Summary
Detta dokument beskriver tillämpningen av automatiserad utrustning för att enkelt och effektivt separera och samla ämnen, såsom cellfritt DNA och cirkulerande tumörceller, från helblod.
Abstract
Nyligen har flytande biopsier använts för att diagnostisera olika sjukdomar, inklusive cancer. Kroppsvätskor innehåller många ämnen, inklusive celler, proteiner och nukleinsyror som härrör från normala vävnader, men några av dessa ämnen härstammar också från det sjuka området. Undersökningen och analysen av dessa ämnen i kroppsvätskorna spelar en avgörande roll vid diagnos av olika sjukdomar. Därför är det viktigt att noggrant separera de erforderliga ämnena, och flera tekniker utvecklas för att användas för detta ändamål.
Vi har utvecklat en lab-on-a-disc-typ av enhet och plattform som heter CD-PRIME. Denna enhet är automatiserad och har goda resultat för provkontaminering och provstabilitet. Dessutom har det fördelar med ett bra förvärvsutbyte, en kort driftstid och hög reproducerbarhet. Dessutom, beroende på vilken typ av skiva som ska monteras, kan plasma som innehåller cellfritt DNA, cirkulerande tumörceller, mononukleära celler i perifert blod eller buffyrockar separeras. Således kan förvärvet av en mängd olika material som finns i kroppsvätskorna göras för en mängd olika nedströmsapplikationer, inklusive studier av omics.
Introduction
Tidig och korrekt upptäckt av olika sjukdomar, inklusive cancer, är den viktigaste faktorn för att upprätta en behandlingsstrategi 1,2,3,4. I synnerhet är tidig upptäckt av cancer nära besläktad med ökade överlevnadschanser för patienten 5,6,7,8. Nyligen har flytande biopsier varit i rampljuset för tidig upptäckt av cancer. Fasta tumörer genomgår angiogenes och släpper ut olika ämnen i blodet. I synnerhet har cirkulerande DNA (ctDNA), cirkulerande RNA (ctRNA), proteiner, vesiklar såsom exosomer och cirkulerande tumörceller (CTC) hittats i blodet hos cancerpatienter 2,9. Även om det finns skillnader i mängden av dessa ämnen, observeras de konsekvent inte bara i de tidiga stadierna utan också i de senare stadierna 6,10. Dessa individuella skillnader är dock mycket höga; till exempel är mängden cellfritt DNA (cfDNA) som innehåller ctDNA mindre än 1 000 ng och antalet CTC är mindre än 100 i 10 ml helblod från cancerpatienter11,12,13. Många studier har karakteriserat cancer med hjälp av dessa ämnen som finns i mindre mängder (dvs cfDNA, ctDNA och CTC). För att få exakta resultat är det viktigt att noggrant separera små mängder ämnen med hög renhet13,14. Konventionella centrifugeringsmetoder används ofta, men de är svåra att hantera och har låg renhet beroende på användarens skicklighet. Sedan upptäckten av CTC har flera separationstekniker utvecklats, såsom centrifugering eller densitetsseparation, immunobead och mikrofluidiska metoder. Flera inneslutningstekniker har utvecklats sedan upptäckten av CTC. Dessa tekniker är emellertid ofta begränsade när det är nödvändigt att isolera celler från de olika chips och membran som används för att isolera dem15. Märkningsmetoderna kräver också utrustning som FACS, och det finns gränser för nedströmsprocessen på grund av märkningskontaminering.
