Summary
Bu makalede, hücresiz DNA ve dolaşımdaki tümör hücreleri gibi maddeleri tam kandan kolayca ve verimli bir şekilde ayırmak ve toplamak için otomatik ekipmanın uygulanması açıklanmaktadır.
Abstract
Son zamanlarda, sıvı biyopsiler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkları teşhis etmek için kullanılmıştır. Vücut sıvıları, normal dokulardan kaynaklanan hücreler, proteinler ve nükleik asitler de dahil olmak üzere birçok madde içerir, ancak bu maddelerin bazıları da hastalıklı bölgeden kaynaklanır. Vücut sıvılarındaki bu maddelerin araştırılması ve analizi, çeşitli hastalıkların teşhisinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, gerekli maddeleri doğru bir şekilde ayırmak önemlidir ve bu amaçla kullanılmak üzere çeşitli teknikler geliştirilmiştir.
CD-PRIME adlı bir disk üzerinde laboratuvar tipi cihaz ve platform geliştirdik. Bu cihaz otomatiktir ve numune kontaminasyonu ve numune kararlılığı için iyi sonuçlara sahiptir. Ayrıca, iyi bir satın alma verimi, kısa bir çalışma süresi ve yüksek tekrarlanabilirlik avantajlarına sahiptir. Ek olarak, monte edilecek diskin türüne bağlı olarak, hücresiz DNA içeren plazma, dolaşımdaki tümör hücreleri, periferik kan mononükleer hücreleri veya kabarık katlar ayrılabilir. Böylece, vücut sıvılarında bulunan çeşitli malzemelerin elde edilmesi, omiklerin incelenmesi de dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamaları için yapılabilir.
Introduction
Kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların erken ve doğru tespiti, bir tedavi stratejisinin oluşturulmasında en önemli faktördür 1,2,3,4. Özellikle, kanserin erken teşhisi, hastanın 5,6,7,8 sağkalım şansının artmasıyla yakından ilişkilidir. Son zamanlarda, sıvı biyopsiler kanserin erken teşhisi için spot ışığında olmuştur. Solid tümörler anjiyogeneze uğrar ve çeşitli maddeleri kana salgılar. Özellikle kanser hastalarının kanında dolaşımdaki DNA'lar (ctDNA'lar), dolaşımdaki RNA'lar (ctRNA'lar), proteinler, eksozomlar gibi veziküller ve dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler) bulunmuştur 2,9. Bu maddelerin miktarında farklılıklar olmasına rağmen, sadece erken evrelerde değil, sonraki aşamalarda da sürekli olarak gözlenirler 6,10. Bununla birlikte, bu bireysel farklılıklar çok yüksektir; Örneğin, ctDNA içeren hücresiz DNA (cfDNA) miktarı 1.000 ng'den azdır ve CTC'lerin sayısı 10 mL'lik tam kanda 100'den azdır11,12,13. Birçok çalışma, daha az miktarda bulunan bu maddeleri (yani, cfDNA, ctDNA ve CTC'ler) kullanarak kanseri karakterize etmiştir. Doğru sonuçlar elde etmek için, yüksek saflıkta az miktarda maddenin doğru bir şekilde ayrılması önemlidir13,14. Geleneksel santrifüjleme yöntemleri yaygın olarak kullanılır, ancak kullanımı zordur ve kullanıcının becerisine bağlı olarak düşük saflığa sahiptir. CTC'lerin keşfinden bu yana, santrifüjleme veya yoğunluk derecesi ayırma, immünoboncuk ve mikroakışkan yöntemler gibi çeşitli ayırma teknikleri geliştirilmiştir. CTC'lerin keşfinden bu yana çeşitli muhafaza teknikleri geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu teknikler, hücreleri izole etmek için kullanılan çeşitli çiplerden ve zarlardan izole etmek gerektiğinde genellikle sınırlıdır15. Ayrıca, etiketleme yöntemleri FACS gibi ekipmanlar gerektirir ve etiketleme kontaminasyonu nedeniyle çıkış yönündeki prosesin sınırları vardır.
