Summary
מאמר זה מתאר את היישום של ציוד אוטומטי כדי להפריד ולאסוף בקלות וביעילות, כגון DNA ללא תאים ותאי גידול במחזור, מדם שלם.
Abstract
לאחרונה, ביופסיות נוזליות שימשו לאבחון מחלות שונות, כולל סרטן. נוזלי גוף מכילים חומרים רבים, כולל תאים, חלבונים וחומצות גרעין שמקורם ברקמות רגילות, אך חלק מחומרים אלה מקורם גם באזור החולה. החקירה והניתוח של חומרים אלה בנוזלי הגוף ממלאים תפקיד מרכזי באבחון מחלות שונות. לכן, חשוב להפריד במדויק את החומרים הנדרשים, וכמה טכניקות מפותחות לשימוש למטרה זו.
פיתחנו סוג מעבדה על דיסק של מכשיר ופלטפורמה בשם CD-PRIME. מכשיר זה הוא אוטומטי ויש לו תוצאות טובות עבור זיהום מדגם ויציבות הדגימה. יתר על כן, יש לו יתרונות של תשואת רכישה טובה, זמן פעולה קצר, ושכפול גבוה. בנוסף, בהתאם לסוג הדיסק שיש להרכיב, ניתן להפריד פלזמה המכילה DNA ללא תאים, תאי גידול במחזור, תאים חד-גרעיניים של דם היקפי או ציפויי באפי. לפיכך, רכישת מגוון חומרים הנמצאים בנוזלי הגוף יכולה להיעשות עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כולל המחקר של omics.
Introduction
גילוי מוקדם ומדויק של מחלות שונות, כולל סרטן, הוא הגורם החשוב ביותר בקביעת אסטרטגיית טיפול 1,2,3,4. בפרט, גילוי מוקדם של סרטן קשור קשר הדוק עם סיכויי הישרדות מוגברים עבור המטופל 5,6,7,8. לאחרונה, ביופסיות נוזליות היו באור הזרקורים לגילוי מוקדם של סרטן. גידולים מוצקים עוברים אנגיוגנזה ומשחררים חומרים שונים לדם. בפרט, דנ"א במחזור (ctDNAs), רנ"א במחזור (ctRNAs), חלבונים, שלפוחיות כגון אקסוזומים ותאי גידול במחזור הדם (CTCs) נמצאו בדמם של חולי סרטן 2,9. למרות שיש הבדלים בכמות החומרים הללו, הם נצפים בעקביות לא רק בשלבים המוקדמים אלא גם בשלבים מאוחרים יותר 6,10. עם זאת, הבדלים בודדים אלה הם גבוהים מאוד; לדוגמה, כמות הדנ"א נטול התאים (cfDNA) המכילה ctDNA היא פחות מ-1,000 ננוגרם, ומספר ה-CTCs קטן מ-100 ב-10 מ"ל של דם שלם מחולי סרטן11,12,13. מחקרים רבים אפיינו סרטן בשימוש בחומרים אלה בכמויות קטנות יותר (כלומר, cfDNA, ctDNA ו- CTCs). כדי להשיג תוצאות מדויקות, חשוב להפריד במדויק כמויות קטנות של חומרים עם טוהר גבוה13,14. שיטות צנטריפוגה קונבנציונליות משמשות בדרך כלל, אך הן קשות לטיפול ויש להן טוהר נמוך בהתאם למיומנות המשתמש. מאז גילוי ה-CTCs, פותחו מספר טכניקות הפרדה, כגון צנטריפוגה או הפרדת דרגות צפיפות, אימונובייד ושיטות מיקרופלואידיות. מספר טכניקות הכלה פותחו מאז גילוי CTCs. עם זאת, טכניקות אלה מוגבלות לעתים קרובות כאשר יש צורך לבודד תאים מן השבבים השונים ואת הממברנות המשמשים לבודד אותם15. כמו כן, שיטות התיוג דורשות ציוד כגון FACS, ויש מגבלות לתהליך במורד הזרם עקב זיהום תיוג.
