Summary
В этой статье описывается применение автоматизированного оборудования для легкого и эффективного отделения и сбора веществ, таких как бесклеточная ДНК и циркулирующие опухолевые клетки, из цельной крови.
Abstract
В последнее время жидкие биопсии стали использоваться для диагностики различных заболеваний, в том числе рака. Жидкости организма содержат много веществ, включая клетки, белки и нуклеиновые кислоты, происходящие из нормальных тканей, но некоторые из этих веществ также происходят из больной области. Исследование и анализ этих веществ в жидкостях организма играют ключевую роль в диагностике различных заболеваний. Поэтому важно точно отделить необходимые вещества, и для использования с этой целью разработано несколько методик.
Мы разработали устройство и платформу типа «лаборатория на диске» под названием CD-PRIME. Это устройство автоматизировано и имеет хорошие результаты по загрязнению образца и стабильности образца. Кроме того, он имеет преимущества хорошей доходности приобретения, короткого времени работы и высокой воспроизводимости. Кроме того, в зависимости от типа диска, подлежащего установке, плазма, содержащая бесклеточную ДНК, циркулирующие опухолевые клетки, мононуклеарные клетки периферической крови или пушистые оболочки могут быть разделены. Таким образом, приобретение различных материалов, присутствующих в жидкостях организма, может быть сделано для различных последующих применений, включая изучение омики.
Introduction
Раннее и точное выявление различных заболеваний, в том числе онкологических, является важнейшим фактором в установлении стратегии лечения 1,2,3,4. В частности, раннее выявление рака тесно связано с повышением шансов на выживаемость пациента 5,6,7,8. В последнее время жидкие биопсии находятся в центре внимания для раннего выявления рака. Солидные опухоли подвергаются ангиогенезу и выделяют в кровь различные вещества. В частности, вкрови больных раком обнаружены циркулирующие ДНК (ctDNAs), циркулирующие РНК (ctRNAs), белки, везикулы, такие как экзосомы, и циркулирующие опухолевые клетки (CTC). Хотя существуют различия в количестве этих веществ, они последовательно наблюдаются не только на ранних стадиях, но и на более поздних стадиях 6,10. Однако эти индивидуальные различия очень высоки; например, количество бесклеточной ДНК (cfDNA), содержащей ctDNA, составляет менее 1000 нг, а количество CTC составляет менее 100 в 10 мл цельной крови у больных раком 11,12,13. Многие исследования характеризуют рак с использованием этих веществ, присутствующих в меньших количествах (например, cfDNA, ctDNA и CTC). Для получения точных результатов важно точно отделить небольшие количества веществ с высокой чистотой13,14. Обычно используются обычные методы центрифугирования, но они сложны в обращении и имеют низкую чистоту в зависимости от навыков пользователя. С момента открытия CTC было разработано несколько методов разделения, таких как центрифугирование или разделение по плотности, иммуногранула и микрофлюидные методы. С момента открытия ЦОК было разработано несколько методов сдерживания. Однако эти методы часто ограничены, когда необходимо изолировать клетки из различных чипов и мембран, используемых для их выделения15. Кроме того, методы маркировки требуют такого оборудования, как FACS, и существуют ограничения на последующий процесс из-за загрязнения маркировки.
В последнее время возросло использование жидких биопсий, и проводятся различные исследования для раннего выявления рака. Хотя этот метод прост, все еще существуют трудности в последующем анализе, и различные исследования пытаются преодолеть эти трудности16,17. Кроме того, многие сайты, включая больницы, требуют автоматизированных, воспроизводимых и высокочистых методов, которые удобны в использовании. Здесь мы разработали лабораторию на диске для автоматического отделения веществ от образцов крови после жидкой биопсии. Эти устройства основаны на принципе центрифугирования, микрофлюидики и захвата клеток размером с пору. Существует три типа дисков: LBx-1 может приобретать плазму и пышную оболочку, в то время как LBx-2 может приобретать плазму и PBMC из цельной крови объемом менее 10 мл; FAST-auto также может приобретать CTC с помощью мембраны, которая снимается с диска. До четырех дисков можно использовать за один прогон. Прежде всего, преимущество этого устройства и метода заключается в том, что он может получать различные вещества, полученные из рака, из одного и того же образца, используя небольшое количество крови. Это означает, что кровь пациента должна быть взята только один раз. Кроме того, он имеет преимущество в исключении ошибок из-за различий в периоде забора крови. Эта платформа проста в использовании и обеспечивает точные результаты для жидких биопсий и последующих применений. В этом протоколе введено использование устройства и картриджа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все образцы цельной крови были получены от пациентов с раком легких. Исследования и анализ в Clinomics проводятся Научно-исследовательским институтом геномики рака, а одобрение исследований IRB правительством возглавляется Комитетом по институциональному обзору Медицинского центра Асана (IRB NO. 2021-0802) с номером IRB, зарегистрированным для исследований в Clinomics.
