Summary
Este documento describe la aplicación de equipos automatizados para separar y recolectar sustancias de manera fácil y eficiente, como ADN libre de células y células tumorales circulantes, de sangre total.
Abstract
Recientemente, las biopsias líquidas se han utilizado para diagnosticar diversas enfermedades, incluido el cáncer. Los fluidos corporales contienen muchas sustancias, incluyendo células, proteínas y ácidos nucleicos que se originan en los tejidos normales, pero algunas de estas sustancias también se originan en el área enferma. La investigación y el análisis de estas sustancias en los fluidos corporales juegan un papel fundamental en el diagnóstico de diversas enfermedades. Por lo tanto, es importante separar con precisión las sustancias requeridas, y se desarrollan varias técnicas para ser utilizadas para este propósito.
Hemos desarrollado un tipo de dispositivo y plataforma de laboratorio en un disco llamado CD-PRIME. Este dispositivo está automatizado y tiene buenos resultados para la contaminación de la muestra y la estabilidad de la muestra. Además, tiene ventajas de un buen rendimiento de adquisición, un corto tiempo de operación y una alta reproducibilidad. Además, dependiendo del tipo de disco a montar, se puede separar el plasma que contiene ADN libre de células, las células tumorales circulantes, las células mononucleares de sangre periférica o las capas leucocitarias. Por lo tanto, la adquisición de una variedad de materiales presentes en los fluidos corporales se puede hacer para una variedad de aplicaciones posteriores, incluido el estudio de ómicas.
Introduction
La detección precoz y precisa de diversas enfermedades, incluyendo el cáncer, es el factor más importante para establecer una estrategia de tratamiento 1,2,3,4. En particular, la detección precoz del cáncer está estrechamente relacionada con el aumento de las posibilidades de supervivencia para el paciente 5,6,7,8. Recientemente, las biopsias líquidas han estado en el centro de atención para la detección temprana del cáncer. Los tumores sólidos sufren angiogénesis y liberan diversas sustancias en la sangre. En particular, se han encontrado ADN circulantes (ctDNAs), ARN circulantes (ctRNAs), proteínas, vesículas como exosomas y células tumorales circulantes (CTCs) en la sangre de pacientes con cáncer 2,9. Aunque existen diferencias en la cantidad de estas sustancias, se observan consistentemente no sólo en las primeras etapas, sino también en las etapas posteriores 6,10. Sin embargo, estas diferencias individuales son muy altas; por ejemplo, la cantidad de ADN libre de células (ADNcf) que contiene ctDNA es inferior a 1.000 ng, y el número de CTC es inferior a 100 en 10 ml de sangre total de pacientes con cáncer11,12,13. Muchos estudios han caracterizado el cáncer utilizando estas sustancias presentes en cantidades menores (es decir, cfDNA, ctDNA y CTC). Para obtener resultados precisos, es importante separar con precisión pequeñas cantidades de sustancias con alta pureza13,14. Los métodos convencionales de centrifugación se utilizan comúnmente, pero son difíciles de manejar y tienen baja pureza dependiendo de la habilidad del usuario. Desde el descubrimiento de las CTC, se han desarrollado varias técnicas de separación, como la centrifugación o separación de grado de densidad, la inmunoperla y los métodos microfluídicos. Se han desarrollado varias técnicas de contención desde el descubrimiento de los CTC. Sin embargo, estas técnicas a menudo son limitadas cuando es necesario aislar las células de los diversos chips y membranas utilizadas para aislarlas15. Además, los métodos de etiquetado requieren equipos como FACS, y existen límites para el proceso posterior debido a la contaminación del etiquetado.