לאחרונה, השימוש בביופסיות נוזליות גדל, ומחקרים שונים נערכים לגילוי מוקדם של סרטן. למרות ששיטה זו פשוטה, עדיין ישנם קשיים בניתוח במורד הזרם, ומחקרים שונים מנסים להתגבר על קשיים אלה16,17. בנוסף, אתרים רבים, כולל בתי חולים, דורשים שיטות אוטומטיות, ניתנות לשחזור וטוהר גבוה הנוחות לשימוש. כאן פיתחנו מעבדה על דיסק להפרדה אוטומטית של חומרים מדגימות דם לאחר ביופסיה נוזלית. התקנים אלה מבוססים על העיקרון של צנטריפוגה, מיקרופלואידיקה ולכידת תאים בגודל נקבוביות. ישנם שלושה סוגים של דיסקים: LBx-1 יכול לרכוש פלזמה וציפוי באפי, בעוד LBx-2 יכול לרכוש פלזמה ו- PBMC מדם שלם עם נפח של פחות מ -10 מ"ל; FAST-auto יכול גם לרכוש CTCs באמצעות קרום הניתן להסרה מהדיסק. ניתן להשתמש בעד ארבעה מכל דיסק בהפעלה אחת. מעל לכל, היתרון של מכשיר ושיטה זו הוא כי הוא יכול לקבל מגוון רחב של חומרים שמקורם בסרטן מאותה דגימה באמצעות כמות קטנה של דם. משמעות הדבר היא כי הדם של המטופל רק צריך להיות נמשך פעם אחת. בנוסף, יש לו את היתרון של אי הכללת טעויות עקב הבדלים בתקופת דגימת הדם. פלטפורמה זו קלה לשימוש ומספקת תוצאות מדויקות עבור ביופסיות נוזליות ויישומים במורד הזרם. בפרוטוקול זה, השימוש במכשיר ובמחסנית מוצג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל דגימות הדם השלמות התקבלו מחולי סרטן ריאות. המחקר והניתוח בקלינומיקס מתבצעים על ידי המכון לחקר גנומיקה של סרטן, ואישור מחקר IRB על ידי הממשלה מובל על ידי ועדת הביקורת המוסדית של המרכז הרפואי אסאן (IRB NO. 2021-0802) עם מספר IRB רשום למחקר בקלינומיקס.
1. הכנת מדגם
- אסוף 9 מ"ל של דם שלם לתוך צינור איסוף דם יציב EDTA או cfDNA.
- מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור למעלה ולמטה כ-10 פעמים.
- אחסנו את הדגימות בטמפרטורת החדר (RT; לאחסון לטווח קצר) או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (לאחסון לטווח ארוך). אין להקפיא ולהפשיר.
2. הכנת המכשיר
- לחץ על מתג ההפעלה כדי להפעיל את המכשיר.
הערה: מסך טעינה מופיע בלוח המגע, והכלי מאותחל. יש להרחיק את הידיים מהמכשיר במהלך האתחול. מסך בחירת המחסנית מופיע לאחר השלמת אתחול המכשיר. - בחר את המצב לדוגמה לשימוש. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על החץ.
3. הפעלת המכשיר ואיסוף הדגימות
- העמסת מחסנית LBx-1
- בחר את סוג המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על לחצן החץ.
- פתח את דלת המכשיר והכנס את כל המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית. הקפד להכניס כראוי את המחסנית ואת מחזיק המחסנית. אם המחסנית אינה מוכנסת כראוי, הדבר עלול לגרום נזק ניכר למכשיר.
- לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית.
- השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה.
- סגור את הדלת ולחץ על לחצן RUN במסך לוח המגע. המכשיר סוגר את השסתומים על מחסניות, אשר לוקח כ 30 שניות.
- עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת, להסיר את גלגל התמיכה ולהסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית.
- מניחים את המחסנית על השולחן ומתכוננים להזריק את כל דגימת הדם. פיפטה מקסימום של 10 מ"ל של דגימת דם שלמה באמצעות פיפטה סרולוגית.