1. Пробоподготовка
- Соберите 9 мл цельной крови в ЭДТА или cfDNA-стабильную пробирку для сбора крови.
- Хорошо перемешайте, перевернув трубку вверх и вниз примерно 10 раз.
- Хранить образцы при комнатной температуре (RT; для кратковременного хранения) или 4 °C (для длительного хранения). Не замораживать и не оттаивать.
2. Подготовка устройства
- Нажмите выключатель питания, чтобы включить прибор.
ПРИМЕЧАНИЕ: На сенсорной панели появляется экран загрузки, и инструмент инициализируется. Держите руки подальше от инструмента во время инициализации. Экран выбора картриджа появится после завершения инициализации прибора. - Выберите режим примера, который будет использоваться. Измените количество образцов, нажав стрелку.
3. Работа устройства и сбор образцов
- Загрузка патрона LBx-1
- Выберите тип картриджа на сенсорной панели прибора. Измените количество образцов, нажав кнопку со стрелкой.
- Откройте дверцу прибора и вставьте все картриджи, которые будут использоваться, в порядке количества на держателе картриджа. Убедитесь, что картридж правильно вставлены и держатель картриджа. Если картридж вставлен неправильно, это может привести к значительному повреждению инструмента.
- В общей сложности четыре картриджа поместите фиктивный картридж в пустое пространство держателя картриджа.
- Используйте опорное колесо для крепления картриджа и затяните стопорную гайку, чтобы закрепить его.
- Закройте дверь и нажмите кнопку RUN на экране сенсорной панели. Прибор закрывает клапаны на картриджах, что занимает примерно 30 с.
- Следуйте сообщению, чтобы открыть дверцу, снять опорное колесо и извлечь закрытый клапан картридж из держателя картриджа.
- Положите картридж на стол и подготовьтесь к введению образца цельной крови. Пипетка максимум 10 мл образца цельной крови с использованием серологической пипетки.
ВНИМАНИЕ: Опасность обращения с кровью. Во время всей процедуры обращения с образцами крови и реагентами важно носить лабораторный халат и лабораторные перчатки. Предоставленный MSDS должен быть тщательно изучен работниками лаборатории. - Вставьте наконечник пипетки глубоко во входное отверстие картриджа и медленно введите образец цельной крови.
ПРИМЕЧАНИЕ При использовании более или равного 9 мл образца цельной крови добавление фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) не требуется. При использовании менее 9 мл образца цельной крови добавьте PBS, чтобы сделать общий объем до 9 мл. Например, при использовании 7,2 мл цельной крови, пожалуйста, добавьте 1,8 мл PBS во входное отверстие образца. Серологическая пипетка или наконечник пипетки могут быть использованы для инъекций цельной крови и PBS. При использовании менее 8 мл образца цельной крови пышная оболочка не может быть восстановлена даже путем добавления 1 мл PBS. Для подготовки к гДНК используйте 200 мкл цельной крови, которая была отделена до этого этапа. - Вставьте картриджи, которые будут использоваться, в порядке количества на держателе картриджа. Используйте опорное колесо для крепления картриджа и затяните стопорную гайку, чтобы закрепить его. Закройте дверь и нажмите кнопку OK .