Recientemente, el uso de biopsias líquidas ha aumentado, y se están realizando diversos estudios para la detección temprana del cáncer. A pesar de que este método es simple, todavía existen dificultades en el análisis posterior, y varios estudios están tratando de superar esas dificultades16,17. Además, muchos sitios, incluidos los hospitales, requieren métodos automatizados, reproducibles y de alta pureza que sean cómodos de usar. Aquí, hemos desarrollado un laboratorio en un disco para la separación automatizada de sustancias de muestras de sangre después de una biopsia líquida. Estos dispositivos se basan en el principio de centrifugación, microfluídica y captura de células del tamaño de un poro. Hay tres tipos de discos: LBx-1 puede adquirir plasma y capa leucocitaria, mientras que LBx-2 puede adquirir plasma y PBMC de sangre total con un volumen de menos de 10 ml; FAST-auto también puede adquirir CTC utilizando una membrana que se puede quitar del disco. Se pueden usar hasta cuatro de cada disco en una sola ejecución. Sobre todo, la ventaja de este dispositivo y método es que puede obtener una variedad de sustancias derivadas del cáncer de la misma muestra utilizando una pequeña cantidad de sangre. Esto significa que la sangre del paciente solo necesita ser extraída una vez. Además, tiene la ventaja de excluir errores debidos a diferencias en el período de muestreo de sangre. Esta plataforma es fácil de usar y proporciona resultados precisos para biopsias líquidas y aplicaciones posteriores. En este protocolo, se introduce el uso del dispositivo y el cartucho.
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Protocol
Todas las muestras de sangre entera se obtuvieron de pacientes con cáncer de pulmón. La investigación y el análisis en Clinomics son llevados a cabo por el Instituto de Investigación de Genómica del Cáncer, y la aprobación de la investigación del IRB por parte del gobierno está dirigida por el Comité de Revisión Institucional del Centro Médico Asan (IRB NO. 2021-0802) con el número IRB registrado para la investigación en Clinomics.
1. Preparación de la muestra
- Recoja 9 ml de sangre total en un tubo de recolección de sangre estable con EDTA o cfDNA.
- Mezcle bien volteando el tubo hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces.
- Conservar las muestras a temperatura ambiente (RT; para almacenamiento a corto plazo) o 4 °C (para almacenamiento a largo plazo). No congelar y descongelar.
2. Preparación del dispositivo
- Pulse el interruptor de encendido para encender el instrumento.
NOTA: Aparece una pantalla de carga en el panel táctil y se inicializa el instrumento. Mantenga las manos alejadas del instrumento durante la inicialización. La pantalla de selección del cartucho aparece una vez completada la inicialización del instrumento. - Seleccione el modo de muestra que se va a utilizar. Cambie el número de muestras pulsando la flecha.
3. Funcionamiento del dispositivo y recogida de muestras
- Carga del cartucho LBx-1
- Seleccione el tipo de cartucho en el panel de la pantalla táctil del instrumento. Cambie el número de muestras pulsando el botón de flecha.
- Abra la puerta del instrumento e inserte todos los cartuchos que se utilizarán en orden de número en el soporte del cartucho. Asegúrese de insertar correctamente el cartucho y el soporte del cartucho. Si el cartucho no se inserta correctamente, puede causar daños considerables al instrumento.
- Para un total de cuatro cartuchos, coloque el cartucho ficticio en el espacio vacío del portacartuchos.
- Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo.
- Cierre la puerta y pulse el botón EJECUTAR en la pantalla del panel táctil. El instrumento cierra las válvulas de los cartuchos, lo que tarda aproximadamente 30 s.
- Siga el mensaje para abrir la puerta, quitar la rueda de soporte y retirar el cartucho cerrado con la válvula del soporte del cartucho.
- Coloque el cartucho sobre la mesa y prepárese para inyectar toda la muestra de sangre. Pipetear un máximo de 10 ml de muestra de sangre total utilizando una pipeta serológica.
PRECAUCIÓN: Peligros de manipular sangre. Durante todo el procedimiento de manejo de muestras de sangre y reactivos, es importante usar una bata de laboratorio y guantes de laboratorio. La MSDS proporcionada debe ser estudiada a fondo por los trabajadores del laboratorio. - Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada de muestras del cartucho e inyecte lentamente toda la muestra de sangre.