אזהרה: סכנות הטיפול בדם. במהלך כל הליך הטיפול בדגימות דם וריאגנטים, חשוב ללבוש מעיל מעבדה וכפפות מעבדה. MSDS בתנאי צריך להיות נחקר ביסודיות על ידי עובדי המעבדה. - הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת הדגימה של המחסנית והזריק באיטיות את כל דגימת הדם.
הערה בעת שימוש ביותר או שווה ל-9 מ"ל של דגימת דם שלמה, אין צורך בתוספת מלח עם מאגר פוספט (PBS). בעת שימוש בפחות מ-9 מ"ל של דגימת דם שלמה, הוסף PBS כדי להפוך את הנפח הכולל ל-9 מ"ל. לדוגמה, בעת שימוש ב- 7.2 מ"ל של דם שלם, אנא הוסף 1.8 מ"ל של PBS לכניסת הדגימה. פיפטה סרולוגית או קצה פיפטה יכולים לשמש להזרקת דם שלם ו- PBS. בעת שימוש בפחות מ-8 מ"ל של דגימת דם שלמה, ייתכן שלא ניתן לשחזר את הפרווה של באפי אפילו על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS. להכנת gDNA, השתמש ב-200 μL של דם שלם, שהופרד לפני שלב זה. - הכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר במחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על בסדר לחצן.
הערה: פלזמה ופרווה באפי מופרדות מדם שלם באופן אוטומטי, מה שאורך כ-30 דקות.
שים לב סכנה במהלך הפעולה. פתיחת הדלת או נגיעה במכשיר במהלך פעולות סיבוב במהירות גבוהה עלולה לגרום לפציעות חמורות. קיים גם סיכון לפציעה עקב העמסה אסימטרית של הרוטור. אם רעידות ורעשים חריגים מתרחשים כאשר המכשיר מתחיל בהעשרת תאים בסיוע או במצב מומחה, מיקום המחסנית עשוי להיות לא סימטרי. לחץ מיד על מקש ההפעלה כדי לעצור ולהתקין כראוי את המחסנית. - חפשו את ההודעה על המסך המלווה בצליל אזעקה, המופיע כאשר ההפרדה בין הפלזמה למעיל באפי הושלמה.
- עצור את השעון המעורר על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן STOP . פתח את הדלת, הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן.
- לשחזר 3 מ"ל של פלזמה מן מוצא פלזמה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל. שחזר את ציפוי באפי של 3 מ"ל משקע מעיל באפי באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל.
- טעינת מחסנית LBx-2
- בחר את שם המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על לחצן החץ.
- פתח את הדלת והכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית.
- לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית.
- השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. הקפד להכניס כראוי את המחסנית למחזיק המחסנית. אם המחסנית אינה מוכנסת כראוי, הדבר עלול לגרום נזק ניכר למכשיר.
- סגור את הדלת ולחץ על לחצן RUN במסך לוח המגע. המכשיר סוגר את השסתומים על המחסנית, אשר לוקח כ 30 שניות.
- עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת, להסיר את גלגל התמיכה, להסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית ולהניח אותה על השולחן.
- מניחים את המחסנית על השולחן ומתכוננים להזריק את תמיסת שיפוע הצפיפות ואת כל דגימת הדם. בדוק את נפח תמיסת שיפוע הצפיפות ואת PBS שיש להזריק בהתאם לנפח דגימת הדם כולה (טבלה משלימה 1).
- פיפטה את תמיסת גרדיאנט הצפיפות באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך פתח הכניסה של המחסנית והזרק באיטיות את תמיסת שיפוע הצפיפות.
- לאחר הזרקת תמיסת שיפוע הצפיפות, פיפטה את כל דגימת הדם באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת הדגימה של המחסנית והזריק באיטיות את כל דגימת הדם.
הערה: בעת שימוש בפחות מ-9 מ"ל מדגימת הדם כולה, הוסף PBS על-ידי הפניה לטבלה זו (טבלה משלימה 1). - הכנס את המחסניות לשימוש לפי המספר על מחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על בסדר לחצן.
