Summary
Dieser Artikel beschreibt die Anwendung automatisierter Geräte zur einfachen und effizienten Trennung und Sammlung von Substanzen, wie z. B. zellfreier DNA und zirkulierenden Tumorzellen, aus Vollblut.
Abstract
In jüngster Zeit wurden Flüssigbiopsien verwendet, um verschiedene Krankheiten, einschließlich Krebs, zu diagnostizieren. Körperflüssigkeiten enthalten viele Substanzen, einschließlich Zellen, Proteine und Nukleinsäuren, die aus normalem Gewebe stammen, aber einige dieser Substanzen stammen auch aus dem erkrankten Bereich. Die Untersuchung und Analyse dieser Substanzen in den Körperflüssigkeiten spielt eine zentrale Rolle bei der Diagnose verschiedener Erkrankungen. Daher ist es wichtig, die erforderlichen Substanzen genau zu trennen, und es werden mehrere Techniken entwickelt, die zu diesem Zweck verwendet werden können.
Wir haben ein Lab-on-a-Disc-Gerät und eine Plattform namens CD-PRIME entwickelt. Dieses Gerät ist automatisiert und hat gute Ergebnisse für die Probenkontamination und Probenstabilität. Darüber hinaus hat es die Vorteile einer guten Erfassungsausbeute, einer kurzen Betriebszeit und einer hohen Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus können je nach Art der zu montierenden Scheibe Plasma mit zellfreier DNA, zirkulierenden Tumorzellen, peripheren mononukleären Blutzellen oder Buffy-Coats getrennt werden. So kann die Erfassung einer Vielzahl von Materialien, die in den Körperflüssigkeiten vorhanden sind, für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen, einschließlich der Untersuchung von Omics, erfolgen.
Introduction
Die frühzeitige und genaue Erkennung verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs, ist der wichtigste Faktor bei der Festlegung einer Behandlungsstrategie 1,2,3,4. Insbesondere die Früherkennung von Krebs steht in engem Zusammenhang mit erhöhten Überlebenschancen für den Patienten 5,6,7,8. In jüngster Zeit stehen Flüssigbiopsien für die Früherkennung von Krebs im Rampenlicht. Solide Tumoren durchlaufen eine Angiogenese und setzen verschiedene Substanzen in das Blut frei. Insbesondere zirkulierende DNA (ctDNAs), zirkulierende RNAs (ctRNAs), Proteine, Vesikel wie Exosomen und zirkulierende Tumorzellen (CTCs) wurden im Blut von Krebspatienten gefunden 2,9. Obwohl es Unterschiede in der Menge dieser Substanzen gibt, werden sie nicht nur in den frühen Stadien, sondern auch in den späteren Stadien konsequent beobachtet 6,10. Diese individuellen Unterschiede sind jedoch sehr hoch; Zum Beispiel beträgt die Menge an zellfreier DNA (cfDNA), die ctDNA enthält, weniger als 1.000 ng und die Anzahl der CTCs weniger als 100 in 10 ml Vollblut von Krebspatienten11,12,13. Viele Studien haben Krebs mit diesen Substanzen charakterisiert, die in geringeren Mengen vorhanden sind (d.h. cfDNA, ctDNA und CTCs). Um genaue Ergebnisse zu erhalten, ist es wichtig, kleine Mengen von Substanzen mit hoher Reinheit13,14 genau zu trennen. Konventionelle Zentrifugationsmethoden werden häufig verwendet, aber sie sind schwierig zu handhaben und haben je nach Geschicklichkeit des Benutzers eine geringe Reinheit. Seit der Entdeckung von CTCs wurden verschiedene Trenntechniken entwickelt, wie z. B. Zentrifugation oder Dichtegradtrennung, Immunbead und mikrofluidische Methoden. Seit der Entdeckung von CTCs wurden mehrere Containment-Techniken entwickelt. Diese Techniken sind jedoch oft begrenzt, wenn es notwendig ist, Zellen aus den verschiedenen Chips und Membranen zu isolieren, die verwendet werden, um sie zu isolieren15. Außerdem erfordern die Kennzeichnungsmethoden Geräte wie FACS, und dem nachgelagerten Prozess sind aufgrund der Markierungskontamination Grenzen gesetzt.
