Summary
本文描述了自动化设备在轻松有效地从全血中分离和收集物质(如无细胞 DNA 和循环肿瘤细胞)的应用。
Abstract
最近,液体活检已被用于诊断各种疾病,包括癌症。体液含有许多物质,包括来自正常组织的细胞、蛋白质和核酸,但其中一些物质也来自患病区域。体液中这些物质的调查和分析在各种疾病的诊断中起着举足轻重的作用。因此,准确分离所需物质非常重要,为此开发了几种技术。
我们开发了一种名为CD-PRIME的光盘实验室类型的设备和平台。该设备是自动化的,在样品污染和样品稳定性方面具有良好的结果。此外,它具有采集良率好、操作时间短、重现性高等优点。此外,根据要安装的椎间盘类型,可以分离含有游离DNA的血浆,循环肿瘤细胞,外周血单核细胞或血沉棕黄层。因此,体液中存在的各种材料的采集可以用于各种下游应用,包括组学研究。
Introduction
早期准确地发现包括癌症在内的各种疾病是建立治疗策略的最重要因素1,2,3,4。特别是,癌症的早期发现与患者生存机会的增加密切相关5,6,7,8。最近,液体活检已成为早期发现癌症的焦点。实体瘤经历血管生成并将各种物质释放到血液中。特别是,在癌症患者的血液中发现了循环DNA(ctDNA),循环RNA(ctRNA),蛋白质,外泌体等囊泡和循环肿瘤细胞(CTC)2,9。尽管这些物质的含量存在差异,但它们不仅在早期阶段而且在后期阶段都一致观察到6,10。然而,这些个体差异非常高;例如,含有ctDNA的无细胞DNA(cfDNA)的量小于1,000ng,来自癌症患者的10 mL全血中的CTC数量小于100 11,12,13。许多研究已经使用这些含量较少的物质(即cfDNA,ctDNA和CTC)来表征癌症。为了获得准确的结果,准确分离少量高纯度13,14的物质非常重要。通常使用传统的离心方法,但根据用户的技能,它们难以处理且纯度低。自CTCs被发现以来,已经开发了几种分离技术,例如离心或密度级分离,免疫珠和微流体方法。自发现CTC以来,已经开发了几种遏制技术。然而,当需要从用于分离细胞的各种芯片和膜中分离细胞时,这些技术通常受到限制15。此外,标记方法需要FACS等设备,并且由于标记污染,下游过程存在限制。
最近,液体活检的使用有所增加,并且正在进行各种研究以早期发现癌症。虽然这种方法很简单,但在下游分析中仍然存在困难,各种研究都在试图克服这些困难16,17。此外,包括医院在内的许多场所都需要自动化、可重复和高纯度、易于使用的方法。在这里,我们开发了一种光盘实验室,用于在液体活检后自动分离血液样本中的物质。这些设备基于离心、微流体和孔径细胞捕获的原理。有三种类型的椎间盘:LBx-1 可以获取血浆和血沉棕黄层,而 LBx-2 可以从体积小于 10 mL 的全血中获取血浆和 PBMC;FAST-auto还可以使用可从光盘上去除的膜来获取CTC。每次运行最多可使用四个光盘。最重要的是,这种装置和方法的优点是它可以使用少量血液从同一样本中获得多种癌症衍生物质。这意味着患者的血液只需要抽一次。此外,它还具有排除由于血液采样时间差异而导致的错误的优点。该平台易于使用,可为液体活检和下游应用提供准确的结果。在此协议中,介绍了设备和墨盒的使用。
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Protocol
所有全血样本均取自肺癌患者。Clinomics的研究和分析由癌症基因组学研究所进行,政府的IRB研究批准由牙山医学中心机构审查委员会(IRB NO. 2021-0802)领导,IRB编号在Clinomics注册用于研究。
1. 样品制备
- 将 9 mL 全血收集到 EDTA 或 cfDNA 稳定的采血管中。
- 通过上下翻转试管约 10 次来充分混合。
- 将样品储存在室温(RT;用于短期储存)或4°C(用于长期储存)。不要冷冻和解冻。
2. 设备准备
- 按下电源开关打开仪器。
注意: 触摸板上出现加载屏幕,仪器已初始化。在初始化过程中,双手远离仪器。仪器初始化完成后,将出现墨盒选择屏幕。 - 选择要使用的采样模式。按箭头更改样本数。
3. 设备操作和样品采集
- 装载 LBx-1 墨盒
- 在仪器的触摸屏面板上选择墨盒类型。通过按箭头按钮更改样本数。
- 打开仪器的门,按照墨盒支架上的编号顺序插入所有要使用的墨盒。确保正确插入墨盒和墨盒支架。如果墨盒插入不正确,可能会对仪器造成相当大的损坏。
- 对于总共四个墨盒,请将虚拟墨盒放在墨盒支架的空白处。
- 使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。