- פלזמה ו- PBMC מופרדים מדם שלם באופן אוטומטי, מה שלוקח בערך 30 דקות. חפש את ההודעה המופיעה מלווה בצליל אזעקה, כאשר הפרדת הפלזמה וה- PBMC הושלמה.
- עצור את השעון המעורר על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן STOP . פתח את הדלת, הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן.
- לשחזר 3 מ"ל של פלזמה מן מוצא פלזמה באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל. שחזר 3 מ"ל של PBMC משקע PBMC באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל.
- טעינת מחסנית FAST-auto
- בחר את המחסנית בלוח מסך המגע של המכשיר. שנה את מספר הדוגמאות על-ידי לחיצה על לחצן החץ.
- פתח את הדלת והכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר על מחזיק המחסנית. לקבלת ארבע מחסניות בסך הכל, הנח את מחסנית הדמה בשטח הריק של מחזיק המחסנית.
- השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה.
- סגור את הדלת ולחץ על לחצן RUN במסך משטח המגע. המכשיר סוגר את השסתומים על המחסנית, אשר לוקח כ 30 שניות.
- עקוב אחר ההודעה כדי לפתוח את הדלת, להסיר את גלגל התמיכה ולהסיר את המחסנית הסגורה באמצעות שסתום ממחזיק המחסנית.
- מניחים את המחסנית על השולחן ומתכוננים להזריק את תמיסת ה- PBS ודגימת דם שלמה. פיפטה 6 מ"ל של תמיסת PBS באמצעות פיפטה סרולוגית. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת ה- PBS של המחסנית והזרק באיטיות 6 מ"ל של תמיסת PBS.
- לאחר הזרקת תמיסת PBS, פיפטה 3 מ"ל של דם שלם או דגימת PBMC שהתקבלה מ- LBx-2 באמצעות פיפטה סרולוגית, אשר נשטפה בעבר עם 1% BSA כדי למנוע הידבקות של שאריות. הכנס את קצה הפיפטה עמוק לתוך כניסת הדגימה של המחסנית והזריק באיטיות את כל דגימת הדם.
- הכנס את המחסניות לשימוש לפי סדר המספר במחזיק המחסנית. השתמש בגלגל התמיכה כדי להרכיב את המחסנית ולהדק את אום הנעילה כדי לאבטח אותה. סגור את הדלת ולחץ על בסדר לחצן.
- CTCs מועשרים מדם שלם באופן אוטומטי, אשר לוקח בערך 15 דקות. חפש הודעה שמופיעה מלווה בצליל אזעקה עם השלמת העשרת ה- CTCs. עצור את השעון המעורר על-ידי פתיחת הדלת או לחיצה על לחצן STOP .
- פתח את הדלת, הסר את המחסנית והנח אותה על השולחן. הכנס את מסיר הלוח האחורי (BPR) לארבעת החורים בחזית המחסנית. לחץ על הכנף הכחולה כהה עם האגודלים של שתי הידיים, ולאחר מכן לחץ על הגוף הכחול בהיר עד שהוא לוחץ.
- הסר בזהירות את גוף המחסנית על ידי הרמתה. מרימים בעדינות רבה את קרום המסנן עד הקצה באמצעות פינצטה. אנא הקפידו להשתמש בשפה החיצונית (החלק בעל הקצה הרחב של 1 מ"מ) של קרום המסנן כדי לצבוט ולהחזיק את קרום המסנן.
- בזהירות למקם את קרום המסנן (שעליו CTCs מועשרים שוכנים) לתוך צינור 1.5 מ"ל להכנת חומצת גרעין. במידת הצורך, לשחזר את הדם מסונן לשקע הדם באמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל.
4. תחזוקת המערכת
- הכנה לניקוי וחיטוי המכשיר
- נקו את כל המשטחים הנגישים של המכשיר והאביזרים פעם בשבוע באמצעות אתנול ורקמות מיובשות, וגם מיד כאשר מזוהמים.
- נקו את הקערה ואת פיר הרוטור באופן קבוע באמצעות אלכוהול (אתנול ואיזופרופנול) או חומרי חיטוי על בסיס אלכוהול.