ПРИМЕЧАНИЕ: Плазма и пышная оболочка отделяются от цельной крови автоматически, что занимает около 30 минут.
ОСТОРОЖНО Опасность во время работы. Открытие двери или прикосновение к инструменту во время высокоскоростных операций вращения может привести к серьезным травмам. Также существует риск получения травмы из-за асимметричной нагрузки ротора. Если необычные вибрации и шумы возникают, когда инструмент запускается в режиме вспомогательного обогащения клеток или экспертном режиме, размещение картриджа может быть асимметричным. Немедленно нажмите клавишу питания, чтобы остановить и правильно установить картридж. - Ищите сообщение на экране, сопровождаемое звуком тревоги, который появляется, когда разделение плазмы и пышного пальто завершено.
- Остановите сигнал тревоги, открыв дверь или нажав кнопку STOP . Откройте дверцу, извлеките картридж и положите его на стол.
- Извлеките 3 мл плазмы из плазменного выхода с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл. Извлеките пушистый слой объемом 3 мл из выходного отверстия для пальто с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл.
- Загрузка картриджа LBx-2
- Выберите имя картриджа на сенсорной панели прибора. Измените количество образцов, нажав кнопку со стрелкой.
- Откройте дверцу и вставьте картриджи, которые будут использоваться, в порядке номера на держателе картриджа.
- В общей сложности четыре картриджа поместите фиктивный картридж в пустое пространство держателя картриджа.
- Используйте опорное колесо для крепления картриджа и затяните стопорную гайку, чтобы закрепить его. Убедитесь, что картридж правильно вставлен в держатель картриджа. Если картридж вставлен неправильно, это может привести к значительному повреждению инструмента.
- Закройте дверь и нажмите кнопку RUN на экране сенсорной панели. Прибор закрывает клапаны на картридже, что занимает примерно 30 с.
- Следуйте сообщению, чтобы открыть дверцу, снять опорное колесо, а также извлечь закрытый клапан картридж из держателя картриджа и поместить его на стол.
- Положите картридж на стол и подготовьтесь к введению раствора градиента плотности и образца цельной крови. Проверьте объем раствора градиента плотности и PBS, подлежащего инъекции, в зависимости от объема образца цельной крови (дополнительная таблица 1).
- Пипетка градиентного раствора плотности с помощью серологической пипетки. Вставьте наконечник пипетки глубоко во входное отверстие картриджа и медленно введите раствор градиента плотности.
- После инъекции раствора градиента плотности пипетку образца цельной крови с помощью серологической пипетки. Вставьте наконечник пипетки глубоко во входное отверстие картриджа и медленно введите образец цельной крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании менее 9 мл образца цельной крови добавьте PBS, ссылаясь на эту таблицу (Дополнительная таблица 1). - Вставьте картриджи для использования в соответствии с номером на держателе картриджа. Используйте опорное колесо для крепления картриджа и затяните стопорную гайку, чтобы закрепить его. Закройте дверь и нажмите кнопку OK .
- Плазма и PBMC отделяются от цельной крови автоматически, что занимает примерно 30 минут. Ищите сообщение, которое появляется, сопровождаемое звуком тревоги, когда разделение плазмы и PBMC завершено.
- Остановите сигнал тревоги, открыв дверь или нажав кнопку STOP . Откройте дверцу, извлеките картридж и положите его на стол.
- Извлеките 3 мл плазмы из плазменного выхода с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл. Извлеките 3 мл PBMC из розетки PBMC с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл.
- Загрузка картриджа FAST-auto
- Выберите картридж на сенсорной панели прибора. Измените количество образцов, нажав кнопку со стрелкой.
- Откройте дверцу и вставьте картриджи, которые будут использоваться, в порядке номера на держателе картриджа. В общей сложности четыре картриджа поместите фиктивный картридж в пустое пространство держателя картриджа.
- Используйте опорное колесо для крепления картриджа и затяните стопорную гайку, чтобы закрепить его.
- Закройте дверь и нажмите кнопку RUN на экране сенсорной панели. Прибор закрывает клапаны на картридже, что занимает примерно 30 с.