Nyligen har användningen av flytande biopsier ökat, och olika studier genomförs för tidig upptäckt av cancer. Även om denna metod är enkel finns det fortfarande svårigheter med nedströmsanalys, och olika studier försöker övervinna dessa svårigheter16,17. Dessutom kräver många webbplatser, inklusive sjukhus, automatiserade, reproducerbara och högrenhetsmetoder som är praktiska att använda. Här har vi utvecklat ett lab-on-a-disc för automatisk separation av ämnen från blodprover efter en flytande biopsi. Dessa enheter är baserade på principen om centrifugering, mikrofluidik och porstor cellfångst. Det finns tre typer av skivor: LBx-1 kan förvärva plasma och buffy coat, medan LBx-2 kan förvärva plasma och PBMC från helblod med en volym mindre än 10 ml; FAST-auto kan också skaffa CTC med hjälp av ett membran som kan tas bort från skivan. Upp till fyra av varje skiva kan användas i en körning. Framför allt är fördelen med denna enhet och metod att den kan erhålla en mängd olika cancer-härledda ämnen från samma prov med en liten mängd blod. Detta innebär att patientens blod bara behöver dras en gång. Dessutom har det fördelen att utesluta fel på grund av skillnader i blodprovtagningsperioden. Denna plattform är enkel att använda och ger exakta resultat för flytande biopsier och nedströmsapplikationer. I detta protokoll införs användningen av enheten och patronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla helblodsprover erhölls från lungcancerpatienter. Forskningen och analysen vid Clinomics utförs av Cancer Genomics Research Institute, och IRB-forskningsgodkännande av regeringen leds av Asan Medical Center Institutional Review Committee (IRB NO. 2021-0802) med IRB-numret registrerat för forskning vid Clinomics.
1. Beredning av prover
- Samla 9 ml helblod i ett EDTA- eller CFDNA-stabilt bloduppsamlingsrör.
- Blanda väl genom att vända röret upp och ner cirka 10 gånger.
- Förvara proverna i rumstemperatur (RT; för korttidsförvaring) eller 4 °C (för långtidsförvaring). Frys inte och tina.
2. Förberedelse av enheten
- Tryck på strömbrytaren för att slå på instrumentet.
En laddningsskärm visas på pekplattan och instrumentet initieras. Håll händerna borta från instrumentet under initieringen. Skärmen för val av kassett visas när instrumentets initiering är klar. - Välj det exempelläge som ska användas. Ändra antalet prover genom att trycka på pilen.
3. Enhetsdrift och provinsamling
- Laddning av LBx-1-patronen
- Välj patrontyp på instrumentets pekskärmspanel. Ändra antalet prover genom att trycka på pilknappen.
- Öppna dörren till instrumentet och sätt i alla patroner som ska användas i ordning efter numret på patronhållaren. Se till att sätta i patronen och patronhållaren korrekt. Om patronen inte sätts in korrekt kan det orsaka betydande skador på instrumentet.
- För totalt fyra patroner, placera provdockans patron i patronhållarens tomma utrymme.
- Använd stödhjulet för att montera patronen och dra åt låsmuttern för att säkra den.
- Stäng dörren och tryck på RUN-knappen på pekskärmen. Instrumentet stänger ventilerna på patronerna, vilket tar cirka 30 s.
- Följ meddelandet för att öppna dörren, ta bort stödhjulet och ta bort den ventilstängda patronen från patronhållaren.
- Placera cylinderampullen på bordet och förbered dig på att injicera hela blodprovet. Pipettera högst 10 ml helblodsprov med en serologisk pipett.
VARNING: Faror med att hantera blod. Under hela proceduren för hantering av blodprover och reagens är det viktigt att bära laboratorierock och laboratoriehandskar. De tillhandahållna säkerhetsdatabladen bör studeras noggrant av laboratoriearbetarna. - För in pipettspetsen djupt in i cylinderampullens provinlopp och injicera långsamt helblodsprovet.
OBS Vid användning av mer än eller lika med 9 ml helblodsprov behövs ingen tillsats av fosfatbuffrad saltlösning (PBS). När du använder mindre än 9 ml helblodsprov, tillsätt PBS för att göra den totala volymen till 9 ml. När du till exempel använder 7,2 ml helblod, tillsätt 1,8 ml PBS i provinloppet. En serologisk pipett eller en pipettspets kan användas för injektion av helblod och PBS. Vid användning av mindre än 8 ml helblodsprov kan buffybeläggningen inte återvinnas ens genom tillsats av 1 ml PBS. För gDNA-förberedelse, använd 200 μL helblod, som separerades före detta steg. - Sätt i patronerna som ska användas i ordning efter numret på patronhållaren. Använd stödhjulet för att montera patronen och dra åt låsmuttern för att säkra den. Stäng dörren och tryck på OK-knappen .
OBS: Plasma och buffy coat separeras automatiskt från helblod, vilket tar cirka 30 minuter.