In letzter Zeit hat der Einsatz von Flüssigbiopsien zugenommen, und es werden verschiedene Studien zur Früherkennung von Krebs durchgeführt. Obwohl diese Methode einfach ist, gibt es immer noch Schwierigkeiten bei der nachgelagerten Analyse, und verschiedene Studien versuchen, diese Schwierigkeiten zu überwinden16,17. Darüber hinaus benötigen viele Standorte, einschließlich Krankenhäuser, automatisierte, reproduzierbare und hochreine Methoden, die bequem zu bedienen sind. Hier haben wir ein Lab-on-a-Disc für die automatisierte Trennung von Substanzen aus Blutproben nach einer Flüssigbiopsie entwickelt. Diese Geräte basieren auf dem Prinzip der Zentrifugation, Mikrofluidik und porengroßen Zellerfassung. Es gibt drei Arten von Bandscheiben: LBx-1 kann Plasma und Buffy-Coat aufnehmen, während LBx-2 Plasma und PBMC aus Vollblut mit einem Volumen von weniger als 10 ml aufnehmen kann. FAST-auto kann CTCs auch mit einer Membran erfassen, die von der Scheibe abnehmbar ist. Bis zu vier Stück pro Disc können in einem Durchlauf verwendet werden. Der Vorteil dieses Geräts und dieser Methode besteht vor allem darin, dass sie mit einer geringen Menge Blut eine Vielzahl von krebserregenden Substanzen aus derselben Probe gewinnen kann. Das bedeutet, dass dem Patienten nur einmal Blut abgenommen werden muss. Darüber hinaus hat es den Vorteil, dass Fehler aufgrund von Unterschieden in der Blutentnahmezeit ausgeschlossen werden. Diese Plattform ist einfach zu bedienen und liefert genaue Ergebnisse für Flüssigbiopsien und nachgelagerte Anwendungen. In diesem Protokoll wird die Verwendung des Geräts und der Patrone eingeführt.
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Protocol
Alle Vollblutproben wurden von Lungenkrebspatienten gewonnen. Die Forschung und Analyse bei Clinomics wird vom Cancer Genomics Research Institute durchgeführt, und die IRB-Forschungsgenehmigung durch die Regierung wird vom Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB Nr. 2021-0802) geleitet, wobei die IRB-Nummer für die Forschung bei Clinomics registriert ist.
1. Probenvorbereitung
- Sammeln Sie 9 ml Vollblut in einem EDTA- oder cfDNA-stabilen Blutentnahmeröhrchen.
- Mischen Sie gut, indem Sie das Röhrchen ca. 10 Mal auf und ab drehen.
- Lagern Sie die Proben bei Raumtemperatur (RT; für Kurzzeitlagerung) oder 4 °C (für Langzeitlagerung). Nicht einfrieren und auftauen.
2. Gerätevorbereitung
- Drücken Sie den Netzschalter, um das Gerät einzuschalten.
HINWEIS: Auf dem Touchpad wird ein Ladebildschirm angezeigt, und das Gerät wird initialisiert. Halten Sie während der Initialisierung die Hände vom Gerät fern. Nach Abschluss der Geräteinitialisierung wird der Bildschirm zur Auswahl der Kartusche angezeigt. - Wählen Sie den zu verwendenden Beispielmodus aus. Ändern Sie die Anzahl der Stichproben, indem Sie auf den Pfeil drücken.
3. Gerätebetrieb und Probenentnahme
- Einlegen der LBx-1-Kassette
- Wählen Sie den Kassettentyp auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Geräts aus. Ändern Sie die Anzahl der Proben, indem Sie die Pfeiltaste drücken.
- Öffnen Sie die Klappe des Instruments und setzen Sie alle zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Vergewissern Sie sich, dass Sie die Patrone und den Patronenhalter richtig einsetzen. Wenn die Kartusche nicht richtig eingesetzt wird, kann dies zu erheblichen Schäden am Instrument führen.
- Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters.
- Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen.
- Schließen Sie die Klappe und drücken Sie die RUN-Taste auf dem Touchscreen. Das Gerät schließt die Ventile an den Kartuschen, was ca. 30 s dauert.
- Befolgen Sie die Meldung, um die Klappe zu öffnen, das Stützrad zu entfernen und die mit dem Ventil geschlossene Patrone aus dem Patronenhalter zu entfernen.
