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Cancer Research

नैदानिक नमूनों से कैंसर से संबंधित पदार्थों का स्वचालित पृथक्करण और संग्रह

Published: January 13, 2023 doi: 10.3791/64325
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Clinomics Inc.

Summary

यह पेपर पूरे रक्त से कोशिका-मुक्त डीएनए और परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं जैसे पदार्थों को आसानी से और कुशलता से अलग करने और एकत्र करने के लिए स्वचालित उपकरणों के आवेदन का वर्णन करता है।

Abstract

हाल ही में, तरल बायोप्सी का उपयोग कैंसर सहित विभिन्न बीमारियों के निदान के लिए किया गया है। शरीर के तरल पदार्थों में कई पदार्थ होते हैं, जिनमें कोशिकाएं, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड शामिल हैं जो सामान्य ऊतकों से उत्पन्न होते हैं, लेकिन इनमें से कुछ पदार्थ रोगग्रस्त क्षेत्र से भी उत्पन्न होते हैं। शरीर के तरल पदार्थों में इन पदार्थों की जांच और विश्लेषण विभिन्न बीमारियों के निदान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसलिए, आवश्यक पदार्थों को सटीक रूप से अलग करना महत्वपूर्ण है, और इस उद्देश्य के लिए उपयोग किए जाने के लिए कई तकनीकें विकसित की गई हैं।

हमने सीडी-प्राइम नाम से लैब-ऑन-ए-डिस्क टाइप का डिवाइस और प्लेटफॉर्म विकसित किया है। यह डिवाइस स्वचालित है और नमूना संदूषण और नमूना स्थिरता के लिए अच्छे परिणाम हैं। इसके अलावा, इसमें एक अच्छी अधिग्रहण उपज, एक कम ऑपरेशन समय और उच्च प्रजनन क्षमता के फायदे हैं। इसके अलावा, चढ़ाई जाने वाली डिस्क के प्रकार के आधार पर, सेल-मुक्त डीएनए युक्त प्लाज्मा, परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं, या बफी कोट अलग किए जा सकते हैं। इस प्रकार, शरीर के तरल पदार्थों में मौजूद विभिन्न प्रकार की सामग्रियों का अधिग्रहण विभिन्न प्रकार के डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें ओमिक्स का अध्ययन भी शामिल है।

Introduction

कैंसर सहित विभिन्न बीमारियों की प्रारंभिक और सटीक पहचान, उपचार रणनीति 1,2,3,4 स्थापित करने में सबसे महत्वपूर्ण कारक है। विशेष रूप से, कैंसर का प्रारंभिक पता लगाने से रोगी के लिए जीवित रहने की संभावना बढ़ जाती है 5,6,7,8। हाल ही में, तरल बायोप्सी कैंसर की शुरुआती पहचान के लिए सुर्खियों में रही है। ठोस ट्यूमर एंजियोजेनेसिस से गुजरते हैं और रक्त में विभिन्न पदार्थों को छोड़ते हैं। विशेष रूप से,कैंसर रोगियों के रक्त में परिसंचारी डीएनए (सीटीडीएनए), परिसंचारी आरएनए (सीटीआरएनए), प्रोटीन, पुटिका जैसे एक्सोसोम, और परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं (सीटीसी) पाई गई हैं। यद्यपि इन पदार्थों की मात्रा में अंतर हैं, वे लगातार न केवल शुरुआती चरणों में बल्कि बाद केचरणों 6,10 में भी देखे जाते हैं। हालांकि, ये व्यक्तिगत अंतर बहुत अधिक हैं; उदाहरण के लिए, सीटीडीएनए युक्त सेल-मुक्त डीएनए (सीएफडीएनए) की मात्रा 1,000 एनजी से कम है, और सीटीसी की संख्या कैंसर रोगियों 11,12,13 से पूरे रक्त के10 एमएल में 100 से कम है। कई अध्ययनों ने कम मात्रा में मौजूद इन पदार्थों (यानी, सीएफडीएनए, सीटीडीएनए और सीटीसी) का उपयोग करके कैंसर की विशेषता बताई है। सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए, उच्च शुद्धता वाले पदार्थों की छोटी मात्रा को सटीक रूप से अलग करना महत्वपूर्ण है13,14। पारंपरिक सेंट्रीफ्यूजेशन विधियों का आमतौर पर उपयोग किया जाता है, लेकिन उन्हें संभालना मुश्किल होता है और उपयोगकर्ता के कौशल के आधार पर कम शुद्धता होती है। सीटीसी की खोज के बाद से, कई पृथक्करण तकनीकों को विकसित किया गया है, जैसे कि सेंट्रीफ्यूजेशन या घनत्व ग्रेड पृथक्करण, इम्यूनोबीड और माइक्रोफ्लुइडिक विधियां। सीटीसी की खोज के बाद से कई रोकथाम तकनीकें विकसित की गई हैं। हालांकि, ये तकनीकें अक्सर सीमित होती हैं जब उन्हें अलग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न चिप्स और झिल्ली से कोशिकाओं को अलग करना आवश्यक होताहै। इसके अलावा, टैगिंग विधियों को एफएसीएस जैसे उपकरणों की आवश्यकता होती है, और टैगिंग संदूषण के कारण डाउनस्ट्रीम प्रक्रिया की सीमाएं हैं।