VIKTIGT Fara under drift. Att öppna dörren eller röra vid instrumentet under höghastighetsroterande operationer kan orsaka allvarliga skador. Det finns också risk för skada på grund av asymmetrisk belastning av rotorn. Om ovanliga vibrationer och ljud uppstår när instrumentet startar vid assisterad cellanrikning eller expertläge kan patronplaceringen vara asymmetrisk. Tryck omedelbart på strömbrytaren för att stoppa och installera patronen ordentligt. - Leta efter meddelandet på skärmen tillsammans med ett larmljud som visas när separationen av plasma och buffy coat är klar.
- Stoppa larmet genom att öppna dörren eller trycka på STOP-knappen . Öppna dörren, ta bort patronen och lägg den på bordet.
- Återvinn 3 ml plasma från plasmautloppet med en 1 ml pipettspets. Återställ buffyskiktet på 3 ml från buffypälsutloppet med en 1 ml pipettspets.
- Ladda LBx-2-patronen
- Välj patronnamnet på instrumentets pekskärmspanel. Ändra antalet prover genom att trycka på pilknappen.
- Öppna dörren och sätt i patronerna som ska användas i ordning efter numret på patronhållaren.
- För totalt fyra patroner, placera provdockans patron i patronhållarens tomma utrymme.
- Använd stödhjulet för att montera patronen och dra åt låsmuttern för att säkra den. Se till att sätta in patronen korrekt i patronhållaren. Om patronen inte sätts in korrekt kan det orsaka betydande skador på instrumentet.
- Stäng dörren och tryck på RUN-knappen på pekskärmen. Instrumentet stänger ventilerna på patronen, vilket tar cirka 30 s.
- Följ meddelandet för att öppna dörren, ta bort stödhjulet och ta bort den ventilstängda patronen från patronhållaren och placera den på bordet.
- Placera cylinderampullen på bordet och förbered dig på att injicera densitetsgradientlösningen och hela blodprovet. Kontrollera volymen av den densitetsgradientlösning och PBS som ska injiceras beroende på volymen av helblodsprovet (tilläggstabell 1).
- Pipettera densitetsgradientlösningen med användning av en serologisk pipett. Sätt in pipettspetsen djupt in i patronens inlopp och injicera långsamt densitetsgradientlösningen.
- Efter injektion av densitetsgradientlösningen, pipettera hela blodprovet med en serologisk pipett. För in pipettspetsen djupt in i cylinderampullens provinlopp och injicera långsamt helblodsprovet.
OBS: När du använder mindre än 9 ml av helblodsprovet, lägg till PBS genom att hänvisa till denna tabell (tilläggstabell 1). - Sätt i patronerna som ska användas i ordning enligt numret på patronhållaren. Använd stödhjulet för att montera patronen och dra åt låsmuttern för att säkra den. Stäng dörren och tryck på OK-knappen .
- Plasma och PBMC separeras automatiskt från helblod, vilket tar cirka 30 minuter. Leta efter meddelandet som visas tillsammans med ett larmljud när separationen av plasma och PBMC är klar.
- Stoppa larmet genom att öppna dörren eller trycka på STOP-knappen . Öppna dörren, ta bort patronen och lägg den på bordet.
- Återvinn 3 ml plasma från plasmautloppet med en 1 ml pipettspets. Återvinn 3 ml av PBMC från PBMC-utloppet med en 1 ml pipettspets.
- Ladda FAST-auto-patronen
- Välj patronen på instrumentets pekskärmspanel. Ändra antalet prover genom att trycka på pilknappen.
- Öppna dörren och sätt i patronerna som ska användas i ordning efter numret på patronhållaren. För totalt fyra patroner, placera provdockans patron i patronhållarens tomma utrymme.
- Använd stödhjulet för att montera patronen och dra åt låsmuttern för att säkra den.
- Stäng dörren och tryck på RUN-knappen på pekskärmens skärm. Instrumentet stänger ventilerna på patronen, vilket tar cirka 30 s.
- Följ meddelandet för att öppna dörren, ta bort stödhjulet och ta bort den ventilstängda patronen från patronhållaren.