Son zamanlarda, sıvı biyopsilerin kullanımı artmıştır ve kanserin erken teşhisi için çeşitli çalışmalar yapılmaktadır. Bu yöntem basit olmasına rağmen, aşağı akış analizinde hala zorluklar vardır ve çeşitli çalışmalar bu zorlukların üstesinden gelmeye çalışmaktadır16,17. Buna ek olarak, hastaneler de dahil olmak üzere birçok site, kullanımı uygun, otomatik, yeniden üretilebilir ve yüksek saflıkta yöntemler gerektirir. Burada, sıvı biyopsi sonrasında maddelerin kan örneklerinden otomatik olarak ayrılması için bir disk üzerinde laboratuvar geliştirdik. Bu cihazlar santrifüjleme, mikroakışkanlar ve gözenek büyüklüğünde hücre yakalama prensibine dayanmaktadır. Üç tip disk vardır: LBx-1 plazma ve buffy kat elde edebilirken, LBx-2 10 mL'den daha az hacimli tam kandan plazma ve PBMC elde edebilir; FAST-auto, diskten çıkarılabilir bir membran kullanarak CTC'leri de alabilir. Bir çalıştırmada her diskten en fazla dört adet kullanılabilir. Her şeyden önce, bu cihazın ve yöntemin avantajı, az miktarda kan kullanarak aynı numuneden çeşitli kanser kaynaklı maddeler elde edebilmesidir. Bu, hastanın kanının sadece bir kez alınması gerektiği anlamına gelir. Ayrıca kan örnekleme periyodundaki farklılıklardan kaynaklanan hataları dışlama avantajına sahiptir. Bu platformun kullanımı kolaydır ve sıvı biyopsiler ve aşağı akış uygulamaları için doğru sonuçlar sağlar. Bu protokolde, cihazın ve kartuşun kullanımı tanıtılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm tam kan örnekleri akciğer kanseri hastalarından alındı. Clinomics'teki araştırma ve analizler Kanser Genomiği Araştırma Enstitüsü tarafından yürütülmektedir ve hükümet tarafından IRB araştırma onayı, Clinomics'te araştırma için kayıtlı IRB numarası ile Asan Tıp Merkezi Kurumsal İnceleme Komitesi (IRB NO. 2021-0802) tarafından yönetilmektedir.
1. Numune hazırlama
- Bir EDTA veya cfDNA stabil kan toplama tüpüne 9 mL tam kan toplayın.
- Tüpü yaklaşık 10 kez yukarı ve aşağı çevirerek iyice karıştırın.
- Numuneleri oda sıcaklığında (RT; kısa süreli depolama için) veya 4 °C'de (uzun süreli depolama için) saklayın. Donmayın ve çözmeyin.
2. Cihaz hazırlama
- Cihazı açmak için güç düğmesine basın.
NOT: Dokunmatik yüzeyde bir yükleme ekranı görünür ve cihaz başlatılır. Başlatma sırasında ellerinizi cihazdan uzak tutun. Cihaz başlatma işlemi tamamlandıktan sonra kartuş seçim ekranı görüntülenir. - Kullanılacak örnek modu seçin. Oka basarak örnek sayısını değiştirin.
3. Cihaz çalışması ve örnek toplama
- LBx-1 kartuşunun takılması
- Cihazın dokunmatik ekran panelinde kartuş türünü seçin. Ok düğmesine basarak örnek sayısını değiştirin.
- Cihazın kapağını açın ve kullanılacak tüm kartuşları kartuş tutucusundaki numara sırasına göre takın. Kartuşu ve kartuş tutucuyu doğru şekilde taktığınızdan emin olun. Kartuş doğru şekilde takılmazsa, cihazda önemli hasara neden olabilir.
- Toplam dört kartuş için, kukla kartuşu kartuş tutucunun boş alanına yerleştirin.
- Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın.
- Kapıyı kapatın ve dokunmatik yüzey ekranındaki RUN düğmesine basın. Cihaz, kartuşların üzerindeki valfleri kapatır ve bu da yaklaşık 30 s sürer.
- Kapıyı açmak, destek tekerleğini çıkarmak ve valf kapalı kartuşu kartuş tutucusundan çıkarmak için mesajı izleyin.
- Kartuşu masaya yerleştirin ve tam kan örneğini enjekte etmeye hazırlanın. Serolojik pipet kullanarak maksimum 10 mL tam kan örneği pipetin.