हाल ही में, तरल बायोप्सी का उपयोग बढ़ गया है, और कैंसर की शुरुआती पहचान के लिए विभिन्न अध्ययन किए जा रहे हैं। यद्यपि यह विधि सरल है, फिर भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में कठिनाइयां हैं, और विभिन्न अध्ययन इन कठिनाइयों को दूर करने का प्रयास कर रहे हैं। इसके अलावा, अस्पतालों सहित कई साइटों को स्वचालित, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उच्च शुद्धता वाले तरीकों की आवश्यकता होती है जो उपयोग करने के लिए सुविधाजनक हैं। यहां, हमने तरल बायोप्सी के बाद रक्त के नमूनों से पदार्थों के स्वचालित पृथक्करण के लिए एक प्रयोगशाला-ऑन-ए-डिस्क विकसित की है। ये उपकरण सेंट्रीफ्यूजेशन, माइक्रोफ्लुइडिक्स और पोर-आकार के सेल कैप्चर के सिद्धांत पर आधारित हैं। डिस्क के तीन प्रकार हैं: एलबीएक्स -1 प्लाज्मा और बफी कोट प्राप्त कर सकता है, जबकि एलबीएक्स -2 10 एमएल से कम की मात्रा के साथ पूरे रक्त से प्लाज्मा और पीबीएमसी प्राप्त कर सकता है; फास्ट-ऑटो एक झिल्ली का उपयोग करके सीटीसी भी प्राप्त कर सकता है जो डिस्क से हटाने योग्य है। प्रत्येक डिस्क के चार तक एक रन में उपयोग किया जा सकता है। इन सबसे ऊपर, इस उपकरण और विधि का लाभ यह है कि यह रक्त की थोड़ी मात्रा का उपयोग करके एक ही नमूने से विभिन्न प्रकार के कैंसर-व्युत्पन्न पदार्थ प्राप्त कर सकता है। इसका मतलब है कि रोगी के रक्त को केवल एक बार खींचने की आवश्यकता है। इसके अलावा, रक्त नमूना अवधि में अंतर के कारण त्रुटियों को बाहर करने का लाभ है। यह प्लेटफ़ॉर्म उपयोग करने में आसान है और तरल बायोप्सी और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए सटीक परिणाम प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में, डिवाइस और कारतूस का उपयोग पेश किया जाता है।

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Protocol

सभी पूरे रक्त के नमूने फेफड़ों के कैंसर रोगियों से प्राप्त किए गए थे। क्लिनोमिक्स में अनुसंधान और विश्लेषण कैंसर जीनोमिक्स रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा किया जाता है, और सरकार द्वारा आईआरबी अनुसंधान अनुमोदन का नेतृत्व आसन मेडिकल सेंटर संस्थागत समीक्षा समिति (आईआरबी नंबर 2021-0802) द्वारा किया जाता है, जिसमें आईआरबी नंबर क्लिनोमिक्स में अनुसंधान के लिए पंजीकृत है।

1. नमूना तैयार करना

  1. पूरे रक्त के 9 एमएल को ईडीटीए या सीएफडीएनए-स्थिर रक्त संग्रह ट्यूब में इकट्ठा करें।
  2. ट्यूब को लगभग 10 बार ऊपर और नीचे पलटकर अच्छी तरह मिलाएं।
  3. नमूने को कमरे के तापमान (आरटी; अल्पकालिक भंडारण के लिए) या 4 डिग्री सेल्सियस (दीर्घकालिक भंडारण के लिए) पर स्टोर करें। जमकर और पिघलना मत।

2. डिवाइस की तैयारी

  1. उपकरण चालू करने के लिए पावर स्विच दबाएं।
    नोट: टचपैड पर एक लोडिंग स्क्रीन दिखाई देती है, और उपकरण प्रारंभ किया जाता है। आरंभ के दौरान हाथों को उपकरण से दूर रखें। उपकरण आरंभ पूरा होने के बाद कारतूस चयन स्क्रीन दिखाई देती है।
  2. उपयोग किए जाने वाले नमूना मोड का चयन करें। तीर दबाकर नमूनों की संख्या बदलें।