- ניקוי וחיטוי המכשיר
הערה: לפתרון בעיות כלליות ולהערות אחרות במחשב, עיין בטבלה משלימה 2.- כבה את המכשיר באמצעות מתג ההפעלה הראשי. נתק את תקע החשמל מספק הכוח.
- פתחו את הדלת ונקו וחטאו את כל המשטחים הנגישים של המכשיר, כולל כבל החשמל, באמצעות מטלית לחה וחומרי הניקוי המומלצים.
- בדוק את פיר הרוטור עבור נזק. בדוק את המכשיר עבור קורוזיה ונזק.
- חבר את המכשיר לספק הכוח רק אם הוא יבש לחלוטין מבפנים ומבחוץ.
- נתקו את תקע החשמל הראשי והסירו את מחזיק הנתיכים. מחזיק הנתיך ממוקם מעל שקע החשמל. החלף את הנתיך המשומש בנתיך רזרבי מהמיכל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המטרה של טכניקה זו היא לבודד בקלות ובאופן אוטומטי חומרים הקשורים לסרטן מדם שלם. בפרט, כל אחד יכול להשתמש בטכניקה זו בכל תחומי המחקר והניתוח המתאימים. ההפרדה בו זמנית וניתנת לשחזור של חומרים מרובים בדגימת דם אחת היא משמעותית בביופסיות נוזליות. דיסקיות LBx-1 ו- LBx-2 משמשות לבידוד פלזמה וציפוי באפי או PBMC מדם שלם. איור 1 מציג את החומרים המופרדים על-ידי היישום של מכשיר זה. ראשית, הפלזמה התקבלה מ 10 מ"ל של דם באמצעות LBx-1 או PBMCs התקבלו באמצעות LBx-2. שנית, 3 מ"ל של ציפוי באפי שהופרד הוזרקו מחדש עם PBS ל-FAST-auto, ו-CTCs סוננו דרך הממברנה. שלישית, הממברנה הועברה לצינור מלא במאגר אחסון או שימשה מיד להכתמה. עבור יישומים אחרים או אחסון לטווח ארוך, CTCs ניתן להסיר בקלות מן הממברנה על ידי מערבולת.
cfDNA הופק מהפלזמה באמצעות בידוד דנ"א מבוסס חרוזים מגנטיים המסוגל ללכוד דנ"א בגודל לפי גודל על ידי ריכוז חרוזים. הריכוז והטוהר של cfDNA נמדדו באמצעות הביואנליזה. זה ידוע היטב כי הריכוז של cfDNA, כולל ctDNA, משתנה בהתאם לסוג ושלב של סרטן18. בנוסף, רוב cfDNA יש אורך של 166 bp, וחלקם הם בערך פעמיים או שלוש פעמים אורך. למרות שיש הבדל בכמות המתקבלת מכל דגימה בנפרד, כגון 8.47 ננוגרם/מ"ל ו-5.2 ננוגרם/מ"ל, התוצאות של מיצוי cfDNA היו טובות הן לריכוז והן להתפלגות הגודל בכל המקרים (איור 2). תוצאות אלה מצביעות על כך ששיטת LBx-1 מפרידה במדויק בין פלזמה המכילה cfDNA.
ב-FAST-auto, הממברנה הוסרה והוכתמה בנוגדנים פלואורסצנטיים לזיהוי CTCs ותאי דם לבנים (WBCs). הממברנה המוכתמת שהונחה על מגלשות זכוכית נצפתה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מחקרים מכתימים ומיקרוסקופיים בוצעו בעקבות מחקר קודם19. ניתן להבחין באופן ספציפי רק ב-CTC באמצעות נוגדני EpCAM/Cytokeratin (סמן חיובי CTC) ו-CD45 (סמן חיובי WBC). כל ממברנה לכדה בסך הכל 310 ו-998 תאים, בהתאמה. ביניהם, בסך הכל נספרו 3 ו-43 CTCs בדגימות 1 ו-2, בהתאמה (איור 3). השיטה בה נעשה שימוש במחקר זה מקלה על קביעת הנוכחות והמספר של CTCs. בנוסף, שינויים בריכוז cfDNA ומספר CTC ניתן להשתמש כדי לפקח בקלות על נוכחות והישנות של סרטן בשטח. בפרט, מכיוון ששיטות אלה אינן משתמשות בריאגנטים אחרים שעשויים להשפיע על התוצאות, ניסויים במורד הזרם אפשריים עם החומר המתקבל.