- Legen Sie die Patrone auf den Tisch und bereiten Sie die Injektion der Vollblutprobe vor. Pipettieren Sie maximal 10 ml Vollblutprobe mit einer serologischen Pipette.
VORSICHT: Gefahren beim Umgang mit Blut. Während des gesamten Verfahrens des Umgangs mit Blutproben und Reagenzien ist es wichtig, einen Laborkittel und Laborhandschuhe zu tragen. Das bereitgestellte Sicherheitsdatenblatt sollte von den Labormitarbeitern gründlich untersucht werden. - Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe.
HINWEIS Bei der Verwendung von mindestens 9 ml Vollblutprobe ist keine Zugabe von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) erforderlich. Wenn Sie weniger als 9 ml Vollblutprobe verwenden, fügen Sie PBS hinzu, um das Gesamtvolumen auf 9 ml zu erhöhen. Wenn Sie beispielsweise 7,2 ml Vollblut verwenden, geben Sie bitte 1,8 mL PBS in den Probeneinlass. Für die Injektion von Vollblut und PBS kann eine serologische Pipette oder eine Pipettenspitze verwendet werden. Bei Verwendung von weniger als 8 ml Vollblutprobe kann der Buffycoat auch durch Zugabe von 1 ml PBS nicht wiederhergestellt werden. Für die gDNA-Vorbereitung verwenden Sie 200 μL Vollblut, das vor diesem Schritt abgetrennt wurde. - Setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK .
HINWEIS: Plasma und Buffy Coat werden automatisch vom Vollblut getrennt, was ca. 30 Minuten dauert.
ACHTUNG Gefahr während des Betriebs. Das Öffnen der Tür oder das Berühren des Instruments bei Hochgeschwindigkeitsdrehvorgängen kann zu schweren Verletzungen führen. Zudem besteht Verletzungsgefahr durch asymmetrische Belastung des Rotors. Wenn ungewöhnliche Vibrationen und Geräusche auftreten, wenn das Gerät im assistierten Zellanreicherungs- oder Expertenmodus startet, kann die Platzierung der Kartuschen asymmetrisch sein. Drücken Sie sofort die Ein-/Aus-Taste, um die Patrone zu stoppen und ordnungsgemäß einzusetzen. - Suchen Sie nach der Meldung auf dem Bildschirm, begleitet von einem Alarmton, der erscheint, wenn die Trennung von Plasma und Buffy Coat abgeschlossen ist.
- Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die STOP-Taste drücken. Öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Patrone heraus und legen Sie sie auf den Tisch.
- Gewinnen Sie 3 ml Plasma aus dem Plasmaauslass mit einer 1 ml Pipettenspitze. Gewinnen Sie den Buffy Coat von 3 ml aus dem Buffy Coat-Auslass mit einer 1 ml Pipettenspitze.
- Einlegen der LBx-2-Kassette
- Wählen Sie den Namen der Patrone auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Geräts aus. Ändern Sie die Anzahl der Proben, indem Sie die Pfeiltaste drücken.
- Öffnen Sie die Klappe, und setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein.
- Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters.
- Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Patrone korrekt in den Patronenhalter eingesetzt wird. Wenn die Kartusche nicht richtig eingesetzt wird, kann dies zu erheblichen Schäden am Instrument führen.
- Schließen Sie die Klappe und drücken Sie die RUN-Taste auf dem Touchscreen. Das Gerät schließt die Ventile an der Kartusche, was ca. 30 s dauert.
- Befolgen Sie die Anweisungen, um die Klappe zu öffnen, das Stützrad zu entfernen, die mit dem Ventil geschlossene Kartusche aus dem Patronenhalter zu entfernen und auf den Tisch zu legen.
- Legen Sie die Patrone auf den Tisch und bereiten Sie die Injektion der Dichtegradientenlösung und der Vollblutprobe vor. Das Volumen der zu injizierenden Dichtegradientenlösung und des zu injizierenden PBS ist in Abhängigkeit vom Volumen der Vollblutprobe zu überprüfen (Zusatztabelle 1).
- Die Dichtegradientenlösung wird mit einer serologischen Pipette pipettiert. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Einlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Dichtegradientenlösung.
- Nach der Injektion der Dichtegradientenlösung wird die Vollblutprobe mit einer serologischen Pipette pipettiert. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe.