3. डिवाइस ऑपरेशन और नमूना संग्रह

  1. LBx-1 कारतूस की लोडिंग
    1. उपकरण के टचस्क्रीन पैनल पर कारतूस प्रकार का चयन करें। तीर बटन दबाकर नमूने की संख्या बदलें।
    2. उपकरण का दरवाजा खोलें और कारतूस धारक पर नंबर के क्रम में उपयोग किए जाने वाले सभी कारतूस डालें। कारतूस और कारतूस धारक को सही ढंग से सम्मिलित करना सुनिश्चित करें। यदि कारतूस सही ढंग से नहीं डाला गया है, तो यह उपकरण को काफी नुकसान पहुंचा सकता है।
    3. कुल चार कारतूसों के लिए, डमी कारतूस को कारतूस धारक की खाली जगह में रखें।
    4. कारतूस को माउंट करने के लिए समर्थन पहिया का उपयोग करें और इसे सुरक्षित करने के लिए लॉक नट को कसें।
    5. दरवाजा बंद करें और टचपैड स्क्रीन पर रन बटन दबाएं । उपकरण कारतूस पर वाल्व बंद कर देता है, जिसमें लगभग 30 सेकंड लगते हैं।
    6. दरवाजा खोलने, समर्थन पहिया को हटाने और कारतूस धारक से वाल्व-बंद कारतूस को हटाने के लिए संदेश का पालन करें।
    7. टेबल पर कारतूस रखें और पूरे रक्त के नमूने को इंजेक्ट करने के लिए तैयार करें। पिपेट एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पूरे रक्त के नमूने का अधिकतम 10 एमएल।
      सावधानी: रक्त को संभालने के खतरे। रक्त के नमूनों और अभिकर्मकों को संभालने की पूरी प्रक्रिया के दौरान, प्रयोगशाला कोट और प्रयोगशाला दस्ताने पहनना महत्वपूर्ण है। प्रदान किए गए एमएसडीएस का प्रयोगशाला कर्मचारियों द्वारा पूरी तरह से अध्ययन किया जाना चाहिए।
    8. पिपेट टिप को कारतूस के नमूना इनलेट में गहराई से डालें और धीरे-धीरे पूरे रक्त के नमूने को इंजेक्ट करें।
      नोट पूरे रक्त के नमूने के 9 एमएल से अधिक या बराबर का उपयोग करते समय, कोई फॉस्फेट बफर्ड खारा (पीबीएस) जोड़ आवश्यक नहीं है। पूरे रक्त के नमूने के 9 एमएल से कम का उपयोग करते समय, कुल मात्रा को 9 एमएल बनाने के लिए पीबीएस जोड़ें। उदाहरण के लिए, पूरे रक्त के 7.2 एमएल का उपयोग करते समय, कृपया नमूना इनलेट में 1.8 एमएल पीबीएस जोड़ें। पूरे रक्त और पीबीएस के इंजेक्शन के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट या एक पिपेट टिप का उपयोग किया जा सकता है। पूरे रक्त के नमूने के 8 एमएल से कम का उपयोग करते समय, 1 एमएल पीबीएस जोड़कर भी बफी कोट को पुनर्प्राप्त नहीं किया जा सकता है। जीडीएनए तैयारी के लिए, पूरे रक्त के 200 μL का उपयोग करें, जिसे इस चरण से पहले अलग किया गया था।
    9. कारतूस धारक पर नंबर के क्रम में उपयोग किए जाने वाले कारतूस डालें। कारतूस को माउंट करने के लिए समर्थन पहिया का उपयोग करें और इसे सुरक्षित करने के लिए लॉक नट को कसें। दरवाजा बंद करें और ओके बटन दबाएं।
      नोट: प्लाज्मा और बफी कोट स्वचालित रूप से पूरे रक्त से अलग हो जाते हैं, जिसमें लगभग 30 मिनट लगते हैं।
      ऑपरेशन के दौरान सावधानी का खतरा। हाई-स्पीड रोटेटिंग ऑपरेशन के दौरान दरवाजा खोलना या उपकरण को छूना गंभीर चोटों का कारण बन सकता है। रोटर की असममित लोडिंग के कारण चोट लगने का खतरा भी रहता है। यदि असामान्य कंपन और शोर तब होता है जब उपकरण सहायक सेल संवर्धन या विशेषज्ञ मोड पर शुरू होता है, तो कारतूस प्लेसमेंट विषम हो सकता है। कारतूस को रोकने और ठीक से स्थापित करने के लिए तुरंत पावर कुंजी दबाएं।
    10. अलार्म ध्वनि के साथ स्क्रीन पर संदेश की तलाश करें, जो प्लाज्मा और बफी कोट का पृथक्करण पूरा होने पर दिखाई देता है।
    11. दरवाजा खोलकर या स्टॉप बटन दबाकर अलार्म बंद करें । दरवाजा खोलें, कारतूस निकालें, और इसे मेज पर रखें।
    12. 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके प्लाज्मा आउटलेट से 3 एमएल प्लाज्मा पुनर्प्राप्त करें। 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके बफी कोट आउटलेट से 3 एमएल के बफी कोट को पुनर्प्राप्त करें।
  2. LBx-2 कारतूस लोड करना
    1. उपकरण के टचस्क्रीन पैनल पर कारतूस नाम का चयन करें। तीर बटन दबाकर नमूने की संख्या बदलें।
    2. दरवाजा खोलें और कारतूस धारक पर नंबर के क्रम में उपयोग किए जाने वाले कारतूस डालें।
    3. कुल चार कारतूसों के लिए, डमी कारतूस को कारतूस धारक की खाली जगह में रखें।
    4. कारतूस को माउंट करने के लिए समर्थन पहिया का उपयोग करें और इसे सुरक्षित करने के लिए लॉक नट को कसें। कारतूस धारक में कारतूस को सही ढंग से सम्मिलित करना सुनिश्चित करें। यदि कारतूस सही ढंग से नहीं डाला गया है, तो यह उपकरण को काफी नुकसान पहुंचा सकता है।
    5. दरवाजा बंद करें और टचपैड स्क्रीन पर रन बटन दबाएं । उपकरण कारतूस पर वाल्व बंद कर देता है, जिसमें लगभग 30 सेकंड लगते हैं।
    6. दरवाजा खोलने के लिए संदेश का पालन करें, समर्थन पहिया हटा दें, और कारतूस धारक से वाल्व-बंद कारतूस को हटा दें और इसे मेज पर रखें।