DİKKAT: Kan tutmanın tehlikeleri. Kan örneklerini ve reaktifleri kullanma prosedürünün tamamı boyunca, bir laboratuvar önlüğü ve laboratuvar eldiveni giymek önemlidir. Sağlanan MSDS, laboratuvar çalışanları tarafından kapsamlı bir şekilde incelenmelidir. - Pipet ucunu kartuşun numune girişinin derinliklerine yerleştirin ve tüm kan örneğini yavaşça enjekte edin.
NOT 9 mL'den fazla veya buna eşit tam kan örneği kullanıldığında, fosfat tamponlu salin (PBS) ilavesi gerekli değildir. 9 mL'den az tam kan örneği kullanırken, toplam hacmi 9 mL'ye çıkarmak için PBS ekleyin. Örneğin, 7,2 mL tam kan kullanırken, lütfen numune girişine 1,8 mL PBS ekleyin. Tam kan ve PBS enjeksiyonu için serolojik pipet veya pipet ucu kullanılabilir. 8 mL'den daha az tam kan örneği kullanıldığında, buffy ceket 1 mL PBS eklenerek bile geri kazanılamayabilir. GDNA hazırlığı için, bu adımdan önce ayrılmış olan 200 μL tam kan kullanın. - Kullanılacak kartuşları, kartuş tutucu üzerindeki numara sırasına göre takın. Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın. Kapıyı kapatın ve OK düğmesine basın.
NOT: Plazma ve buffy kat tam kandan otomatik olarak ayrılır ve bu yaklaşık 30 dakika sürer.
DİKKAT Çalışma sırasında tehlike. Yüksek hızlı dönen işlemler sırasında kapıyı açmak veya cihaza dokunmak ciddi yaralanmalara neden olabilir. Rotorun asimetrik yüklenmesi nedeniyle yaralanma riski de vardır. Cihaz yardımlı hücre zenginleştirme veya uzman modunda başladığında olağandışı titreşimler ve sesler oluşursa, kartuş yerleşimi asimetrik olabilir. Kartuşu durdurmak ve düzgün bir şekilde takmak için hemen güç tuşuna basın. - Plazma ve buffy ceketin ayrılması tamamlandığında ortaya çıkan bir alarm sesi eşliğinde ekrandaki mesajı arayın.
- Kapıyı açarak veya STOP düğmesine basarak alarmı durdurun . Kapıyı açın, kartuşu çıkarın ve masanın üzerine yerleştirin.
- 1 mL'lik pipet ucu kullanarak plazma çıkışından 3 mL plazma geri kazanın. 1 mL'lik pipet ucu kullanarak 3 mL'lik buffy ceketi buffy kaplama çıkışından geri alın.
- LBx-2 kartuşunun takılması
- Cihazın dokunmatik ekran panelinde kartuş adını seçin. Ok düğmesine basarak örnek sayısını değiştirin.
- Kapağı açın ve kullanılacak kartuşları kartuş tutucu üzerindeki numara sırasına göre takın.
- Toplam dört kartuş için, kukla kartuşu kartuş tutucunun boş alanına yerleştirin.
- Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın. Kartuşu kartuş tutucusuna doğru şekilde taktığınızdan emin olun. Kartuş doğru şekilde takılmazsa, cihazda önemli hasara neden olabilir.
- Kapıyı kapatın ve dokunmatik yüzey ekranındaki RUN düğmesine basın. Cihaz, kartuş üzerindeki valfleri kapatır ve bu da yaklaşık 30 s sürer.
- Kapıyı açmak, destek tekerleğini çıkarmak ve valf kapalı kartuşu kartuş tutucusundan çıkarıp masanın üzerine yerleştirmek için mesajı izleyin.
- Kartuşu masaya yerleştirin ve yoğunluk gradyanı çözeltisini ve tam kan örneğini enjekte etmeye hazırlanın. Tam kan örneğinin hacmine bağlı olarak enjekte edilecek yoğunluk gradyanı çözeltisinin ve PBS'nin hacmini kontrol edin (Ek Tablo 1).
- Serolojik pipet kullanarak yoğunluk gradyanı çözeltisini pipetleyin. Pipet ucunu kartuşun girişinin derinliklerine yerleştirin ve yoğunluk gradyanı çözeltisini yavaşça enjekte edin.