- Следуйте сообщению, чтобы открыть дверцу, снять опорное колесо и извлечь закрытый клапан картридж из держателя картриджа.
- Поместите картридж на стол и подготовьтесь к инъекции раствора PBS и образца цельной крови. Пипетка 6 мл раствора PBS с использованием серологической пипетки. Вставьте наконечник пипетки глубоко во входное отверстие картриджа PBS и медленно введите 6 мл раствора PBS.
- После инъекции раствора PBS пипетку 3 мл цельной крови или образца PBMC, полученного из LBx-2 с использованием серологической пипетки, которую предварительно промывали 1% BSA для предотвращения прилипания остатка. Вставьте наконечник пипетки глубоко во входное отверстие картриджа и медленно введите образец цельной крови.
- Вставьте картриджи, которые будут использоваться, в порядке количества на держателе картриджа. Используйте опорное колесо для крепления картриджа и затяните стопорную гайку, чтобы закрепить его. Закройте дверь и нажмите кнопку OK .
- ЦОК обогащаются цельной кровью автоматически, что занимает примерно 15 минут. Найдите сообщение, которое появляется в сопровождении звукового сигнала тревоги, когда обогащение CTC завершено. Остановите сигнал тревоги, открыв дверь или нажав кнопку STOP .
- Откройте дверцу, извлеките картридж и положите его на стол. Вставьте устройство для удаления задней пластины (BPR) в четыре отверстия на передней панели картриджа. Нажмите на темно-синее крыло большими пальцами обеих рук, а затем нажимайте на светло-голубое тело, пока оно не щелкнет.
- Осторожно извлеките корпус картриджа, подняв его вверх. Очень аккуратно подберите фильтрующую мембрану за край с помощью пинцета. Пожалуйста, убедитесь, что вы используете внешний обод (крайняя часть шириной 1 мм) фильтрующей мембраны, чтобы зажать и удерживать фильтрующую мембрану.
- Осторожно поместите фильтрующую мембрану (на которой находятся обогащенные ЦОК) в трубку объемом 1,5 мл для приготовления нуклеиновых кислот. При необходимости восстановите отфильтрованную кровь к выходу крови с помощью наконечника пипетки объемом 1 мл.
4. Обслуживание системы
- Подготовка к очистке и дезинфекции инструмента
- Очищайте все доступные поверхности инструмента и аксессуаров раз в неделю, используя этанол и высушенные ткани, а также сразу при загрязнении.
- Регулярно очищайте чашу и вал ротора, используя спирт (этанол и изопропанол) или дезинфицирующие средства на спиртовой основе.
- Очистка и дезинфекция инструмента
ПРИМЕЧАНИЕ: Общие сведения об устранении неполадок и другие примечания на устройстве см. в Дополнительной таблице 2.- Выключите прибор с помощью главного выключателя питания. Отсоедините вилку питания от блока питания.
- Откройте дверцу и очистите и продезинфицируйте все доступные поверхности инструмента, включая кабель питания, используя влажную ткань и рекомендуемые чистящие средства.
- Проверьте вал ротора на наличие повреждений. Осмотрите прибор на предмет коррозии и повреждений.
- Подключайте прибор к блоку питания только в том случае, если он полностью высох внутри и снаружи.
- Отсоедините основную вилку питания и извлеките держатель предохранителя. Держатель предохранителя расположен над розеткой. Замените использованный предохранитель на запасной из контейнера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Целью этой методики является легкое и автоматическое выделение связанных с раком веществ из цельной крови. В частности, любой желающий может использовать эту технику во всех подходящих областях исследований и анализа. Одновременное и воспроизводимое разделение нескольких веществ в одном образце крови имеет значение при жидкой биопсии. Диски LBx-1 и LBx-2 используются для выделения плазмы и пышной оболочки или PBMC из цельной крови. На рисунке 1 показаны материалы, разделенные применением данного устройства. Во-первых, плазму получали из 10 мл крови с использованием LBx-1 или PBMCs получали с использованием LBx-2. Во-вторых, 3 мл отделенного пухлого слоя повторно вводили PBS в FAST-auto, а CTC фильтровали через мембрану. В-третьих, мембрану переносили в трубку, заполненную буфером хранения или сразу же используемую для окрашивания. Для других применений или длительного хранения CTC могут быть легко удалены из мембраны путем вихря.