    7. टेबल पर कारतूस रखें और घनत्व ढाल समाधान और पूरे रक्त के नमूने को इंजेक्ट करने के लिए तैयार करें। पूरे रक्त के नमूने की मात्रा के आधार पर घनत्व ढाल समाधान और पीबीएस इंजेक्शन की मात्रा की जांच करें (पूरक तालिका 1)।
    8. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके घनत्व ढाल समाधान का उपयोग करें। पिपेट टिप को कारतूस के इनलेट में गहराई से डालें और धीरे-धीरे घनत्व ढाल समाधान इंजेक्ट करें।
    9. घनत्व ढाल समाधान इंजेक्ट करने के बाद, सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पूरे रक्त के नमूने को पिपेट करें। पिपेट टिप को कारतूस के नमूना इनलेट में गहराई से डालें और धीरे-धीरे पूरे रक्त के नमूने को इंजेक्ट करें।
      नोट: पूरे रक्त के नमूने के 9 एमएल से कम का उपयोग करते समय, इस तालिका (पूरक तालिका 1) का उल्लेख करके पीबीएस जोड़ें।
    10. कारतूस धारक पर संख्या के अनुसार उपयोग किए जाने वाले कारतूस डालें। कारतूस को माउंट करने के लिए समर्थन पहिया का उपयोग करें और इसे सुरक्षित करने के लिए लॉक नट को कसें। दरवाजा बंद करें और ओके बटन दबाएं।
    11. प्लाज्मा और पीबीएमसी को पूरे रक्त से स्वचालित रूप से अलग किया जाता है, जिसमें लगभग 30 मिनट लगते हैं। उस संदेश की तलाश करें जो अलार्म ध्वनि के साथ दिखाई देता है, जब प्लाज्मा और पीबीएमसी का पृथक्करण पूरा हो जाता है।
    12. दरवाजा खोलकर या स्टॉप बटन दबाकर अलार्म बंद करें । दरवाजा खोलें, कारतूस निकालें, और इसे मेज पर रखें।
    13. 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके प्लाज्मा आउटलेट से 3 एमएल प्लाज्मा पुनर्प्राप्त करें। 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके पीबीएमसी आउटलेट से पीबीएमसी के 3 एमएल को पुनर्प्राप्त करें।
  3. फास्ट-ऑटो कारतूस लोड करना
    1. उपकरण के टच स्क्रीन पैनल पर कारतूस का चयन करें। तीर बटन दबाकर नमूने की संख्या बदलें।
    2. दरवाजा खोलें और कारतूस धारक पर नंबर के क्रम में उपयोग किए जाने वाले कारतूस डालें। कुल चार कारतूसों के लिए, डमी कारतूस को कारतूस धारक की खाली जगह में रखें।
    3. कारतूस को माउंट करने के लिए समर्थन पहिया का उपयोग करें और इसे सुरक्षित करने के लिए लॉक नट को कसें।
    4. दरवाजा बंद करें और टच पैड स्क्रीन पर रन बटन दबाएं । उपकरण कारतूस पर वाल्व बंद कर देता है, जिसमें लगभग 30 सेकंड लगते हैं।
    5. दरवाजा खोलने, समर्थन पहिया को हटाने और कारतूस धारक से वाल्व-बंद कारतूस को हटाने के लिए संदेश का पालन करें।
    6. टेबल पर कारतूस रखें और पीबीएस समाधान और पूरे रक्त के नमूने को इंजेक्ट करने के लिए तैयार करें। एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पीबीएस समाधान के पिपेट 6 एमएल। पिपेट टिप को कारतूस के पीबीएस इनलेट में गहराई से डालें और धीरे-धीरे पीबीएस समाधान के 6 एमएल इंजेक्ट करें।
    7. पीबीएस समाधान को इंजेक्ट करने के बाद, पूरे रक्त के 3 एमएल या पीबीएमसी नमूने को एलबीएक्स -2 से सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्राप्त किया गया, जिसे पहले अवशेषों को चिपकने से रोकने के लिए 1% बीएसए के साथ धोया गया था। पिपेट टिप को कारतूस के नमूना इनलेट में गहराई से डालें और धीरे-धीरे पूरे रक्त के नमूने को इंजेक्ट करें।
    8. कारतूस धारक पर नंबर के क्रम में उपयोग किए जाने वाले कारतूस डालें। कारतूस को माउंट करने के लिए समर्थन पहिया का उपयोग करें और इसे सुरक्षित करने के लिए लॉक नट को कसें। दरवाजा बंद करें और ओके बटन दबाएं।
    9. सीटीसी पूरे रक्त से स्वचालित रूप से समृद्ध होते हैं, जिसमें लगभग 15 मिनट लगते हैं। सीटीसी का संवर्धन पूरा होने पर अलार्म ध्वनि के साथ दिखाई देने वाले संदेश की तलाश करें। दरवाजा खोलकर या स्टॉप बटन दबाकर अलार्म बंद करें ।
    10. दरवाजा खोलें, कारतूस निकालें, और इसे मेज पर रखें। कारतूस के सामने चार छेदों में बैक प्लेट रिमूवर (बीपीआर) डालें। दोनों हाथों के अंगूठे से गहरे नीले पंख को दबाएं, और फिर हल्के नीले शरीर को तब तक दबाएं जब तक कि यह क्लिक न करे।
    11. सावधानी से कारतूस शरीर को ऊपर उठाकर हटा दें। बहुत धीरे से एक चिमटी का उपयोग करके किनारे से फ़िल्टर झिल्ली उठाएं। कृपया फ़िल्टर झिल्ली को चुटकी लेने और पकड़ने के लिए फ़िल्टर झिल्ली के बाहरी रिम (1 मिमी चौड़ा किनारे का हिस्सा) का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
    12. न्यूक्लिक एसिड तैयार करने के लिए फ़िल्टर झिल्ली (जिस पर समृद्ध सीटीसी रह रहे हैं) को सावधानीपूर्वक 1.5 एमएल ट्यूब में रखें। यदि आवश्यक हो, तो फ़िल्टर किए गए रक्त को 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करके रक्त आउटलेट में पुनर्प्राप्त करें।