- Placera cylinderampullen på bordet och förbered dig på att injicera PBS-lösningen och helblodsprovet. Pipettera 6 ml PBS-lösning med användning av en serologisk pipett. Sätt in pipettspetsen djupt in i cylinderampullens PBS-inlopp och injicera långsamt 6 ml av PBS-lösningen.
- Efter injektion av PBS-lösningen, pipettera 3 ml helblod eller PBMC-prov erhållet från LBx-2 med användning av en serologisk pipett, som tidigare sköljdes med 1% BSA för att förhindra att återstoden fastnade. För in pipettspetsen djupt in i cylinderampullens provinlopp och injicera långsamt helblodsprovet.
- Sätt i patronerna som ska användas i ordning efter numret på patronhållaren. Använd stödhjulet för att montera patronen och dra åt låsmuttern för att säkra den. Stäng dörren och tryck på OK-knappen .
- CTC berikas automatiskt från helblod, vilket tar cirka 15 minuter. Leta efter ett meddelande som visas tillsammans med ett larmljud när anrikningen av CTC är klar. Stoppa larmet genom att öppna dörren eller trycka på STOP-knappen .
- Öppna dörren, ta bort patronen och lägg den på bordet. Sätt i bakplattans borttagare (BPR) i de fyra hålen på patronens framsida. Tryck på den mörkblå vingen med tummarna på båda händerna och tryck sedan på den ljusblå kroppen tills den klickar.
- Ta försiktigt bort patronkroppen genom att lyfta upp den. Plocka försiktigt upp filtermembranet vid kanten med en pincett. Se till att använda filtermembranets yttre kant (den 1 mm breda kantdelen) för att klämma fast och hålla i filtermembranet.
- Placera försiktigt filtermembranet (på vilket berikade CTC finns) i ett 1,5 ml rör för nukleinsyraberedning. Återställ vid behov det filtrerade blodet till blodutloppet med en 1 ml pipettspets.
4. Underhåll av systemet
- Förberedelse för rengöring och desinfektion av instrumentet
- Rengör alla tillgängliga ytor på instrumentet och tillbehören en gång i veckan med etanol och torkad vävnad, och även omedelbart när de är förorenade.
- Rengör skålen och rotoraxeln regelbundet med alkohol (etanol och isopropanol) eller alkoholbaserade desinfektionsmedel.
- Rengöring och desinfektion av instrumentet
OBS: För allmän felsökning och andra anteckningar om maskinen, se tilläggstabell 2.- Stäng av instrumentet med huvudströmbrytaren. Koppla bort strömkontakten från strömförsörjningen.
- Öppna dörren och rengör och desinficera alla tillgängliga ytor på instrumentet, inklusive strömkabeln, med en fuktig trasa och de rekommenderade rengöringsmedlen.
- Kontrollera rotoraxeln för skador. Kontrollera instrumentet för korrosion och skador.
- Anslut instrumentet till strömförsörjningen endast om det är helt torrt inifrån och ut.
- Koppla bort huvudströmkontakten och ta bort säkringshållaren. Säkringshållaren är placerad ovanför eluttaget. Byt ut den använda säkringen med en extra från behållaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denna teknik är att enkelt och automatiskt isolera cancerassocierade ämnen från helblod. I synnerhet kan vem som helst använda denna teknik inom alla lämpliga områden för forskning och analys. Den samtidiga och reproducerbara separationen av flera ämnen i ett enda blodprov är signifikant i flytande biopsier. LBx-1- och LBx-2-skivorna används för att isolera plasma och buffy coat eller PBMC från helblod. Figur 1 visar materialen separerade genom applicering av denna enhet. Först erhölls plasman från 10 ml blod med användning av LBx-1 eller PBMC: erna erhölls med användning av LBx-2. För det andra injicerades 3 ml av den separerade buffybeläggningen igen med PBS i FAST-auto, och CTC filtrerades genom membranet. För det tredje överfördes membranet till ett rör fyllt med lagringsbuffert eller användes omedelbart för färgning. För andra applikationer eller långvarig lagring kan CTC enkelt avlägsnas från membranet genom virvel.