איור 1: זרימת עבודה של שיטת ערבוב דיסקים להפרדה סימולטנית של חומרים מדם שלם . (A) מתקבלת הפלזמה המכילה cfDNA. (B) CTCs מוסרים מהפרווה של באפי. (ג,ד) לאחר המערבולת, CTCs מנותקים מהממברנה, וכמות קטנה של CTC עדיין נשארת על הממברנה. גם התאים המתקבלים וגם הממברנה יכולים לעבור אחסון לטווח ארוך על ידי הקפאת דגימות במאגר האחסון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: טוהר וכמות ה-cfDNA שחולץ. ה-cfDNAs שחולצו הוערכו באמצעות Bioanalyzer, וקלטות מסך cfDNA שימשו יחד עם סולם אלקטרוני. הקו הירוק שימש ליישור בין הסולם (משמאל) לדגימה (מימין). סימני המשולש מציינים את רצועת הדנ"א. רוב cfDNA הוא 166 bp, וחלקם קיימים בכפולות שלמות של אורך. בדרך כלל, הריכוז של cfDNA מודד עד גודל של 50 bp עד 700 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: ספירת CTCs באמצעות צביעת ממברנות. לאחר צביעת אימונוציטוכימיה של הממברנה, התאים מראים אותות DAPI (חיובי גרעיני) בכחול, בעוד ש-EpCAM/CK (CTCs חיובי) ו-CD45 (חיובי WBC) מודגשים בירוק ובאדום, בהתאמה. אותות פלואורסצנטיים נמדדו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. סרגל קנה המידה מציין 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה משלימה 1: הרכב אמצעי האחסון הסופי לשימוש בתמיסת מעבר צבע צפיפות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
טבלה משלימה 2: בעיות כלליות ואזהרות לתחזוקה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הכמות והריכוז של cfDNA ו- CTC תלויים באדם, בשלב ובסוג הסרטן. זה גם תלוי במצבו של המטופל 2,4,5,10,20. בפרט, בשלבים המוקדמים או הטרום סרטניים של סרטן, הריכוזים של חומרים הקשורים לסרטן הם נמוכים מאוד, ולכן קיימת אפשרות גבוהה כי זה לא יכול להיות מזוהה. עם זאת, לגילוי מוקדם יש השפעה חיובית מאוד על הישרדות המטופלים ועל קביעת אסטרטגיית הטיפול. מכיוון של-cfDNA ול-CTC יש תוחלת חיים קצרה בדם, הם משקפים מידע בזמן אמת על סרטן 21,22,23,24,25. לכן, כדי לרכוש בו זמנית חומרים שונים הקשורים לסרטן, כמות גדולה של דם נדרשת באותם תנאים. המערכת המוצגת כאן מספקת למשתמשים שיטה פשוטה. המשתמש יכול לבחור ולהשתמש בדיסק המתאים לחומר הנדרש מדם שלם. באמצעות אחת המחסניות הנתונות, ניתן להשיג פלזמה המכילה cfDNA, וניתן לאסוף CTCs מאותה דגימת דם, מעיל באפי מבוזבז או PBMC על ידי הזרקה חוזרת לדיסק אוטומטי מהיר (איור 1).
לכידת CTC מבוססת גודל היא פשוטה, אך יש לה מגבלות על טוהר. ישנן צורות וגדלים רבים ושונים של תאים בדם26. WBCs משתנים בגודלם בין 8 ל -16 מיקרומטר27. במחקר אחר, הגודל הממוצע של WBC שנמדד היה 9 מיקרומטר. מצד שני, הגודל המינימלי של CTCs מבודדים הוא 16 מיקרומטר, והגודל הממוצע הוא 30 מיקרומטר28. יתר על כן, CTCs נמצאים בכמות קטנה מאוד בדם החולה בהשוואה לתאי דם אחרים. מזעור זיהום WBC חשוב לניתוחים במורד הזרם. למרות שזיהוי מבוסס נוגדנים יכול ללכוד CTCs, ניתוח ברזולוציה גבוהה כגון NGS דורש טכניקות נוספות של ליקוט תאים בודדים או רמה גבוהה של ניתוח ביואינפורמטיקה.