4. सिस्टम का रखरखाव

  1. उपकरण की सफाई और कीटाणुशोधन की तैयारी
    1. इथेनॉल और सूखे ऊतक का उपयोग करके सप्ताह में एक बार उपकरण और सामान की सभी सुलभ सतहों को साफ करें, और दूषित होने पर भी तुरंत।
    2. शराब (इथेनॉल और आइसोप्रोपेनॉल) या अल्कोहल-आधारित कीटाणुनाशक का उपयोग करके कटोरे और रोटर शाफ्ट को नियमित रूप से साफ करें।
  2. उपकरण की सफाई और कीटाणुरहित करना
    नोट: मशीन पर सामान्य समस्या निवारण और अन्य नोट्स के लिए, पूरक तालिका 2 देखें।
    1. मुख्य पावर स्विच का उपयोग करके उपकरण बंद करें। बिजली की आपूर्ति से पावर प्लग को डिस्कनेक्ट करें।
    2. दरवाजा खोलें और एक नम कपड़े और अनुशंसित सफाई एजेंटों का उपयोग करके पावर केबल सहित उपकरण की सभी सुलभ सतहों को साफ और कीटाणुरहित करें।
    3. क्षति के लिए रोटर शाफ्ट की जांच करें। संक्षारण और क्षति के लिए उपकरण का निरीक्षण करें।
    4. उपकरण को बिजली की आपूर्ति से केवल तभी कनेक्ट करें जब यह अंदर और बाहर पूरी तरह से सूखा हो।
  3. मुख्य पावर प्लग को डिस्कनेक्ट करें और फ्यूज धारक को हटा दें। फ्यूज होल्डर पावर सॉकेट के ऊपर स्थित है। उपयोग किए गए फ्यूज को कंटेनर से एक अतिरिक्त के साथ बदलें।

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Representative Results

इस तकनीक का लक्ष्य पूरे रक्त से कैंसर से जुड़े पदार्थों को आसानी से और स्वचालित रूप से अलग करना है। विशेष रूप से, कोई भी अनुसंधान और विश्लेषण के सभी उपयुक्त क्षेत्रों में इस तकनीक का उपयोग कर सकता है। एक ही रक्त के नमूने में कई पदार्थों का एक साथ और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पृथक्करण तरल बायोप्सी में महत्वपूर्ण है। एलबीएक्स -1 और एलबीएक्स -2 डिस्क का उपयोग पूरे रक्त से प्लाज्मा और बफी कोट या पीबीएमसी को अलग करने के लिए किया जाता है। चित्रा 1 इस डिवाइस के आवेदन द्वारा अलग की गई सामग्री को दर्शाता है। सबसे पहले, प्लाज्मा को एलबीएक्स -1 का उपयोग करके 10 एमएल रक्त से प्राप्त किया गया था या पीबीएमसी को एलबीएक्स -2 का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। दूसरा, अलग किए गए बफी कोट के 3 एमएल को पीबीएस के साथ फास्ट-ऑटो में फिर से इंजेक्ट किया गया था, और सीटीसी को झिल्ली के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था। तीसरा, झिल्ली को भंडारण बफर से भरे ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया था या तुरंत धुंधला करने के लिए उपयोग किया गया था। अन्य अनुप्रयोगों या दीर्घकालिक भंडारण के लिए, सीटीसी को भंवर द्वारा झिल्ली से आसानी से हटाया जा सकता है।