cfDNA extraherades från plasma med hjälp av magnetisk pärlbaserad DNA-isolering som kan fånga DNA storlek för storlek genom pärlkoncentration. Koncentrationen och renheten hos CFDNA mättes med hjälp av Bioanalyzer. Det är välkänt att koncentrationen av CFDNA, inklusive ctDNA, varierar beroende på typ och stadium av cancer18. Dessutom har de flesta CFDNA en längd på 166 bp, och vissa är ungefär två gånger eller tre gånger så långa. Även om det finns en skillnad i mängden som erhålls från varje enskilt prov, såsom 8,47 ng / ml och 5,2 ng / ml, var resultaten av CFDNA-extraktion bra för både koncentration och storleksfördelning i alla fall (figur 2). Dessa resultat indikerar att LBx-1-metoden exakt separerar plasmainnehållande cfDNA.
I FAST-AUTO avlägsnades membranet och färgades med fluorescerande antikroppar för detektion av CTC och vita blodkroppar (WBC). Det färgade membranet placerat på glasskivor observerades under ett fluorescensmikroskop. Färgning och mikroskopiska studier genomfördes efter en tidigare studie19. Endast CTC kan särskiljas specifikt med hjälp av EpCAM / Cytokeratin (CTC-positiv markör) och CD45 (WBC-positiv markör) antikroppar. Varje membran fångade totalt 310 respektive 998 celler. Bland dem räknades totalt 3 och 43 CTC i proverna 1 respektive 2 (figur 3). Metoden som används i denna studie gör det enkelt att bestämma närvaron och antalet CTC. Dessutom kan förändringar i CFDNA-koncentrationen och CTC-numret användas för att enkelt övervaka förekomsten och återfallet av cancer i fältet. I synnerhet, eftersom dessa metoder inte använder andra reagenser som kan påverka resultaten, är nedströms experiment möjliga med det erhållna materialet.
Figur 1: Arbetsflöde för skivblandningsmetod för samtidig separation av ämnen från helblod . (A) Plasmainnehållande CFDNA erhålls. (B) CTC avlägsnas från buffybeläggningen. (C,D) Efter virvel lossnar CTC från membranet, och en liten mängd CTC kvarstår fortfarande på membranet. Både erhållna celler och membranet kan genomgå långvarig lagring genom att frysa prover i lagringsbufferten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Renhet och mängd extraherat CFDNA. De extraherade cfDNA:erna utvärderades med hjälp av Bioanalyzer, och CFDNA-skärmband användes tillsammans med en elektronisk stege. Den gröna linjen användes för inriktning mellan stegen (vänster) och provet (höger). Triangelmärkena indikerar DNA-bandet. Det mesta av CFDNA är 166 bp, och vissa finns i heltalsmultiplar av längd. Vanligtvis mäter koncentrationen av CFDNA upp till storleken 50 bp till 700 bp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Räkning av CTC med membranfärgning. Efter membranimmuncytokemifärgning visar celler DAPI-signaler (kärnpositiva) i blått, medan EpCAM / CK (CTC-positiv) och CD45 (WBC-positiv) markeras i grönt respektive rött. Fluorescenssignaler mättes med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Skalstrecket anger 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggstabell 1: Sammansättning av den slutliga volymen för användning av densitetsgradientlösning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 2: Allmänna frågor och försiktighetsåtgärder för underhåll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mängden och koncentrationen av CFDNA och CTC beror på individen, scenen och typen av cancer. Det beror också på patientens tillstånd 2,4,5,10,20. I synnerhet i de tidiga eller precancerösa stadierna av cancer är koncentrationerna av cancerrelaterade ämnen mycket låga, så det finns en stor möjlighet att det inte kan detekteras. Icke desto mindre har tidig upptäckt en mycket positiv effekt på patientens överlevnad och etablering av behandlingsstrategi. Eftersom CFDNA och CTC har kort halveringstid i blodet återspeglar de realtidsinformation om cancer 21,22,23,24,25. För att samtidigt förvärva olika cancerrelaterade ämnen krävs därför en stor mängd blod under samma förhållanden. Systemet som visas här ger användarna en enkel metod. Användaren kan välja och använda skivan som motsvarar det material som krävs från helblod. Med hjälp av en av de givna patronerna kan plasmainnehållande cfDNA erhållas, och CTC kan samlas in från samma blodprov, bortkastad buffy coat eller PBMC genom återinjektion i en FAST-auto-skiva (figur 1).