- Yoğunluk gradyanı çözeltisini enjekte ettikten sonra, serolojik bir pipet kullanarak tüm kan örneğini pipetleyin. Pipet ucunu kartuşun numune girişinin derinliklerine yerleştirin ve tüm kan örneğini yavaşça enjekte edin.
NOT: Tam kan örneğinin 9 mL'den daha azını kullanırken, bu tabloya başvurarak PBS ekleyin (Ek Tablo 1). - Kullanılacak kartuşları, kartuş tutucu üzerindeki numaraya göre sırayla takın. Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın. Kapıyı kapatın ve OK düğmesine basın.
- Plazma ve PBMC tam kandan otomatik olarak ayrılır, bu da yaklaşık 30 dakika sürer. Plazma ve PBMC'nin ayrılması tamamlandığında alarm sesiyle birlikte görünen mesajı arayın.
- Kapıyı açarak veya STOP düğmesine basarak alarmı durdurun . Kapıyı açın, kartuşu çıkarın ve masanın üzerine yerleştirin.
- 1 mL'lik pipet ucu kullanarak plazma çıkışından 3 mL plazma geri kazanın. 1 mL'lik pipet ucu kullanarak PBMC çıkışından PBMC'nin 3 mL'sini geri kazanın.
- HIZLI otomatik kartuşun takılması
- Cihazın dokunmatik ekran panelindeki kartuşu seçin. Ok düğmesine basarak örnek sayısını değiştirin.
- Kapağı açın ve kullanılacak kartuşları kartuş tutucu üzerindeki numara sırasına göre takın. Toplam dört kartuş için, kukla kartuşu kartuş tutucunun boş alanına yerleştirin.
- Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın.
- Kapıyı kapatın ve dokunmatik yüzey ekranındaki RUN düğmesine basın. Cihaz, kartuş üzerindeki valfleri kapatır ve bu da yaklaşık 30 s sürer.
- Kapıyı açmak, destek tekerleğini çıkarmak ve valf kapalı kartuşu kartuş tutucusundan çıkarmak için mesajı izleyin.
- Kartuşu masaya yerleştirin ve PBS çözeltisini ve tam kan örneğini enjekte etmeye hazırlanın. Serolojik pipet kullanılarak 6 mL PBS çözeltisi pipet. Pipet ucunu kartuşun PBS girişinin derinliklerine yerleştirin ve 6 mL'lik PBS çözeltisini yavaşça enjekte edin.
- PBS çözeltisi enjekte edildikten sonra, kalıntının yapışmasını önlemek için daha önce% 1 BSA ile durulanan serolojik bir pipet kullanılarak LBx-2'den 3 mL tam kan veya PBMC numunesi elde edilen pipet. Pipet ucunu kartuşun numune girişinin derinliklerine yerleştirin ve tüm kan örneğini yavaşça enjekte edin.
- Kullanılacak kartuşları, kartuş tutucu üzerindeki numara sırasına göre takın. Kartuşu monte etmek için destek tekerleğini kullanın ve sabitlemek için kilit somununu sıkın. Kapıyı kapatın ve OK düğmesine basın.
- CTC'ler otomatik olarak tam kandan zenginleştirilir, bu da yaklaşık 15 dakika sürer. CTC'lerin zenginleştirilmesi tamamlandığında alarm sesiyle birlikte görünen bir mesaj arayın. Kapıyı açarak veya STOP düğmesine basarak alarmı durdurun .
- Kapıyı açın, kartuşu çıkarın ve masanın üzerine yerleştirin. Arka plaka sökücüyü (BPR) kartuşun önündeki dört deliğe takın. Koyu mavi kanadı iki elinizin baş parmaklarıyla bastırın ve ardından açık mavi gövdeyi tıklayana kadar bastırın.
- Kartuş gövdesini yukarı kaldırarak dikkatlice çıkarın. Bir cımbız kullanarak filtre zarını kenardan çok nazikçe alın. Lütfen filtre membranını sıkıştırmak ve tutmak için filtre zarının dış kenarını (1 mm genişliğindeki kenar kısmı) kullandığınızdan emin olun.
- Filtre membranını (zenginleştirilmiş CTC'lerin bulunduğu) nükleik asit preparasyonu için 1,5 mL'lik bir tüpe dikkatlice yerleştirin. Gerekirse, filtrelenmiş kanı 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak kan çıkışına geri kazanın.