- 关上门,然后按触摸板屏幕上的 RUN 按钮。仪器关闭滤芯上的阀门,大约需要 30 秒。
- 按照消息打开门,卸下支撑轮,然后从阀式磁带盒支架上卸下阀门关闭的滤芯。
- 将墨盒放在桌子上,准备注射全血样本。使用血清移液器最多吸取 10 mL 的全血样品。
注意:处理血液的危险。在处理血液样本和试剂的整个过程中,穿上实验室外套和实验室手套非常重要。实验室工作人员应彻底研究所提供的MSDS。 - 将移液器吸头深深插入墨盒的样品入口,然后缓慢注入全血样品。
注意 当使用大于或等于 9 mL 的全血样本时,无需添加磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。当使用少于 9 mL 的全血样本时,添加 PBS 以使总体积达到 9 mL。例如,当使用 7.2 mL 全血时,请将 1.8 mL PBS 添加到样品入口中。血清移液器或移液器吸头可用于注射全血和PBS。当使用少于 8 mL 的全血样本时,即使添加 1 mL PBS 也可能无法恢复血沉棕黄层。对于 gDNA 制备,使用 200 μL 全血,在此步骤之前分离。 - 按墨盒支架上的编号顺序插入要使用的墨盒。使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。关上门,然后按 “确定” 按钮。
注意:血浆和血沉棕黄层自动与全血分离,大约需要30分钟。
注意操作过程中的危险。在高速旋转操作期间打开门或触摸仪器可能会导致严重伤害。由于转子的不对称负载,也存在受伤的风险。如果仪器在辅助细胞富集或专家模式下启动时出现异常振动和噪音,则墨盒放置可能不对称。立即按电源键停止并正确安装墨盒。 - 在屏幕上查找带有警报声音的消息,该消息在血浆和血沉棕黄层的分离完成后出现。
- 通过打开门或按停止按钮 停止 警报。打开门,取出墨盒,然后将其放在桌子上。
- 使用 1 mL 移液器吸头从血浆出口回收 3 mL 血浆。使用 1 mL 移液器吸头从血沉棕黄层出口回收 3 mL 的血沉棕黄层。
- 装载 LBx-2 墨盒
- 在仪器的触摸屏面板上选择墨盒名称。通过按箭头按钮更改样本数。
- 打开门,按墨盒支架上的编号顺序插入要使用的墨盒。
- 对于总共四个墨盒,请将虚拟墨盒放在墨盒支架的空白处。
- 使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。确保将墨盒正确插入墨盒支架。如果墨盒插入不正确,可能会对仪器造成相当大的损坏。
- 关上门,然后按触摸板屏幕上的 RUN 按钮。仪器关闭滤芯上的阀门,大约需要 30 秒。
- 按照消息打开门,卸下支撑轮,然后从墨盒支架上取下阀门关闭的墨盒并将其放在桌子上。
- 将墨盒放在桌子上,准备注入密度梯度溶液和全血样品。根据全血样品的体积检查要注射的密度梯度溶液和PBS的体积(补充表1)。
- 使用血清移液器移液密度梯度溶液。将移液器吸头深深插入墨盒的入口,然后缓慢注入密度梯度溶液。
- 注入密度梯度溶液后,使用血清移液器移取全血样品。将移液器吸头深深插入墨盒的样品入口,然后缓慢注入全血样品。
注意:当使用少于9 mL的全血样本时,请参阅此表添加PBS(补充表1)。 - 根据墨盒支架上的编号按顺序插入要使用的墨盒。使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。关上门,然后按 “确定” 按钮。
- 血浆和PBMC自动从全血中分离,大约需要30分钟。查找等离子体和PBMC分离完成后出现的警报声消息。
- 通过打开门或按停止按钮 停止 警报。打开门,取出墨盒,然后将其放在桌子上。
- 使用 1 mL 移液器吸头从血浆出口回收 3 mL 血浆。使用 1 mL 移液器吸头从 PBMC 出口回收 3 mL PBMC。
- 装载快速自动墨盒
- 在仪器的触摸屏面板上选择墨盒。通过按箭头按钮更改样本数。
- 打开门,按墨盒支架上的编号顺序插入要使用的墨盒。对于总共四个墨盒,请将虚拟墨盒放在墨盒支架的空白处。
- 使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。
- 关上门,然后按触摸板屏幕上的 RUN 按钮。仪器关闭滤芯上的阀门,大约需要 30 秒。
- 按照消息打开门,卸下支撑轮,然后从阀式磁带盒支架上卸下阀门关闭的滤芯。
- 将墨盒放在桌子上,准备注射PBS溶液和全血样本。使用血清移液器移取 6 mL PBS 溶液。将移液器吸头深深插入小柱的PBS入口,然后缓慢注入6 mL的PBS溶液。