NOTA Cuando se usa más o igual a 9 ml de muestra de sangre entera, no es necesaria la adición de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Cuando use menos de 9 ml de muestra de sangre total, agregue PBS para que el volumen total sea de 9 ml. Por ejemplo, cuando use 7.2 ml de sangre total, agregue 1.8 ml de PBS a la entrada de la muestra. Se puede utilizar una pipeta serológica o una punta de pipeta para la inyección de sangre total y PBS. Cuando se usa menos de 8 ml de muestra de sangre total, es posible que la capa leucocitaria no se recupere incluso agregando 1 ml de PBS. Para la preparación de ADNg, use 200 μL de sangre total, que se separó antes de este paso. - Inserte los cartuchos que se utilizarán en orden de número en el soporte del cartucho. Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo. Cierre la puerta y pulse el botón OK .
NOTA: El plasma y la capa leucocitaria se separan automáticamente de la sangre total, lo que tarda aproximadamente 30 minutos.
PRECAUCIÓN Peligro durante la operación. Abrir la puerta o tocar el instrumento durante las operaciones de rotación de alta velocidad puede causar lesiones graves. También existe el riesgo de lesiones debido a la carga asimétrica del rotor. Si se producen vibraciones y ruidos inusuales cuando el instrumento arranca en modo de enriquecimiento celular asistido o experto, la colocación del cartucho puede ser asimétrica. Presione inmediatamente la tecla de encendido para detener e instalar correctamente el cartucho. - Busque el mensaje en la pantalla acompañado de un sonido de alarma, que aparece cuando se completa la separación del plasma y la capa leucocitaria.
- Detenga la alarma abriendo la puerta o presionando el botón STOP . Abra la puerta, retire el cartucho y colóquelo sobre la mesa.
- Recuperar 3 ml de plasma de la salida de plasma utilizando una punta de pipeta de 1 ml. Recuperar la capa leucocitaria de 3 ml de la salida de la capa leucocitaria con una punta de pipeta de 1 ml.
- Carga del cartucho LBx-2
- Seleccione el nombre del cartucho en el panel de la pantalla táctil del instrumento. Cambie el número de muestras pulsando el botón de flecha.
- Abra la puerta e inserte los cartuchos que se utilizarán en orden del número en el soporte del cartucho.
- Para un total de cuatro cartuchos, coloque el cartucho ficticio en el espacio vacío del portacartuchos.
- Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo. Asegúrese de insertar correctamente el cartucho en el soporte del cartucho. Si el cartucho no se inserta correctamente, puede causar daños considerables al instrumento.
- Cierre la puerta y pulse el botón EJECUTAR en la pantalla del panel táctil. El instrumento cierra las válvulas del cartucho, lo que tarda aproximadamente 30 s.
- Siga el mensaje para abrir la puerta, quitar la rueda de soporte, retirar el cartucho cerrado con válvula del soporte del cartucho y colocarlo sobre la mesa.
- Coloque el cartucho sobre la mesa y prepárese para inyectar la solución de gradiente de densidad y la muestra de sangre entera. Compruebe el volumen de la solución de gradiente de densidad y PBS que se inyectará en función del volumen de la muestra de sangre total (Tabla complementaria 1).
- Pipetear la solución de gradiente de densidad utilizando una pipeta serológica. Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada del cartucho e inyecte lentamente la solución de gradiente de densidad.
- Después de inyectar la solución de gradiente de densidad, pipetear toda la muestra de sangre con una pipeta serológica. Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada de muestras del cartucho e inyecte lentamente toda la muestra de sangre.
NOTA: Cuando use menos de 9 ml de la muestra de sangre total, agregue PBS consultando esta tabla (Tabla suplementaria 1). - Inserte los cartuchos que se utilizarán en orden según el número en el soporte del cartucho. Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo. Cierre la puerta y pulse el botón OK .
- El plasma y la PBMC se separan automáticamente de la sangre total, lo que tarda aproximadamente 30 minutos. Busque el mensaje que aparece acompañado de un sonido de alarma, cuando la separación de plasma y PBMC se haya completado.
- Detenga la alarma abriendo la puerta o presionando el botón STOP . Abra la puerta, retire el cartucho y colóquelo sobre la mesa.
