). Metoden, der anvendes i denne undersøgelse, gør det let at bestemme tilstedeværelsen og antallet af CTC'er. Derudover kan ændringer i cfDNA-koncentrationen og CTC-nummeret bruges til let at overvåge tilstedeværelsen og tilbagefaldet af kræft i marken. Da disse metoder ikke anvender andre reagenser, der kan påvirke resultaterne, er nedstrømsforsøg især mulige med det opnåede materiale.
Figur 1: Arbejdsgang for diskblandingsmetode til samtidig adskillelse af stoffer fra fuldblod . (A) Plasmaet indeholdende cfDNA opnås. (B) CTC'er fjernes fra buffy coat. (C,D) Efter hvirvel løsnes CTC'er fra membranen, og en lille mængde CTC forbliver stadig på membranen. Både udtagne celler og membranen kan gennemgå langtidsopbevaring ved frysning af prøver i opbevaringsbufferen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Renhed og mængde ekstraheret cfDNA. De ekstraherede cfDNA'er blev evalueret ved hjælp af Bioanalyzer, og cfDNA-skærmbånd blev brugt sammen med en elektronisk stige. Den grønne linje blev brugt til justering mellem stigen (venstre) og prøven (højre). Trekantmærkerne angiver DNA-båndet. Det meste af cfDNA er 166 bp, og nogle findes i heltalsmultipla af længde. Normalt måler koncentrationen af cfDNA op til størrelsen 50 bp til 700 bp. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Optælling af CTC'er ved hjælp af membranfarvning. Efter membranimmunocytokemisk farvning viser celler DAPI (nukleare positive) signaler i blåt, mens EpCAM / CK (CTC'er positive) og CD45 (WBC-positive) fremhæves med henholdsvis grønt og rødt. Fluorescenssignaler blev målt ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Skalabjælken viser 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Sammensætning af det endelige volumen ved anvendelse af densitetsgradientopløsning. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2: Generelle spørgsmål og forsigtighedsregler i forbindelse med vedligeholdelse. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mængden og koncentrationen af cfDNA og CTC afhænger af individet, stadiet og typen af kræft. Det afhænger også af patientens tilstand 2,4,5,10,20. Især i de tidlige eller precancerøse stadier af kræft er koncentrationerne af kræftrelaterede stoffer meget lave, så der er stor mulighed for, at det ikke kan påvises. Ikke desto mindre har tidlig påvisning en meget positiv effekt på patientens overlevelse og etablering af behandlingsstrategi. Da cfDNA og CTC har korte halveringstider i blodet, afspejler de realtidsinformation om kræft 21,22,23,24,25. For samtidig at erhverve forskellige kræftrelaterede stoffer kræves der derfor en stor mængde blod under de samme betingelser. Systemet vist her giver brugerne en enkel metode. Brugeren kan vælge og bruge disken svarende til det materiale, der kræves af fuldblod. Ved hjælp af en af de givne patroner kan plasma indeholdende cfDNA opnås, og CTC'er kan indsamles fra den samme blodprøve, spildt buffy frakke eller PBMC ved geninjektion i en FAST-auto-disk (figur 1).
Størrelsesbaseret CTC-optagelse er enkel, men den har begrænsninger for renhed. Der er mange forskellige former og størrelser af celler i blodet26. WBC'er varierer i størrelse fra 8 til 16 μm27. I en anden undersøgelse var gennemsnitsstørrelsen af den målte WBC 9 μm. På den anden side er minimumsstørrelsen af isolerede CTC'er 16 μm, og den gennemsnitlige størrelse er 30 μm28. Desuden er CTC'er til stede i en meget lille mængde i patientens blod sammenlignet med andre blodlegemer. Minimering af WBC-kontaminering er vigtig for downstream-analyser. Selvom antistofbaseret detektion kan fange CTC'er, kræver højopløsningsanalyse såsom NGS yderligere enkeltcelleplukningsteknikker eller et højt niveau af bioinformatikanalyse.
For nylig er der implementeret metoder til intuitivt at observere tilstedeværelsen af CTC'er før højopløsningsanalyse ved hjælp af forskellige fangstteknikker29. Som vist i resultaterne kan membranen, der er erhvervet fra FAST-auto-patronen, farves direkte til CTC-detektion. Indfangede CTC'er kan også let resuspenderes fra membranen ved hvirvelstrøm til opbevaring eller yderligere applikationer såsom cellekultur (figur 1).
Denne metode anvender principperne om centrifugering og mikrofluidik. Derfor er balancen mellem udstyret og disken vigtig, og det er også vigtigt at fastgøre det med diskholderen. Det er vigtigt at fylde ethvert indledende utilstrækkeligt totalt volumen med PBS. Hvis det oprindelige beløb er utilstrækkeligt, kan der være et problem, der fører til vanskeligheder med at flytte til det næste rum. Tag diskholderen ud på en bordplade for at forhindre kontaminering af udstyret og for at flytte væsker ind og ud af disken. I tilfælde af FAST-auto-disk skal prøverne behandles hurtigt for at reducere beskadigelsen af CTC'en i membranen. Vær især omhyggelig med at forhindre kontaminering, når du håndterer membranen, og følg den etablerede protokol for langtidsopbevaring.
Ikke desto mindre er denne metode nem at bruge og kan behandle en til fire prøver samtidigt. Forskellige substrater af væske kan også opnås ved blot at udskifte disken. Desuden kræves der ingen yderligere reagenser ud over anvendelse af en densitetsgradientopløsning til opnåelse af PBMC'er. Derfor er det opnåede materiale godt til nedstrøms brug.
Denne metode har stadig nogle begrænsninger. Brugeren kan ikke ændre disken vilkårligt, og forskellige typer diske kan ikke bruges på samme tid. Der er også grænser for det maksimale volumen, så flere diske skal bruges til store mængder blod. Yderligere metoder er stadig nødvendige for at opnå cfDNA. Ved hjælp af membranen er det vanskeligt kun at opnå CTC'er ved hjælp af porestørrelsesfangstmetoden. Derfor kræves cellevalg eller sortering til CTC-specifikke applikationseksperimenter.
Der er forskellige væsker i kroppen, og produktionen af visse kropsvæsker er forbundet med sygdom30. I øjeblikket er brug af blodkropsvæsken kun foretaget til analyse. I fremtiden kan en optimal protokol etableres ved at bekræfte ydeevnen i forskellige kropsvæsker såsom urin, ascites, pleurvæske og spinalvæske. For at give brugerne en mere bekvem metode udvikles der i øjeblikket enheder, der automatisk udtrækker cfDNA fra disken. Desuden er udstyr, der er i stand til at udføre kvantitativ PCR direkte i disken efter ekstraktionen, under udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter i forbindelse med dette arbejde.
Acknowledgments
Dette manuskript blev delvist støttet af Korea Medical Device Development Fund (KMDF, bevillingsnr. RS-2020-KD000019) og Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, bevillingsnr. HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