HINWEIS: Wenn Sie weniger als 9 ml der Vollblutprobe verwenden, fügen Sie PBS gemäß dieser Tabelle hinzu (Zusatztabelle 1). - Setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der richtigen Reihenfolge ein, wie sie auf dem Patronenhalter angegeben sind. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK .
- Plasma und PBMC werden automatisch vom Vollblut getrennt, was ca. 30 Minuten dauert. Suchen Sie nach der Meldung, die von einem Alarmton begleitet wird, wenn die Trennung von Plasma und PBMC abgeschlossen ist.
- Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die STOP-Taste drücken. Öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Patrone heraus und legen Sie sie auf den Tisch.
- Gewinnen Sie 3 ml Plasma aus dem Plasmaauslass mit einer 1 ml Pipettenspitze. Gewinnen Sie 3 ml PBMC aus dem PBMC-Auslass mit einer 1-ml-Pipettenspitze.
- Einlegen der FAST-Auto-Patrone
- Wählen Sie die Kassette auf dem Touchscreen-Bedienfeld des Instruments aus. Ändern Sie die Anzahl der Proben, indem Sie die Pfeiltaste drücken.
- Öffnen Sie die Klappe, und setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Für insgesamt vier Patronen legen Sie die Dummy-Patrone in den leeren Raum des Patronenhalters.
- Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen.
- Schließen Sie die Klappe und drücken Sie die RUN-Taste auf dem Touchscreen. Das Gerät schließt die Ventile an der Kartusche, was ca. 30 s dauert.
- Befolgen Sie die Meldung, um die Klappe zu öffnen, das Stützrad zu entfernen und die mit dem Ventil geschlossene Patrone aus dem Patronenhalter zu entfernen.
- Legen Sie die Patrone auf den Tisch und bereiten Sie die Injektion der PBS-Lösung und der Vollblutprobe vor. Pipettieren Sie 6 ml PBS-Lösung mit einer serologischen Pipette. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den PBS-Einlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam 6 ml der PBS-Lösung.
- Nach der Injektion der PBS-Lösung werden 3 ml Vollblut oder PBMC-Probe aus LBx-2 mit einer serologischen Pipette pipettiert, die zuvor mit 1% BSA gespült wurde, um ein Anhaften des Rückstands zu verhindern. Führen Sie die Pipettenspitze tief in den Probeneinlass der Patrone ein und injizieren Sie langsam die Vollblutprobe.
- Setzen Sie die zu verwendenden Patronen in der Reihenfolge der Anzahl auf dem Patronenhalter ein. Verwenden Sie das Stützrad, um die Patrone zu montieren, und ziehen Sie die Kontermutter fest, um sie zu befestigen. Schließen Sie die Klappe, und drücken Sie die Taste OK .
- CTCs werden automatisch aus Vollblut angereichert, was ca. 15 Minuten dauert. Suchen Sie nach einer Meldung, die von einem Alarmton begleitet wird, wenn die Anreicherung der CTCs abgeschlossen ist. Stoppen Sie den Alarm, indem Sie die Tür öffnen oder die STOP-Taste drücken.
- Öffnen Sie die Tür, nehmen Sie die Patrone heraus und legen Sie sie auf den Tisch. Führen Sie den hinteren Plattenentferner (BPR) in die vier Löcher an der Vorderseite der Patrone ein. Drücken Sie den dunkelblauen Flügel mit den Daumen beider Hände und drücken Sie dann auf den hellblauen Körper, bis er klickt.
- Entfernen Sie vorsichtig das Kartuschengehäuse, indem Sie es anheben. Nehmen Sie die Filtermembran mit einer Pinzette ganz vorsichtig am Rand auf. Bitte achten Sie darauf, den äußeren Rand (den 1 mm breiten Randteil) der Filtermembran zu verwenden, um die Filtermembran einzuklemmen und zu halten.
- Legen Sie die Filtermembran (auf der sich angereicherte CTCs befinden) vorsichtig in ein 1,5-ml-Röhrchen zur Nukleinsäurepräparation. Falls erforderlich, das gefilterte Blut mit einer 1-ml-Pipettenspitze in den Blutauslass zurückgewinnen.