CfDNA извлекали из плазмы с использованием магнитного выделения ДНК на основе шариков, способного захватывать ДНК по размеру по концентрации шарика. Концентрацию и чистоту cfDNA измеряли с помощью биоанализатора. Хорошо известно, что концентрация cfDNA, включая ctDNA, варьируется в зависимости от типа и стадии рака18. Кроме того, большинство cfDNA имеет длину 166 bp, а некоторые примерно в два или три раза длиннее. Хотя существует разница в количестве, полученном из каждого отдельного образца, например, 8,47 нг/мл и 5,2 нг/мл, результаты экстракции cfDNA были хорошими как для концентрации, так и для распределения по размерам во всех случаях (рисунок 2). Эти результаты показывают, что метод LBx-1 точно разделяет плазму, содержащую cfDNA.
В FAST-auto мембрану удаляли и окрашивали флуоресцентными антителами для обнаружения ЦОК и лейкоцитов (лейкоцитов). Витражная мембрана, размещенная на стеклянных слайдах, наблюдалась под флуоресцентным микроскопом. Окрашивание и микроскопические исследования были проведены после предыдущего исследования19. Только ЦОК можно специально различать с помощью антител EpCAM/Cytokeratin (CTC положительный маркер) и CD45 (WBC положительный маркер). Каждая мембрана захватила в общей сложности 310 и 998 клеток соответственно. Среди них в общей сложности 3 и 43 ЦОК были подсчитаны в образцах 1 и 2 соответственно (рисунок 3). Метод, используемый в этом исследовании, позволяет легко определить наличие и количество ЦОД. Кроме того, изменения концентрации cfDNA и числа CTC могут быть использованы для легкого мониторинга наличия и рецидива рака в полевых условиях. В частности, поскольку в этих методах не используются другие реагенты, которые могут повлиять на результаты, возможны последующие эксперименты с полученным материалом.
Рисунок 1: Рабочий процесс метода дискового перемешивания для одновременного отделения веществ от цельной крови. (А) Получена плазма, содержащая cfDNA. (B) CTC удаляются из пышного пальто. (С,Г) После вихря CTC отделяются от мембраны, и небольшое количество CTC все еще остается на мембране. Как полученные клетки, так и мембрана могут подвергаться длительному хранению путем замораживания образцов в буфере хранения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Чистота и количество экстрагированной cfDNA. Извлеченные cfDNAs оценивали с помощью биоанализатора, а экранные ленты cfDNA использовали вместе с электронной лестницей. Зеленая линия использовалась для выравнивания между лестницей (слева) и образцом (справа). Треугольные знаки указывают на полосу ДНК. Большая часть cfDNA составляет 166 bp, а некоторые существуют в целочисленных кратных длине. Обычно концентрация cfDNA измеряется размером от 50 bp до 700 bp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Подсчет ЦОК с использованием мембранного окрашивания. После окрашивания мембранной иммуноцитохимии клетки показывают сигналы DAPI (ядерный положительный) синим цветом, в то время как EpCAM / CK (CTC положительный) и CD45 (WBC положительный) выделены зеленым и красным цветом соответственно. Флуоресцентные сигналы измерялись с помощью флуоресцентного микроскопа. Шкала указывает на 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительная таблица 1: Состав конечного объема для использования раствора градиента плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная таблица 2: Общие вопросы и предостережения в отношении технического обслуживания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Количество и концентрация cfDNA и CTC зависит от индивидуальности, стадии и типа рака. Это также зависит от состояния больного 2,4,5,10,20. В частности, на ранних или предраковых стадиях рака концентрации связанных с раком веществ очень низкие, поэтому существует высокая вероятность того, что его невозможно обнаружить. Тем не менее, раннее выявление оказывает очень положительное влияние на выживаемость пациентов и разработку стратегии лечения. Поскольку cfDNA и CTC имеют короткие периоды полураспада в крови, они отражают информацию в режиме реального времени о раке 21,22,23,24,25. Поэтому для одновременного приобретения различных связанных с раком веществ требуется большое количество крови при одинаковых условиях. Система, показанная здесь, предоставляет пользователям простой метод. Пользователь может выбрать и использовать диск, соответствующий материалу, необходимому из цельной крови. Используя один из данных картриджей, можно получить плазму, содержащую cfDNA, и CTC могут быть собраны из того же образца крови, растраченного пальто или PBMC путем повторной инъекции в диск FAST-auto (рисунок 1).