- 注射PBS溶液后,使用血清移液器移取从LBx-2获得的3 mL全血或PBMC样品,先前用1%BSA冲洗以防止残留物粘连。将移液器吸头深深插入墨盒的样品入口,然后缓慢注入全血样品。
- 按墨盒支架上的编号顺序插入要使用的墨盒。使用支撑轮安装墨盒并拧紧锁紧螺母以固定它。关上门,然后按 “确定” 按钮。
- CTC自动从全血中富集,大约需要15分钟。查找在 CTC 富集完成时伴随警报声显示的消息。通过打开门或按停止按钮 停止 警报。
- 打开门,取出墨盒,然后将其放在桌子上。将背板去除器 (BPR) 插入墨盒正面的四个孔中。用双手拇指按压深蓝色的机翼,然后按压浅蓝色的机身,直到它发出咔嗒声。
- 提起墨盒主体,小心地将其卸下。使用镊子非常轻柔地捡起边缘的滤膜。请确保使用滤膜的外缘(1毫米宽的边缘部分)捏住滤膜。
- 小心地将滤膜(富集的CTC驻留在其上)放入1.5 mL管中以进行核酸制备。如有必要,使用 1 mL 移液器吸头将过滤后的血液回收到出血口。
4. 系统的维护
- 准备仪器的清洁和消毒
- 使用乙醇和干燥的组织每周清洁仪器和附件的所有可接近表面一次,并在污染时立即清洁。
- 定期使用酒精(乙醇和异丙醇)或酒精类消毒剂清洁转鼓和转子轴。
- 清洁和消毒仪器
注:有关计算机上的一般故障排除和其他说明,请参阅 补充表 2。- 使用主电源开关关闭仪器。断开电源插头与电源的连接。
- 打开门,使用湿布和推荐的清洁剂清洁和消毒仪器的所有可接触表面,包括电源线。
- 检查转子轴是否损坏。检查仪器是否腐蚀和损坏。
- 仅当仪器内外完全干燥时,才将仪器连接到电源。
- 断开主电源插头并卸下保险丝座。保险丝座位于电源插座上方。用容器中的备用保险丝更换用过的保险丝。
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Representative Results
该技术的目标是轻松自动地从全血中分离出癌症相关物质。特别是,任何人都可以在所有合适的研究和分析领域使用这种技术。在液体活检中,在单个血液样本中同时且可重复地分离多种物质具有重要意义。LBx-1 和 LBx-2 椎间盘用于从全血中分离血浆和血沉棕黄层或 PBMC。 图1 显示了通过应用该器件分离的材料。首先,使用LBx-1从10mL血液中获得血浆,或使用LBx-2获得PBMC。其次,将3 mL分离的血沉棕黄层重新注入PBS到FAST-auto中,并通过膜过滤CTC。第三,将膜转移到装有储存缓冲液的管中或立即用于染色。对于其他应用或长期储存,CTC可以通过涡旋轻松地从膜上去除。
使用基于磁珠的DNA分离从血浆中提取cfDNA,该DNA能够通过磁珠浓度逐大小捕获DNA。使用生物分析仪测量cfDNA的浓度和纯度。众所周知,cfDNA的浓度,包括ctDNA,根据癌症的类型和阶段而变化18。此外,大多数cfDNA的长度为166 bp,有些大约是其两倍或三倍。尽管从每个单独样品中获得的量存在差异,例如8.47 ng/mL和5.2 ng/mL,但cfDNA提取的结果在所有情况下的浓度和尺寸分布都很好(图2)。这些结果表明,LBx-1方法可以准确分离含有cfDNA的血浆。
在FAST-auto中,去除膜并用荧光抗体染色,以检测CTC和白细胞(WBC)。在荧光显微镜下观察放置在载玻片上的彩色膜。染色和显微镜研究是在先前的研究19之后进行的。只有 CTC 才能使用 EpCAM/细胞角蛋白(CTC 阳性标志物)和 CD45(WBC 阳性标志物)抗体进行特异性区分。每个膜分别捕获总共310个和998个细胞。其中,样本1和2中分别计数了3个和43个CTC(图3)。本研究中使用的方法可以很容易地确定CTC的存在和数量。此外,cfDNA浓度和CTC数的变化可用于轻松监测该领域癌症的存在和复发。特别是,由于这些方法不使用可能影响结果的其他试剂,因此可以使用获得的材料进行下游实验。
图 1:用于同时从全血中分离物质的圆盘混合方法的工作流程 。 (A)获得含有cfDNA的血浆。(B) 从血沉棕黄层中取出 CTC。(中,四)涡旋后,CTC从膜上分离,少量CTC仍留在膜上。获得的细胞和膜都可以通过在储存缓冲液中冷冻样品来进行长期储存。 请点击此处查看此图的大图。
图2:提取的cfDNA的纯度和数量。 使用生物分析仪评估提取的cfDNA,并将cfDNA筛选带与电子梯一起使用。绿线用于梯子(左)和样品(右)之间的对齐。三角形标记表示DNA条带。大多数cfDNA是166 bp,有些以长度的整数倍存在。通常,cfDNA的浓度高达50 bp至700 bp。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:使用膜染色对 CTC 进行计数。 膜免疫细胞化学染色后,细胞以蓝色显示DAPI(核阳性)信号,而EpCAM/CK(CTC阳性)和CD45(WBC阳性)分别以绿色和红色突出显示。使用荧光显微镜测量荧光信号。比例尺表示 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