4. Wartung des Systems
- Vorbereitung für die Reinigung und Desinfektion des Instruments
- Reinigen Sie alle zugänglichen Oberflächen des Instruments und des Zubehörs einmal pro Woche mit Ethanol und getrocknetem Gewebe und auch sofort, wenn es kontaminiert ist.
- Reinigen Sie die Trommel und die Rotorwelle regelmäßig mit Alkohol (Ethanol und Isopropanol) oder Desinfektionsmitteln auf Alkoholbasis.
- Reinigung und Desinfektion des Instruments
HINWEIS: Allgemeine Hinweise zur Fehlerbehebung und andere Hinweise zum System finden Sie in der Zusatztabelle 2.- Schalten Sie das Gerät mit dem Hauptnetzschalter aus. Trennen Sie den Netzstecker von der Stromversorgung.
- Öffnen Sie die Tür und reinigen und desinfizieren Sie alle zugänglichen Oberflächen des Geräts, einschließlich des Netzkabels, mit einem feuchten Tuch und den empfohlenen Reinigungsmitteln.
- Überprüfen Sie die Rotorwelle auf Beschädigungen. Untersuchen Sie das Gerät auf Korrosion und Beschädigungen.
- Schließen Sie das Gerät nur dann an die Stromversorgung an, wenn es innen und außen vollständig trocken ist.
- Ziehen Sie den Netzstecker ab und entfernen Sie den Sicherungshalter. Der Sicherungshalter befindet sich über der Steckdose. Ersetzen Sie die gebrauchte Sicherung durch eine Ersatzsicherung aus dem Behälter.
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Representative Results
Ziel dieser Technik ist es, krebsassoziierte Substanzen einfach und automatisch aus dem Vollblut zu isolieren. Insbesondere kann jeder diese Technik in allen geeigneten Forschungs- und Analysebereichen einsetzen. Die gleichzeitige und reproduzierbare Trennung mehrerer Substanzen in einer einzigen Blutprobe ist bei Flüssigbiopsien von Bedeutung. Die LBx-1- und LBx-2-Scheiben werden zur Isolierung von Plasma und Buffy Coat oder PBMC aus Vollblut verwendet. Abbildung 1 zeigt die Materialien, die durch die Anwendung dieser Vorrichtung getrennt wurden. Zuerst wurde das Plasma aus 10 ml Blut unter Verwendung von LBx-1 oder die PBMCs unter Verwendung von LBx-2 gewonnen. Zweitens wurden 3 ml des abgetrennten Buffy-Mantels erneut mit PBS in FAST-auto injiziert und CTCs wurden durch die Membran filtriert. Drittens wurde die Membran in ein mit Speicherpuffer gefülltes Röhrchen überführt oder sofort zur Färbung verwendet. Für andere Anwendungen oder die Langzeitlagerung können CTCs einfach durch Vortex aus der Membran entfernt werden.
cfDNA wurde aus dem Plasma unter Verwendung einer magnetischen, auf Perlen basierenden DNA-Isolierung extrahiert, die in der Lage ist, DNA durch Perlenkonzentration Größe für Größe zu erfassen. Die Konzentration und Reinheit von cfDNA wurden mit dem Bioanalyzer gemessen. Es ist bekannt, dass die Konzentration von cfDNA, einschließlich ctDNA, je nach Art und Stadium des Krebses variiert18. Darüber hinaus hat die meiste cfDNA eine Länge von 166 bp, und einige sind etwa doppelt oder dreimal so lang. Obwohl es einen Unterschied in der Menge gibt, die aus jeder einzelnen Probe gewonnen wird, wie 8,47 ng / ml und 5,2 ng / ml, waren die Ergebnisse der cfDNA-Extraktion in allen Fällen sowohl für die Konzentration als auch für die Größenverteilung gut (Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die LBx-1-Methode cfDNA-haltiges Plasma genau separiert.