सीएफडीएनए को चुंबकीय मोती-आधारित डीएनए अलगाव का उपयोग करके प्लाज्मा से निकाला गया था जो मोती एकाग्रता द्वारा डीएनए के आकार-दर-आकार कैप्चर करने में सक्षम था। सीएफडीएनए की एकाग्रता और शुद्धता को बायोएनालाइज़र का उपयोग करके मापा गया था। यह सर्वविदित है कि सीटीडीएनए सहित सीएफडीएनए की एकाग्रता, कैंसर के प्रकार और चरण के आधार पर भिन्न होतीहै। इसके अलावा, अधिकांश सीएफडीएनए की लंबाई 166 बीपी होती है, और कुछ लगभग दोगुना या तीन बार लंबे होते हैं। यद्यपि प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने से प्राप्त राशि में अंतर है, जैसे कि 8.47 एनजी / एमएल और 5.2 एनजी / एमएल, सीएफडीएनए निष्कर्षण के परिणाम सभी मामलों में एकाग्रता और आकार वितरण दोनों के लिए अच्छे थे (चित्रा 2)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एलबीएक्स -1 विधि सीएफडीएनए युक्त प्लाज्मा को सटीक रूप से अलग करती है।

फास्ट-ऑटो में, सीटीसी और सफेद रक्त कोशिकाओं (डब्ल्यूबीसी) का पता लगाने के लिए झिल्ली को हटा दिया गया और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। ग्लास स्लाइड पर रखी गई दाग वाली झिल्ली को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। पिछले अध्ययन19 के बाद धुंधला और सूक्ष्म अध्ययन किया गया था। साइटोकेराटिन (सीटीसी पॉजिटिव मार्कर) और सीडी 45 (डब्ल्यूबीसी पॉजिटिव मार्कर) एंटीबॉडी का उपयोग करके केवल सीटीसी को विशेष रूप से अलग किया जा सकता है। प्रत्येक झिल्ली ने क्रमशः कुल 310 और 998 कोशिकाओं को पकड़ा। उनमें से, कुल 3 और 43 सीटीसी को क्रमशः नमूने 1 और 2 में गिना गया था (चित्रा 3)। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली विधि सीटीसी की उपस्थिति और संख्या निर्धारित करना आसान बनाती है। इसके अलावा, सीएफडीएनए एकाग्रता और सीटीसी संख्या में परिवर्तन का उपयोग क्षेत्र में कैंसर की उपस्थिति और पुनरावृत्ति की आसानी से निगरानी के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, चूंकि ये विधियां अन्य अभिकर्मकों का उपयोग नहीं करती हैं जो परिणामों को प्रभावित कर सकती हैं, प्राप्त सामग्री के साथ डाउनस्ट्रीम प्रयोग संभव हैं।

Figure 1
चित्र 1: पूरे रक्त से पदार्थों के एक साथ पृथक्करण के लिए डिस्क मिश्रण विधि का वर्कफ़्लो। (A) cfDNA युक्त प्लाज्मा प्राप्त किया जाता है। (बी) सीटीसी को बफी कोट से हटा दिया जाता है। (C, D) भंवर के बाद, सीटीसी झिल्ली से अलग हो जाते हैं, और सीटीसी की एक छोटी मात्रा अभी भी झिल्ली पर बनी हुई है। प्राप्त कोशिकाएं और झिल्ली दोनों भंडारण बफर में नमूने फ्रीज करके दीर्घकालिक भंडारण से गुजर सकते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: निकाली गई सीएफडीएनए की शुद्धता और मात्रा। निकाले गए cfDNA का मूल्यांकन बायोएनालाइज़र का उपयोग करके किया गया था, और cfDNA स्क्रीन टेप का उपयोग इलेक्ट्रॉनिक सीढ़ी के साथ किया गया था। हरे रंग की रेखा का उपयोग सीढ़ी (बाएं) और नमूना (दाएं) के बीच संरेखण के लिए किया गया था। त्रिभुज के निशान डीएनए बैंड को इंगित करते हैं। अधिकांश सीएफडीएनए 166 बीपी है, और कुछ लंबाई के पूर्णांक गुणकों में मौजूद हैं। आमतौर पर, सीएफडीएनए की एकाग्रता 50 बीपी से 700 बीपी के आकार तक मापती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: झिल्ली धुंधला का उपयोग करके सीटीसी की गिनती। मेम्ब्रेन इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री धुंधला होने के बाद, कोशिकाएं नीले रंग में डीएपीआई (परमाणु सकारात्मक) संकेत दिखाती हैं, जबकि ईपीकैम / सीके (सीटीसी पॉजिटिव) और सीडी 45 (डब्ल्यूबीसी पॉजिटिव) क्रमशः हरे और लाल रंग में हाइलाइट किए जाते हैं। प्रतिदीप्ति संकेतों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके मापा गया था। स्केल पट्टी 10 μm इंगित करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक तालिका 1: घनत्व ढाल समाधान उपयोग के लिए अंतिम मात्रा की संरचना। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 2: रखरखाव के लिए सामान्य मुद्दे और सावधानियां। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सीएफडीएनए और सीटीसी की मात्रा और एकाग्रता कैंसर के व्यक्ति, चरण और प्रकार पर निर्भर करती है। यह रोगी की स्थिति 2,4,5,10,20 पर भी निर्भर करता है। विशेष रूप से, कैंसर के शुरुआती या पूर्व-कैंसर चरणों में, कैंसर से संबंधित पदार्थों की सांद्रता बहुत कम होती है, इसलिए एक उच्च संभावना है कि इसका पता नहीं लगाया जा सकता है। फिर भी, प्रारंभिक पहचान का रोगी के अस्तित्व और उपचार रणनीति स्थापना पर बहुत सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। चूंकि सीएफडीएनए और सीटीसी में रक्त में कम अर्ध-जीवन काल होता है, इसलिए वे कैंसर 21,22,23,24,25 के बारे में वास्तविक समय की जानकारी को दर्शाते हैं। इसलिए, एक साथ विभिन्न कैंसर से संबंधित पदार्थों को प्राप्त करने के लिए, समान परिस्थितियों में बड़ी मात्रा में रक्त की आवश्यकता होती है। यहां दिखाया गया सिस्टम उपयोगकर्ताओं को एक सरल विधि प्रदान करता है। उपयोगकर्ता पूरे रक्त से आवश्यक सामग्री के अनुरूप डिस्क का चयन और उपयोग कर सकता है। दिए गए कारतूसों में से एक का उपयोग करके, सीएफडीएनए युक्त प्लाज्मा प्राप्त किया जा सकता है, और सीटीसी को एक ही रक्त के नमूने, बर्बाद बफी कोट, या पीबीएमसी से एफएएसटी-ऑटो डिस्क में पुन: इंजेक्शन द्वारा एकत्र किया जा सकता है (चित्रा 1)।