补充表1:密度梯度溶液使用的最终体积的组成。请点击此处下载此文件。
补充表2:一般问题和维护注意事项。请点击此处下载此文件。
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Discussion
cfDNA和CTC的数量和浓度取决于癌症的个体,分期和类型。这也取决于患者2,4,5,10,20的状况。特别是在癌症的早期或癌前阶段,癌症相关物质的浓度非常低,因此很有可能无法检测到。然而,早期发现对患者生存和治疗策略的建立具有非常积极的影响。由于cfDNA和CTC在血液中的半衰期很短,它们反映了有关癌症的实时信息21,22,23,24,25。因此,为了同时获得各种癌症相关物质,在相同条件下需要大量的血液。此处显示的系统为用户提供了一个简单的方法。用户可以选择和使用与全血所需材料相对应的光盘。使用给定的墨盒之一,可以获得含有cfDNA的血浆,并且可以通过重新注射到FAST自动光盘中,从相同的血液样本,废的血沉棕黄层或PBMC中收集CTC(图1)。
基于大小的CTC捕获很简单,但对纯度有限制。血液中有许多不同形状和大小的细胞26。白细胞的大小从8到16μm不等27。在另一项研究中,测量的WBC的平均大小为9μm。另一方面,分离的CTC的最小尺寸为16μm,平均尺寸为30μm28。此外,与其他血细胞相比,CTC在患者血液中的含量非常少。尽量减少白细胞污染对于下游分析非常重要。虽然基于抗体的检测可以捕获CTC,但NGS等高分辨率分析需要额外的单细胞挑选技术或高水平的生物信息学分析。
最近,已经实施了在使用各种捕获技术进行高分辨率分析之前直观观察CTC存在的方法29。如结果所示,从FAST-auto滤芯获得的膜可以直接染色以进行CTC检测。捕获的CTC也可以通过涡旋轻松地从膜上重悬,以进行存储或进一步应用,例如细胞培养(图1)。
该方法使用离心和微流体的原理。因此,设备和光盘的平衡很重要,用光盘支架固定也很重要。用PBS填充任何初始不足的总体积很重要。如果初始金额不足,则可能会出现导致难以移动到下一个空间的问题。将光盘支架放在桌面上,以防止污染设备并将液体移入和移出光盘。在FAST-auto圆盘的情况下,快速处理样品以减少对膜中CTC的损坏。特别是,在处理膜时要小心防止污染,并遵循既定的长期储存方案。
然而,这种方法易于使用,可以同时处理一到四个样品。此外,只需更换圆盘即可获得各种液体基质。此外,除了使用密度梯度溶液获得PBMC外,不需要其他试剂。因此,获得的材料有利于下游使用。
此方法仍有一些限制。用户不能随意修改光盘,不同类型的光盘不能同时使用。此外,最大血量也有限制,因此必须使用多个椎间盘来处理大量血液。仍然需要额外的方法来获得cfDNA。使用膜,很难仅使用孔径捕获方法获得CTC。因此,CTC特异性应用实验需要细胞选择或分选。
体内有各种体液,某些体液的产生与疾病30有关。目前,使用血液体液仅用于分析。将来,可以通过确认尿液、腹水、胸腔积液和脊髓液等各种体液的性能来建立最佳方案。为了为用户提供更方便的方法,目前正在开发从光盘中自动提取cfDNA的设备。此外,能够在提取后直接在圆盘内进行定量PCR的设备正在开发中。
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Disclosures
作者与本作品没有利益冲突。
Acknowledgments
这份手稿得到了韩国医疗器械发展基金(KMDF,批准号RS-2020-KD000019)和韩国健康产业发展研究所(KHIDI,批准号HI19C0521020020)的部分支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
Latex glove | Microflex | 63-754 | |
Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
StainTray Staining box | Simport | M920 | |
Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
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