Bei FAST-auto wurde die Membran entfernt und mit fluoreszierenden Antikörpern zum Nachweis von CTCs und weißen Blutkörperchen (WBCs) gefärbt. Die gefärbte Membran, die auf Glasobjektträgern platziert wurde, wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Färbungs- und mikroskopische Untersuchungen wurden im Anschluss an eine frühere Studiedurchgeführt 19. Nur CTCs können spezifisch mit den Antikörpern EpCAM/Cytokeratin (CTC-positiver Marker) und CD45 (WBC-positiver Marker) unterschieden werden. Jede Membran erfasste insgesamt 310 bzw. 998 Zellen. Darunter wurden insgesamt 3 bzw. 43 CTCs in den Stichproben 1 und 2 gezählt (Abbildung 3). Die in dieser Studie verwendete Methode macht es einfach, das Vorhandensein und die Anzahl von CTCs zu bestimmen. Darüber hinaus können Änderungen der cfDNA-Konzentration und der CTC-Nummer verwendet werden, um das Vorhandensein und Wiederauftreten von Krebs im Feld leicht zu überwachen. Insbesondere da bei diesen Methoden keine anderen Reagenzien verwendet werden, die die Ergebnisse beeinflussen können, sind nachgeschaltete Experimente mit dem erhaltenen Material möglich.
Abbildung 1: Arbeitsablauf des Scheibenmischverfahrens zur gleichzeitigen Trennung von Substanzen aus Vollblut . (A) Das cfDNA-haltige Plasma wird erhalten. (B) CTCs werden aus dem Buffy-Mantel entfernt. (C,D) Nach dem Wirbel lösen sich CTCs von der Membran, und eine kleine Menge CTC verbleibt noch auf der Membran. Sowohl die gewonnenen Zellen als auch die Membran können durch Einfrieren der Proben im Speicherpuffer langfristig gelagert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Reinheit und Menge der extrahierten cfDNA. Die extrahierten cfDNAs wurden mit einem Bioanalysator ausgewertet, und cfDNA-Screen-Bänder wurden zusammen mit einer elektronischen Leiter verwendet. Die grüne Linie wurde für die Ausrichtung zwischen der Leiter (links) und der Probe (rechts) verwendet. Die Dreiecksmarkierungen zeigen die DNA-Bande an. Der größte Teil der cfDNA ist 166 bp, und einige existieren in ganzzahligen Vielfachen der Länge. Normalerweise misst die Konzentration von cfDNA bis zu einer Größe von 50 bp bis 700 bp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Zählung von CTCs mittels Membranfärbung. Nach der immunzytochemischen Färbung der Membran zeigen die Zellen DAPI-Signale (Nuclear Positive) in Blau, während EpCAM/CK (CTCs positiv) und CD45 (WBC-positiv) grün bzw. rot hervorgehoben sind. Die Fluoreszenzsignale wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop gemessen. Der Maßstabsbalken zeigt 10 μm an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Tabelle 1: Zusammensetzung des Endvolumens für die Verwendung von Dichtegradientenlösung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungstabelle 2: Allgemeine Probleme und Vorsichtsmaßnahmen bei der Instandhaltung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Menge und Konzentration von cfDNA und CTC hängt vom Individuum, dem Stadium und der Art des Krebses ab. Es hängt auch vom Zustand des Patientenab 2,4,5,10,20. Insbesondere in den frühen oder präkanzerösen Stadien von Krebs sind die Konzentrationen krebsrelevanter Substanzen sehr gering, so dass eine hohe Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie nicht nachgewiesen werden können. Nichtsdestotrotz wirkt sich die Früherkennung sehr positiv auf das Überleben der Patienten und die Etablierung einer Behandlungsstrategie aus. Da cfDNA und CTC eine kurze Halbwertszeit im Blut haben, spiegeln sie Echtzeitinformationen über Krebs wider 21,22,23,24,25. Um gleichzeitig verschiedene krebsbedingte Substanzen zu erhalten, ist daher unter den gleichen Bedingungen eine große Menge Blut erforderlich. Das hier gezeigte System bietet den Anwendern eine einfache Methode. Der Benutzer kann die Scheibe auswählen und verwenden, die dem benötigten Material aus Vollblut entspricht. Mit einer der mitgelieferten Kartuschen kann cfDNA-haltiges Plasma gewonnen werden, und CTCs können aus derselben Blutprobe, demselben verschwendeten Buffy-Coat oder PBMC durch erneute Injektion in eine FAST-Auto-Scheibe gewonnen werden (Abbildung 1).