Захват CTC на основе размера прост, но он имеет ограничения по чистоте. Существует много различных форм и размеров клеток в крови26. Лейки различаются по размеру от 8 до 16 мкм27. В другом исследовании средний размер измеренного лейкоцита составил 9 мкм. С другой стороны, минимальный размер изолированных ЦОК составляет 16 мкм, а средний размер составляет 30 мкм28. Кроме того, ЦОК присутствуют в очень небольшом количестве в крови пациента по сравнению с другими клетками крови. Минимизация загрязнения WBC важна для последующего анализа. Хотя обнаружение на основе антител может захватывать CTC, анализ с высоким разрешением, такой как NGS, требует дополнительных методов сбора одной клетки или высокого уровня анализа биоинформатики.
В последнее время внедрены методы интуитивного наблюдения за наличием ЦОК перед анализом высокого разрешения с использованием различных методов захвата29. Как показано в результатах, мембрана, полученная из картриджа FAST-auto, может быть окрашена непосредственно для обнаружения CTC. Захваченные CTC также могут быть легко повторно суспендированы из мембраны путем вихря для хранения или дальнейших применений, таких как клеточная культура (рисунок 1).
Этот метод использует принципы центрифугирования и микрофлюидики. Поэтому важен баланс оборудования и диска, а также важно закрепить его держателем диска. Важно заполнить любой начальный недостаточный общий объем PBS. Если начальная сумма недостаточна, может возникнуть проблема, приводящая к трудностям при переходе в следующее пространство. Выньте держатель диска на столешницу, чтобы предотвратить загрязнение оборудования и перемещать жидкости в диск и из него. В случае диска FAST-auto быстро обработайте образцы, чтобы уменьшить повреждение CTC в мембране. В частности, будьте осторожны, чтобы предотвратить загрязнение при обращении с мембраной и следовать установленному протоколу для длительного хранения.
Тем не менее, этот метод прост в использовании и может обрабатывать от одного до четырех образцов одновременно. Также различные подложки из жидкости можно получить, просто заменив диск. Кроме того, не требуется никаких дополнительных реагентов, кроме использования раствора градиента плотности для получения МПК. Поэтому полученный материал хорош для последующего использования.
Этот метод все еще имеет некоторые ограничения. Пользователь не может изменять диск произвольно, и различные типы дисков не могут использоваться одновременно. Также существуют ограничения на максимальный объем, поэтому для больших объемов крови необходимо использовать несколько дисков. Для получения cfDNA по-прежнему необходимы дополнительные методы. Используя мембрану, трудно получить только CTC с помощью метода захвата размером с пору. Поэтому выбор или сортировка ячеек требуется для экспериментов по применению CTC.
В организме есть различные жидкости, и производство определенных жидкостей организма связано с болезнью30. В настоящее время использование жидкости организма крови проводится только для анализа. В будущем оптимальный протокол может быть установлен путем подтверждения производительности в различных жидкостях организма, таких как моча, асцит, плевральная жидкость и спинномозговая жидкость. Чтобы обеспечить более удобный метод для пользователей, в настоящее время разрабатываются устройства, которые автоматически извлекают cfDNA из диска. Кроме того, разрабатывается оборудование, способное выполнять количественную ПЦР непосредственно в диске после экстракции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, связанного с данной работой.
Acknowledgments
Эта рукопись была частично поддержана Корейским фондом разработки медицинских изделий (KMDF, грант No RS-2020-KD000019) и Корейским институтом развития индустрии здравоохранения (KHIDI, грант No HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