आकार-आधारित सीटीसी कैप्चर सरल है, लेकिन इसमें शुद्धता के लिए सीमाएं हैं। रक्त में कोशिकाओं के कई अलग-अलग आकार और आकार होते हैं। WBCs आकार में 8 से 16 μm27 तक भिन्न होते हैं। एक अन्य अध्ययन में, मापा डब्ल्यूबीसी का औसत आकार 9 μm था। दूसरी ओर, पृथक सीटीसी का न्यूनतम आकार 16 μm है, और औसत आकार 30 μm28 है। इसके अलावा, अन्य रक्त कोशिकाओं की तुलना में रोगी के रक्त में सीटीसी बहुत कम मात्रा में मौजूद होते हैं। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए डब्ल्यूबीसी संदूषण को कम करना महत्वपूर्ण है। हालांकि एंटीबॉडी-आधारित पहचान सीटीसी पर कब्जा कर सकती है, एनजीएस जैसे उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण के लिए अतिरिक्त एकल-सेल पिकिंग तकनीकों या जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के उच्च-स्तरीय की आवश्यकता होती है।

हाल ही में, विभिन्न कैप्चर तकनीकों का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन विश्लेषण से पहले सीटीसी की उपस्थिति को सहज रूप सेदेखने के तरीकों को लागू किया गया है। जैसा कि परिणामों में दिखाया गया है, फास्ट-ऑटो कारतूस से प्राप्त झिल्ली को सीटीसी का पता लगाने के लिए सीधे दाग दिया जा सकता है। कैप्चर किए गए सीटीसी को भंडारण या सेल कल्चर जैसे आगे के अनुप्रयोगों के लिए भंवर द्वारा झिल्ली से आसानी से पुन: निलंबित किया जा सकता है (चित्रा 1)।

यह विधि सेंट्रीफ्यूजेशन और माइक्रोफ्लुइडिक्स के सिद्धांतों का उपयोग करती है। इसलिए, उपकरण और डिस्क का संतुलन महत्वपूर्ण है, और इसे डिस्क धारक के साथ सुरक्षित करना भी महत्वपूर्ण है। पीबीएस के साथ किसी भी प्रारंभिक अपर्याप्त कुल मात्रा को भरना महत्वपूर्ण है। यदि प्रारंभिक राशि अपर्याप्त है, तो अगले स्थान पर जाने में कठिनाइयों का कारण बनने वाली समस्या हो सकती है। उपकरण के संदूषण को रोकने और डिस्क के अंदर और बाहर तरल पदार्थों को स्थानांतरित करने के लिए डिस्क धारक को टेबलटॉप पर बाहर ले जाएं। फास्ट-ऑटो डिस्क के मामले में, झिल्ली में सीटीसी को नुकसान को कम करने के लिए नमूनों को जल्दी से संसाधित करें। विशेष रूप से, झिल्ली को संभालते समय संदूषण को रोकने और दीर्घकालिक भंडारण के लिए स्थापित प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए सावधान रहें।