4. Sistemin bakımı
- Cihazın temizlenmesi ve dezenfeksiyonu için hazırlık
- Cihazın ve aksesuarların erişilebilir tüm yüzeylerini haftada bir kez etanol ve kuru doku kullanarak ve ayrıca kontamine olduğunda hemen temizleyin.
- Kaseyi ve rotor milini alkol (etanol ve izopropanol) veya alkol bazlı dezenfektanlar kullanarak düzenli olarak temizleyin.
- Cihazın temizlenmesi ve dezenfekte edilmesi
NOT: Genel sorun giderme ve makineyle ilgili diğer notlar için Ek Tablo 2'ye bakın.- Ana güç düğmesini kullanarak cihazı kapatın. Güç fişini güç kaynağından çıkarın.
- Kapıyı açın ve güç kablosu da dahil olmak üzere cihazın erişilebilir tüm yüzeylerini nemli bir bez ve önerilen temizlik maddeleri kullanarak temizleyin ve dezenfekte edin.
- Rotor milinde hasar olup olmadığını kontrol edin. Cihazı korozyon ve hasar açısından kontrol edin.
- Cihazı güç kaynağına yalnızca içi ve dışı tamamen kuruysa bağlayın.
- Ana güç fişini çıkarın ve sigorta tutucuyu çıkarın. Sigorta tutucu elektrik prizinin üzerinde bulunur. Kullanılmış sigortayı kaptan yedek bir sigorta ile değiştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu tekniğin amacı, kanserle ilişkili maddeleri tam kandan kolayca ve otomatik olarak izole etmektir. Özellikle, herkes bu tekniği uygun tüm araştırma ve analiz alanlarında kullanabilir. Tek bir kan örneğinde birden fazla maddenin eşzamanlı ve tekrarlanabilir şekilde ayrılması, sıvı biyopsilerde önemlidir. LBx-1 ve LBx-2 diskleri, plazma ve buffy coat veya PBMC'yi tam kandan izole etmek için kullanılır. Şekil 1 , bu cihazın uygulanmasıyla ayrılan malzemeleri göstermektedir. İlk olarak, plazma LBx-1 kullanılarak 10 mL kandan elde edildi veya PBMC'ler LBx-2 kullanılarak elde edildi. İkincisi, ayrılmış buffy kaplamanın 3 mL'si PBS ile FAST-auto'ya yeniden enjekte edildi ve CTC'ler membrandan süzüldü. Üçüncüsü, membran depolama tamponu ile doldurulmuş bir tüpe aktarıldı veya hemen boyama için kullanıldı. Diğer uygulamalar veya uzun süreli depolama için, CTC'ler vorteks yoluyla membrandan kolayca çıkarılabilir.
cfDNA, boncuk konsantrasyonu ile DNA'nın boyut boyut yakalanmasını sağlayabilen manyetik boncuk bazlı DNA izolasyonu kullanılarak plazmadan ekstrakte edildi. cfDNA'nın konsantrasyonu ve saflığı Biyoanalizör kullanılarak ölçüldü. ctDNA da dahil olmak üzere cfDNA konsantrasyonunun, kanserin türüne ve evresine bağlı olarak değiştiği iyi bilinmektedir18. Ek olarak, çoğu cfDNA'nın uzunluğu 166 bp'dir ve bazıları yaklaşık iki veya üç kat daha uzundur. Her bir numuneden elde edilen miktarda, 8.47 ng / mL ve 5.2 ng / mL gibi bir fark olmasına rağmen, cfDNA ekstraksiyonunun sonuçları tüm vakalarda hem konsantrasyon hem de boyut dağılımı için iyiydi (Şekil 2). Bu sonuçlar, LBx-1 yönteminin cfDNA içeren plazmayı doğru bir şekilde ayırdığını göstermektedir.