לאחרונה, שיטות להתבוננות אינטואיטיבית בנוכחות של CTCs לפני ניתוח ברזולוציה גבוהה באמצעות טכניקות לכידה שונות יושמו29. כפי שמוצג בתוצאות, הממברנה שנרכשה מהמחסנית FAST-auto יכולה להיות מוכתמת ישירות לזיהוי CTC. CTCs שנתפסו יכולים גם לעבור החייאה בקלות מהממברנה על-ידי מערבולת לצורך אחסון או יישומים נוספים כגון תרבית תאים (איור 1).
שיטה זו משתמשת בעקרונות הצנטריפוגה והמיקרופלואידיקה. לכן, האיזון של הציוד והדיסק חשוב, וחשוב גם לאבטח אותו עם מחזיק הדיסק. חשוב למלא כל נפח כולל ראשוני לא מספיק עם PBS. אם הסכום הראשוני אינו מספיק, ייתכן שיש בעיה המובילה לקשיים במעבר לחלל הבא. הוציאו את מחזיק הדיסק על השולחן כדי למנוע זיהום של הציוד וכדי להעביר נוזלים פנימה והחוצה מהדיסק. במקרה של דיסק FAST-auto, לעבד את הדגימות במהירות על מנת להפחית את הנזק CTC בממברנה. בפרט, יש להיזהר במניעת זיהום בעת הטיפול בממברנה ולעקוב אחר הפרוטוקול שנקבע לאחסון לטווח ארוך.
עם זאת, שיטה זו קלה לשימוש ויכולה לעבד אחת עד ארבע דגימות בו זמנית. כמו כן, מצעים שונים של נוזל ניתן להשיג פשוט על ידי החלפת הדיסק. יתר על כן, אין צורך בריאגנטים נוספים מלבד שימוש בתמיסת שיפוע צפיפות כדי להשיג PBMCs. לכן, החומר המתקבל טוב לשימוש במורד הזרם.
לשיטה זו יש עדיין כמה מגבלות. למשתמש אין אפשרות לשנות את הדיסק באופן שרירותי, ולא ניתן להשתמש בסוגים שונים של דיסקים בו-זמנית. כמו כן, יש מגבלות על נפח מקסימלי, ולכן דיסקים מרובים חייבים לשמש עבור כמויות גדולות של דם. עדיין יש צורך בשיטות נוספות כדי להשיג cfDNA. באמצעות הממברנה, קשה להשיג רק CTCs באמצעות שיטת לכידת גודל הנקבובית. לכן, בחירה או מיון של תאים נדרשים עבור ניסויי יישום ספציפיים ל- CTC.
ישנם נוזלים שונים בגוף, ואת הייצור של נוזלי גוף מסוימים קשורה למחלה30. נכון לעכשיו, השימוש בנוזל גוף הדם נעשה רק לניתוח. בעתיד, ניתן לקבוע פרוטוקול אופטימלי על ידי אישור הביצועים בנוזלי גוף שונים כגון שתן, מיימת, נוזל הצדר ונוזל עמוד השדרה. כדי לספק שיטה נוחה יותר למשתמשים, מכשירים המחלצים באופן אוטומטי cfDNA מהדיסק מפותחים כעת. יתר על כן, ציוד המסוגל לבצע PCR כמותי ישירות בתוך הדיסק לאחר החילוץ נמצא בפיתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים הקשורים לעבודה זו.
Acknowledgments
כתב יד זה נתמך בחלקו על ידי הקרן לפיתוח מכשור רפואי בקוריאה (KMDF, מענק מס 'RS-2020-KD000019) והמכון לפיתוח תעשיית הבריאות של קוריאה (KHIDI, מענק מס' HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