Die größenbasierte CTC-Erfassung ist einfach, hat aber Einschränkungen in Bezug auf die Reinheit. Es gibt viele verschiedene Formen und Größen von Zellen im Blut26. Leukozyten variieren in der Größe von 8 bis 16 μm27. In einer anderen Studie betrug die mittlere Größe des gemessenen Leukozyten 9 μm. Auf der anderen Seite beträgt die Mindestgröße von isolierten CTCs 16 μm und die durchschnittliche Größe beträgt 30 μm28. Darüber hinaus sind CTCs im Vergleich zu anderen Blutzellen in sehr geringer Menge im Blut des Patienten vorhanden. Die Minimierung der Leukozytenkontamination ist wichtig für nachgelagerte Analysen. Obwohl die antikörperbasierte Detektion CTCs erfassen kann, erfordert eine hochauflösende Analyse wie NGS zusätzliche Einzelzell-Picking-Techniken oder ein hohes Maß an bioinformatischer Analyse.
In jüngster Zeit wurden Methoden zur intuitiven Beobachtung des Vorhandenseins von CTCs vor der hochauflösenden Analyse unter Verwendung verschiedener Erfassungstechniken implementiert29. Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, kann die von der FAST-Auto-Kartusche gewonnene Membran direkt für die CTC-Detektion gefärbt werden. Eingefangene CTCs können auch leicht von der Membran resuspendiert werden, indem sie zur Lagerung oder für weitere Anwendungen wie Zellkulturen vortexiert werden (Abbildung 1).
Diese Methode nutzt die Prinzipien der Zentrifugation und Mikrofluidik. Daher ist die Balance zwischen dem Gerät und der Disc wichtig, und es ist auch wichtig, sie mit dem Disc-Halter zu sichern. Es ist wichtig, ein anfänglich unzureichendes Gesamtvolumen mit PBS zu füllen. Wenn die anfängliche Menge nicht ausreicht, kann es zu Problemen kommen, die zu Schwierigkeiten beim Wechseln zum nächsten Raum führen. Nehmen Sie den Scheibenhalter auf einer Tischplatte heraus, um eine Kontamination des Geräts zu verhindern und Flüssigkeiten in die Disc hinein und aus der Disc zu bewegen. Im Falle der FAST-Auto-Scheibe sind die Proben schnell zu verarbeiten, um die Schädigung des CTC in der Membran zu reduzieren. Achten Sie insbesondere darauf, eine Kontamination bei der Handhabung der Membran zu vermeiden und das festgelegte Protokoll für die Langzeitlagerung zu befolgen.
Dennoch ist diese Methode einfach zu bedienen und kann ein bis vier Proben gleichzeitig verarbeiten. Auch verschiedene Substrate von Flüssigkeit können durch einfaches Austauschen der Scheibe erhalten werden. Darüber hinaus sind keine zusätzlichen Reagenzien erforderlich, außer der Verwendung einer Dichtegradientenlösung, um PBMCs zu erhalten. Daher ist das erhaltene Material gut für die nachgelagerte Verwendung.
Diese Methode hat noch einige Einschränkungen. Der Benutzer kann die Disc nicht beliebig ändern, und verschiedene Arten von Discs können nicht gleichzeitig verwendet werden. Außerdem gibt es Grenzen für das maximale Volumen, so dass mehrere Scheiben für große Blutmengen verwendet werden müssen. Weitere Methoden sind noch erforderlich, um cfDNA zu erhalten. Mit der Membran ist es schwierig, nur CTCs mit der porengroßen Abscheidemethode zu erhalten. Daher ist eine Zellselektion oder -sortierung für CTC-spezifische Anwendungsexperimente erforderlich.
Es gibt verschiedene Flüssigkeiten im Körper, und die Produktion bestimmter Körperflüssigkeiten ist mit der Krankheit30 verbunden. Derzeit wurde die Blutkörperflüssigkeit nur für die Analyse verwendet. In Zukunft kann ein optimales Protokoll erstellt werden, indem die Leistung in verschiedenen Körperflüssigkeiten wie Urin, Aszites, Pleuraflüssigkeit und Rückenmarksflüssigkeit bestätigt wird. Um den Anwendern eine komfortablere Methode zu bieten, werden derzeit Geräte entwickelt, die automatisch cfDNA aus der Scheibe extrahieren. Darüber hinaus befinden sich Geräte in der Lage, eine quantitative PCR direkt in der Bandscheibe nach der Extraktion durchzuführen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Arbeit.
Acknowledgments
Dieses Manuskript wurde teilweise vom Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) und dem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