FAST-auto'da, membran çıkarıldı ve CTC'lerin ve beyaz kan hücrelerinin (WBC'ler) tespiti için floresan antikorlarla boyandı. Cam slaytlara yerleştirilen vitray membran floresan mikroskobu altında gözlemlendi. Boyama ve mikroskobik çalışmalar daha önceki bir çalışmayı takiben gerçekleştirilmiştir19. Sadece CTC'ler EpCAM / Sitokeratin (CTC pozitif belirteç) ve CD45 (WBC pozitif belirteç) antikorları kullanılarak spesifik olarak ayırt edilebilir. Her zar sırasıyla toplam 310 ve 998 hücre yakaladı. Bunlar arasında sırasıyla örnek 1 ve 2'de toplam 3 ve 43 CTC sayılmıştır (Şekil 3). Bu çalışmada kullanılan yöntem, CTC'lerin varlığını ve sayısını belirlemeyi kolaylaştırmaktadır. Ek olarak, cfDNA konsantrasyonundaki ve CTC sayısındaki değişiklikler, alandaki kanserin varlığını ve nüksünü kolayca izlemek için kullanılabilir. Özellikle, bu yöntemler sonuçları etkileyebilecek diğer reaktifleri kullanmadığından, elde edilen malzeme ile aşağı akış deneyleri mümkündür.
Şekil 1: Maddelerin tam kandan eşzamanlı olarak ayrılması için disk karıştırma yönteminin iş akışı . (A) cfDNA içeren plazma elde edilir. (B) CTC'ler buffy ceketten çıkarılır. (C,D) Girdaptan sonra, CTC'ler membrandan ayrılır ve membranda hala az miktarda CTC kalır. Hem elde edilen hücreler hem de membran, numuneleri depolama tamponunda dondurarak uzun süreli depolamaya tabi tutulabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ekstrakte edilen cfDNA'nın saflığı ve miktarı. Ekstrakte edilen cfDNA'lar Biyoanalizör kullanılarak değerlendirildi ve cfDNA tarama bantları elektronik merdivenle birlikte kullanıldı. Yeşil çizgi, merdiven (solda) ve numune (sağda) arasındaki hizalama için kullanıldı. Üçgen işaretleri DNA bandını gösterir. cfDNA'nın çoğu 166 bp'dir ve bazıları uzunluğun tamsayı katlarında bulunur. Genellikle, cfDNA konsantrasyonu 50 bp ila 700 bp boyutlarına kadar ölçülür.
Şekil 3: Membran boyama kullanılarak CTC'lerin sayımı. Membran immünositokimyası boyamasından sonra, hücreler DAPI (Nükleer pozitif) sinyallerini mavi renkte gösterirken, EpCAM / CK (CTC'ler pozitif) ve CD45 (WBC pozitif) sırasıyla yeşil ve kırmızı renkle vurgulanır. Floresan sinyalleri floresan mikroskobu kullanılarak ölçüldü. Ölçek çubuğu 10 μm'yi gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Tablo 1: Yoğunluk gradyanı çözeltisi kullanımı için son hacmin bileşimi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 2: Bakım için genel konular ve uyarılar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CfDNA ve CTC'nin miktarı ve konsantrasyonu kanserin bireyine, evresine ve türüne bağlıdır. Aynı zamanda hastanın durumuna da bağlıdır 2,4,5,10,20. Özellikle, kanserin erken veya kanser öncesi evrelerinde, kanserle ilişkili maddelerin konsantrasyonları çok düşüktür, bu nedenle tespit edilememesi olasılığı yüksektir. Bununla birlikte, erken teşhisin hasta sağkalımı ve tedavi stratejisinin oluşturulması üzerinde çok olumlu bir etkisi vardır. cfDNA ve CTC'nin kanda kısa yarı ömürleri olduğundan, kanser hakkında gerçek zamanlı bilgileri yansıtırlar21,22,23,24,25. Bu nedenle, aynı anda kanserle ilgili çeşitli maddeleri elde etmek için, aynı koşullar altında büyük miktarda kan gerekir. Burada gösterilen sistem kullanıcılara basit bir yöntem sunmaktadır. Kullanıcı, tam kandan istenen malzemeye karşılık gelen diski seçebilir ve kullanabilir. Verilen kartuşlardan birini kullanarak, cfDNA içeren plazma elde edilebilir ve CTC'ler aynı kan örneğinden, boşa harcanmış buffy ceketinden veya PBMC'den bir FAST-auto diske yeniden enjeksiyon yoluyla toplanabilir (Şekil 1).