- Recuperar 3 ml de plasma de la salida de plasma utilizando una punta de pipeta de 1 ml. Recupere 3 ml del PBMC de la salida del PBMC utilizando una punta de pipeta de 1 ml.
- Carga del cartucho FAST-auto
- Seleccione el cartucho en el panel de pantalla táctil del instrumento. Cambie el número de muestras pulsando el botón de flecha.
- Abra la puerta e inserte los cartuchos que se utilizarán en orden del número en el soporte del cartucho. Para un total de cuatro cartuchos, coloque el cartucho ficticio en el espacio vacío del portacartuchos.
- Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo.
- Cierre la puerta y presione el botón EJECUTAR en la pantalla del panel táctil. El instrumento cierra las válvulas del cartucho, lo que tarda aproximadamente 30 s.
- Siga el mensaje para abrir la puerta, quitar la rueda de soporte y retirar el cartucho cerrado con la válvula del soporte del cartucho.
- Coloque el cartucho sobre la mesa y prepárese para inyectar la solución de PBS y la muestra de sangre entera. Pipetear 6 ml de solución de PBS utilizando una pipeta serológica. Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada de PBS del cartucho e inyecte lentamente 6 ml de la solución de PBS.
- Después de inyectar la solución de PBS, pipetear 3 ml de sangre total o muestra de PBMC obtenida de LBx-2 utilizando una pipeta serológica, que se enjuagó previamente con BSA al 1% para evitar que se pegue el residuo. Inserte la punta de la pipeta profundamente en la entrada de muestras del cartucho e inyecte lentamente toda la muestra de sangre.
- Inserte los cartuchos que se utilizarán en orden de número en el soporte del cartucho. Utilice la rueda de soporte para montar el cartucho y apriete la tuerca de bloqueo para asegurarlo. Cierre la puerta y pulse el botón OK .
- Las CTC se enriquecen automáticamente con sangre total, lo que tarda aproximadamente 15 minutos. Busque un mensaje que aparezca acompañado de un sonido de alarma cuando se complete el enriquecimiento de los CTC. Detenga la alarma abriendo la puerta o presionando el botón STOP .
- Abra la puerta, retire el cartucho y colóquelo sobre la mesa. Inserte el removedor de placa posterior (BPR) en los cuatro orificios de la parte frontal del cartucho. Presione el ala azul oscuro con los pulgares de ambas manos y luego presione el cuerpo azul claro hasta que haga clic.
- Retire con cuidado el cuerpo del cartucho levantándolo. Levante muy suavemente la membrana del filtro por el borde con una pinza. Asegúrese de utilizar el borde exterior (la parte del borde de 1 mm de ancho) de la membrana del filtro para pellizcar y sostener la membrana del filtro.
- Coloque cuidadosamente la membrana del filtro (en la que residen los CTC enriquecidos) en un tubo de 1,5 ml para la preparación de ácidos nucleicos. Si es necesario, recupere la sangre filtrada a la salida de sangre con una punta de pipeta de 1 ml.
4. Mantenimiento del sistema
- Preparación para la limpieza y desinfección del instrumento
- Limpie todas las superficies accesibles del instrumento y los accesorios una vez a la semana con etanol y tejido seco, y también inmediatamente cuando esté contaminado.
- Limpie el recipiente y el eje del rotor regularmente con alcohol (etanol e isopropanol) o desinfectantes a base de alcohol.
- Limpieza y desinfección del instrumento
NOTA: Para la solución de problemas generales y otras notas sobre el equipo, consulte la Tabla complementaria 2.- Apague el instrumento con el interruptor de encendido principal. Desconecte el enchufe de alimentación de la fuente de alimentación.
- Abra la puerta y limpie y desinfecte todas las superficies accesibles del instrumento, incluido el cable de alimentación, utilizando un paño húmedo y los agentes de limpieza recomendados.
- Compruebe si el eje del rotor está dañado. Inspeccione el instrumento en busca de corrosión y daños.
- Conecte el instrumento a la fuente de alimentación solo si está completamente seco por dentro y por fuera.