Storleksbaserad CTC-inspelning är enkel, men den har begränsningar för renhet. Det finns många olika former och storlekar av celler i blodet26. WBC varierar i storlek från 8 till 16 μm27. I en annan studie var medelstorleken på den uppmätta WBC 9 μm. Å andra sidan är minsta storleken på isolerade CTC 16 μm och medelstorleken är 30 μm28. Dessutom finns CTC i en mycket liten mängd i patientens blod jämfört med andra blodkroppar. Att minimera WBC-föroreningar är viktigt för nedströmsanalyser. Även om antikroppsbaserad detektion kan fånga CTC, kräver högupplöst analys som NGS ytterligare encellsplockningstekniker eller en hög nivå av bioinformatisk analys.
Nyligen har metoder för att intuitivt observera närvaron av CTC före högupplöst analys med olika fångsttekniker implementerats29. Som visas i resultaten kan membranet som förvärvats från FAST-auto-patronen färgas direkt för CTC-detektering. Infångade CTC kan också enkelt återsuspenderas från membranet genom virvel för lagring eller ytterligare applikationer som cellodling (figur 1).
Denna metod använder principerna för centrifugering och mikrofluidik. Därför är balansen mellan utrustningen och skivan viktig, och det är också viktigt att säkra den med skivhållaren. Det är viktigt att fylla alla initiala otillräckliga totala volymer med PBS. Om det ursprungliga beloppet är otillräckligt kan det finnas ett problem som leder till svårigheter att flytta till nästa utrymme. Ta ut skivhållaren på en bordsskiva för att förhindra kontaminering av utrustningen och för att flytta vätskor in och ut ur skivan. När det gäller FAST-auto-skiva, bearbeta proverna snabbt för att minska skadorna på CTC i membranet. Var särskilt noga med att förhindra kontaminering vid hantering av membranet och att följa det etablerade protokollet för långvarig lagring.
Ändå är denna metod lätt att använda och kan bearbeta ett till fyra prover samtidigt. Dessutom kan olika substrat av vätska erhållas genom att helt enkelt byta ut skivan. Dessutom krävs inga ytterligare reagenser annat än att använda en densitetsgradientlösning för att erhålla PBMC. Därför är det erhållna materialet bra för nedströms användning.
Denna metod har fortfarande vissa begränsningar. Användaren kan inte ändra skivan godtyckligt och olika typer av skivor kan inte användas samtidigt. Det finns också gränser för den maximala volymen, så flera skivor måste användas för stora volymer blod. Ytterligare metoder behövs fortfarande för att erhålla CFDNA. Med hjälp av membranet är det svårt att endast erhålla CTC med hjälp av porstorleksmetoden. Därför krävs cellval eller sortering för CTC-specifika applikationsexperiment.
Det finns olika vätskor i kroppen, och produktionen av vissa kroppsvätskor är förknippad med sjukdom30. För närvarande har användning av blodkroppsvätskan endast utförts för analys. I framtiden kan ett optimalt protokoll upprättas genom att bekräfta prestanda i olika kroppsvätskor som urin, ascites, pleuralvätska och ryggmärgsvätska. För att ge en bekvämare metod för användare utvecklas för närvarande enheter som automatiskt extraherar CFDNA från skivan. Dessutom är utrustning som kan utföra kvantitativ PCR direkt i skivan efter extraktionen under utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter relaterade till detta arbete.
Acknowledgments
Detta manuskript stöddes delvis av Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) och Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
- Babayan, A., Pantel, K. Advances in liquid biopsy approaches for early detection and monitoring of cancer. Genome Medicine. 10 (1), 21 (2018).
- Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
- Bardelli, A., Pantel, K. Liquid biopsies, what we do not know (yet). Cancer Cell. 31 (2), 172-179 (2017).
- Mattox, A. K., et al. Applications of liquid biopsies for cancer. Science Translational Medicine. 11 (507), (2019).
- Heitzer, E., Perakis, S., Geigl, J. B., Speicher, M. R. The potential of liquid biopsies for the early detection of cancer. NPJ Precision Oncology. 1 (1), 36 (2017).
- Scudellari, M. Myths that will not die. Nature. 582 (7582), 322-326 (2015).