Boyut tabanlı CTC yakalama basittir, ancak saflık için sınırlamaları vardır. Kanda birçok farklı şekil ve boyutta hücre vardır26. WBC'lerin boyutları 8 ila 16 μm27 arasında değişir. Başka bir çalışmada, ölçülen WBC'nin ortalama büyüklüğü 9 μm idi. Öte yandan, izole CTC'lerin minimum boyutu 16 μm'dir ve ortalama boyut 30 μm28'dir. Ayrıca, CTC'ler hasta kanında diğer kan hücrelerine kıyasla çok az miktarda bulunur. WBC kontaminasyonunu en aza indirmek, çıkış yönündeki analizler için önemlidir. Antikor tabanlı tespit CTC'leri yakalayabilse de, NGS gibi yüksek çözünürlüklü analizler ek tek hücreli toplama teknikleri veya yüksek düzeyde biyoinformatik analiz gerektirir.
Son zamanlarda, çeşitli yakalama teknikleri kullanılarak yüksek çözünürlüklü analizden önce CTC'lerin varlığını sezgisel olarak gözlemlemek için yöntemler uygulanmıştır29. Sonuçlarda gösterildiği gibi, FAST-auto kartuşundan alınan membran CTC algılaması için doğrudan boyanabilir. Yakalanan CTC'ler, depolama veya hücre kültürü gibi diğer uygulamalar için vorteks yoluyla membrandan kolayca yeniden askıya alınabilir (Şekil 1).
Bu yöntem, santrifüjleme ve mikroakışkanların prensiplerini kullanır. Bu nedenle, ekipmanın ve diskin dengesi önemlidir ve disk tutucu ile sabitlemek de önemlidir. Başlangıçtaki yetersiz toplam hacmi PBS ile doldurmak önemlidir. İlk miktar yetersizse, bir sonraki alana geçmekte zorluklara yol açan bir sorun olabilir. Ekipmanın kirlenmesini önlemek ve sıvıları diskin içine ve dışına taşımak için disk tutucuyu bir masa üstüne çıkarın. FAST-auto disk söz konusu olduğunda, membrandaki CTC'ye verilen hasarı azaltmak için numuneleri hızlı bir şekilde işleyin. Özellikle, membranı tutarken kontaminasyonu önlemeye ve uzun süreli depolama için belirlenmiş protokolü izlemeye dikkat edin.
Bununla birlikte, bu yöntemin kullanımı kolaydır ve aynı anda bir ila dört numuneyi işleyebilir. Ayrıca, diski değiştirerek çeşitli sıvı substratları elde edilebilir. Ayrıca, PBMC'leri elde etmek için bir yoğunluk gradyanı çözeltisi kullanmaktan başka ek reaktiflere gerek yoktur. Bu nedenle, elde edilen malzeme aşağı akış kullanımı için iyidir.
Bu yöntemin hala bazı sınırlamaları vardır. Kullanıcı diski rasgele değiştiremez ve aynı anda farklı disk türleri kullanılamaz. Ayrıca, maksimum hacmin sınırları vardır, bu nedenle büyük miktarda kan için birden fazla disk kullanılmalıdır. cfDNA elde etmek için hala ek yöntemlere ihtiyaç vardır. Membranı kullanarak, gözenek boyutunda yakalama yöntemini kullanarak yalnızca CTC'leri elde etmek zordur. Bu nedenle, CTC'ye özgü uygulama deneyleri için hücre seçimi veya sıralaması gereklidir.
Vücutta çeşitli sıvılar vardır ve bazı vücut sıvılarının üretimi hastalık30 ile ilişkilidir. Şu anda, kan vücut sıvısının kullanımı sadece analiz için üstlenilmiştir. Gelecekte, idrar, asit, plevral sıvı ve omurilik sıvısı gibi çeşitli vücut sıvılarındaki performansı doğrulayarak optimal bir protokol oluşturulabilir. Kullanıcılar için daha uygun bir yöntem sağlamak için, cfDNA'yı diskten otomatik olarak çıkaran cihazlar şu anda geliştirilmektedir. Ayrıca, ekstraksiyonu takiben doğrudan disk içinde kantitatif PCR yapabilen ekipman geliştirilme aşamasındadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bu çalışma ile ilgili çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu makale kısmen Kore Tıbbi Cihaz Geliştirme Fonu (KMDF, Hibe No. RS-2020-KD000019) ve Kore Sağlık Endüstrisi Geliştirme Enstitüsü (KHIDI, Hibe No. HI19C0521020020) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