फिर भी, इस विधि का उपयोग करना आसान है और एक साथ एक से चार नमूने संसाधित कर सकता है। इसके अलावा, डिस्क को बदलकर तरल के विभिन्न सब्सट्रेट प्राप्त किए जा सकते हैं। इसके अलावा, पीबीएमसी प्राप्त करने के लिए घनत्व ढाल समाधान का उपयोग करने के अलावा किसी अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, प्राप्त सामग्री डाउनस्ट्रीम उपयोग के लिए अच्छी है।

इस विधि की अभी भी कुछ सीमाएँ हैं। उपयोगकर्ता डिस्क को मनमाने ढंग से संशोधित नहीं कर सकता है, और एक ही समय में विभिन्न प्रकार की डिस्क का उपयोग नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, अधिकतम मात्रा की सीमाएं हैं, इसलिए रक्त की बड़ी मात्रा के लिए कई डिस्क का उपयोग किया जाना चाहिए। सीएफडीएनए प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त तरीकों की अभी भी आवश्यकता है। झिल्ली का उपयोग करके, छिद्र-आकार की कैप्चर विधि का उपयोग करके केवल सीटीसी प्राप्त करना मुश्किल है। इसलिए, सीटीसी-विशिष्ट अनुप्रयोग प्रयोगों के लिए सेल चयन या सॉर्टिंग की आवश्यकता होती है।

शरीर में विभिन्न तरल पदार्थ होते हैं, और शरीर के कुछ तरल पदार्थों का उत्पादन रोग30 से जुड़ा होता है। वर्तमान में, रक्त शरीर के तरल पदार्थ का उपयोग केवल विश्लेषण के लिए किया गया है। भविष्य में, मूत्र, जलोदर, फुफ्फुस द्रव और रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ जैसे शरीर के विभिन्न तरल पदार्थों में प्रदर्शन की पुष्टि करके एक इष्टतम प्रोटोकॉल स्थापित किया जा सकता है। उपयोगकर्ताओं के लिए अधिक सुविधाजनक विधि प्रदान करने के लिए, डिस्क से सीएफडीएनए को स्वचालित रूप से निकालने वाले उपकरण वर्तमान में विकसित किए जा रहे हैं। इसके अलावा, निष्कर्षण के बाद डिस्क के भीतर सीधे मात्रात्मक पीसीआर करने में सक्षम उपकरण विकास के अधीन हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास इस काम से संबंधित हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस पांडुलिपि को कोरिया मेडिकल डिवाइस डेवलपमेंट फंड (केएमडीएफ, ग्रांट नंबर आरएस -2020-केडी000019) और कोरिया स्वास्थ्य उद्योग विकास संस्थान (खिडी, अनुदान संख्या एचआई 19 सी 0521020020) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% BSA (Bovine Serum Albumin) Sigma-Aldrich A3059
1.5 mL Microcentrifuge Tube Axygen MCT-150-C-S
15 mL Conical Tube SPL 50015
4150 TapeStation System Agilent G2992AA Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633)
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit  Apostle A17622-250 5 mL X 50 preps version
BD Vacutainer blood collection tubes BD 367525 EDTA Blood Collection Tube (10 mL)
BioViewCCBS Clinomics BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 Invitrogen MHCD4522
FAST Auto cartridge Clinomics CLX-M3001
LBx-1 cartridge Clinomics CLX-M4101
LBx-2 cartridge Clinomics CLX-M4201
OPR-2000 instrument Clinomics CLX-I2001
Cover Glass Marienfeld Superior HSU-0101040
DynaMag 2 Magnet Stand Thermo Fisher Scientific 12321D
Ficoll Paque Solution GE healthcare 17-1440-03 density gradient solution
Filter Tip, 10 µL Axygen AX-TF-10 Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 200 µL Axygen AX-TF-200 Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 100 µL Axygen AX-TF-100 Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
Filter Tip, 1000 µL Axygen AX-TF-1000 Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination.
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody BioLegend 324204
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin BD Biosciences 347653
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) Sigma Aldrich 433284
Kimtech Science Wipers Yuhan-Kimberly 41117
Latex glove Microflex 63-754
Magnetic Bead Separation Rack V&P Scientific VP 772F2M-2
Manual Pipetting  (0.5-10 µL) Eppendorf 3120000020
Manual Pipetting  (2-20 µL) Eppendorf 3120000038
Manual Pipetting  (10-100 µL) Eppendorf 3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL) Eppendorf 3120000054
Manual Pipetting  (100-1000 µL) Eppendorf 3120000062
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield abcam ab104139
Normal Human IgG Control R&D Systems 1-001-A
OLYMPUS BX-UCB Olympus 9217316
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 Invitrogen 53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) Corning 21-040CVC
Portable Pipet Aid Drummond 4-000-201
Slide Glass Marienfeld Superior HSU-1000612
StainTray Staining box Simport M920
Sterile Serological Pipette (10 mL) SPL 91010
Triton X-100 solution Sigma Aldrich 93443
TWEEN 20 Sigma Aldrich P7949
Whole Blood Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary.
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) Excelitas 010-00157

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 191
नैदानिक नमूनों से कैंसर से संबंधित पदार्थों का स्वचालित पृथक्करण और संग्रह
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