- Prasad, V., Fojo, T., Brada, M. Precision oncology: origins, optimism, and potential. The Lancet Oncology. 17 (2), 81-86 (2016).
- Prasad, V. Perspective: The precision-oncology illusion. Nature. 537 (7619), 63 (2016).
- Siravegna, G., Marsoni, S., Siena, S., Bardelli, A. Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (9), 531-548 (2017).
- Bettegowda, C., et al. Detection of circulating tumor DNA in early-and late-stage human malignancies. Science Translational Medicine. 6 (224), 24 (2014).
- Udomruk, S., Orrapin, S., Pruksakorn, D., Chaiyawat, P. Size distribution of cell-free DNA in oncology. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 166, 103455 (2021).
- Paterlini-Brechot, P., Benali, N. L. Circulating tumor cells (CTC) detection: clinical impact and future directions. Cancer Letters. 253 (2), 180-204 (2007).
- Loeian, M. S., et al. Liquid biopsy using the nanotube-CTC-chip: capture of invasive CTCs with high purity using preferential adherence in breast cancer patients. Lab on a Chip. 19 (11), 1899-1915 (2019).
- Rikkert, L. G., Van Der Pol, E., Van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R., Coumans, F. A. W. Centrifugation affects the purity of liquid biopsy-based tumor biomarkers. Cytometry Part A. 93 (12), 1207-1212 (2018).
- Sharma, S., et al. Circulating tumor cell isolation, culture, and downstream molecular analysis. Biotechnology advances. 36 (4), 1063-1078 (2018).
- Bennett, C. W., Berchem, G., Kim, Y. J., El-Khoury, V. Cell-free DNA and next-generation sequencing in the service of personalized medicine for lung cancer. Oncotarget. 7 (43), 71013 (2016).
- Lowes, L. E., et al. Circulating tumor cells (CTC) and cell-free DNA (cfDNA) workshop 2016: scientific opportunities and logistics for cancer clinical trial incorporation. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1505 (2016).
- Bryzgunova, O. E., Konoshenko, M. Y., Laktionov, P. P. Concentration of cell-free DNA in different tumor types. Expert Review of Molecular Diagnostics. 21 (1), 63-75 (2021).
- Park, Y., et al. Circulating tumour cells as an indicator of early and systemic recurrence after surgical resection in pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 11 (1), 1-12 (2021).
- Heidrich, I., Ačkar, L., Mossahebi Mohammadi, P., Pantel, K. Liquid biopsies: Potential and challenges. International Journal of Cancer. 148 (3), 528-545 (2021).
- Celec, P., Vlková, B., Lauková, L., Bábíčková, J., Boor, P. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1 (2018).
- Thierry, A. R., et al. Origin and quantification of circulating DNA in mice with human colorectal cancer xenografts. Nucleic Acids Research. 38 (18), 6159-6175 (2010).
- Moreira, V. G., de la Cera Martínez, T., Gonzalez, E. G., Garcia, B. P., Menendez, F. V. A. Increase in and clearance of cell-free plasma DNA in hemodialysis quantified by real-time PCR. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 44 (12), 1410-1415 (2006).
- Gauthier, V. J., Tyler, L. N., Mannik, M. Blood clearance kinetics and liver uptake of mononucleosomes in mice. Journal of Immunology. 156 (3), 1151-1156 (1996).
- Meng, S., et al. Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clinical Cancer Research. 10 (24), 8152-8162 (2004).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nature Reviews Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Zhou, J., et al. Isolation of circulating tumor cells in non-small-cell-lung-cancer patients using a multi-flow microfluidic channel. Microsystems & Nanoengineering. 5 (1), 8 (2019).
- Sajay, B. N. G., et al. Towards an optimal and unbiased approach for tumor cell isolation. Biomedical Microdevices. 15 (4), 699-709 (2013).
- Bailey, P. C., Martin, S. S. Insights on CTC biology and clinical impact emerging from advances in capture technology. Cells. 8 (6), 553 (2019).
- Ahn, S. M., Simpson, R. J. Body fluid proteomics: Prospects for biomarker discovery. Proteomics-Clinical Applications. 1 (9), 1004-1015 (2007).