- Desconecte el enchufe de alimentación principal y retire el portafusibles. El portafusibles se encuentra encima de la toma de corriente. Reemplace el fusible usado por uno de repuesto del contenedor.
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Representative Results
El objetivo de esta técnica es aislar fácil y automáticamente las sustancias asociadas al cáncer de la sangre total. En particular, cualquiera puede utilizar esta técnica en todos los campos adecuados de investigación y análisis. La separación simultánea y reproducible de múltiples sustancias en una sola muestra de sangre es significativa en las biopsias líquidas. Los discos LBx-1 y LBx-2 se utilizan para aislar plasma y capa leucocitaria o PBMC de sangre total. La figura 1 muestra los materiales separados por la aplicación de este dispositivo. Primero, el plasma se obtuvo de 10 mL de sangre usando LBx-1 o los PBMCs se obtuvieron usando LBx-2. En segundo lugar, 3 ml de la capa leucocitaria separada se reinyectaron con PBS en FAST-auto, y las CTC se filtraron a través de la membrana. En tercer lugar, la membrana se transfirió a un tubo lleno de tampón de almacenamiento o se usó inmediatamente para teñir. Para otras aplicaciones o almacenamiento a largo plazo, los CTC se pueden eliminar fácilmente de la membrana mediante vórtice.
El cfDNA se extrajo del plasma utilizando aislamiento de ADN basado en perlas magnéticas capaz de capturar tamaño por tamaño el ADN por concentración de perlas. La concentración y pureza del cfDNA se midieron utilizando el Bioanalyzer. Es bien sabido que la concentración de cfDNA, incluyendo ctDNA, varía según el tipo y estadio del cáncer18. Además, la mayoría del cfDNA tiene una longitud de 166 pb, y algunos son aproximadamente el doble o tres veces más largos. Aunque hay una diferencia en la cantidad obtenida de cada muestra individual, como 8,47 ng/mL y 5,2 ng/mL, los resultados de la extracción de cfDNA fueron buenos tanto para la concentración como para la distribución del tamaño en todos los casos (Figura 2). Estos resultados indican que el método LBx-1 separa con precisión el plasma que contiene cfDNA.
En FAST-auto, la membrana se retiró y se tiñó con anticuerpos fluorescentes para la detección de CTC y glóbulos blancos (WBC). La membrana teñida colocada en portaobjetos de vidrio se observó bajo un microscopio de fluorescencia. Los estudios de tinción y microscópicos fueron realizados después de un estudio previo19. Solo las CTC pueden distinguirse específicamente utilizando los anticuerpos EpCAM / citoqueratina (marcador CTC positivo) y CD45 (marcador positivo de leucocitos). Cada membrana capturó un total de 310 y 998 células, respectivamente. Entre ellos, se contaron un total de 3 y 43 CTC en las muestras 1 y 2, respectivamente (Figura 3). El método utilizado en este estudio facilita la determinación de la presencia y el número de CTC. Además, los cambios en la concentración de cfDNA y el número de CTC se pueden usar para monitorear fácilmente la presencia y recurrencia del cáncer en el campo. En particular, dado que estos métodos no utilizan otros reactivos que puedan afectar los resultados, los experimentos posteriores son posibles con el material obtenido.
Figura 1: Flujo de trabajo del método de mezcla de discos para la separación simultánea de sustancias de sangre total . (A) Se obtiene el plasma que contiene cfDNA. (B) Los CTC se retiran de la capa leucocitaria. (C,D) Después del vórtice, las CTC se separan de la membrana, y una pequeña cantidad de CTC aún permanece en la membrana. Tanto las células obtenidas como la membrana pueden someterse a un almacenamiento a largo plazo congelando muestras en el tampón de almacenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pureza y cantidad de cfDNA extraído. Los cfDNAs extraídos se evaluaron utilizando Bioanalyzer, y se utilizaron cintas de cribado de cfDNA junto con una escalera electrónica. La línea verde se utilizó para la alineación entre la escalera (izquierda) y la muestra (derecha). Las marcas triangulares indican la banda de ADN. La mayor parte del cfDNA es de 166 pb, y algunos existen en múltiplos enteros de longitud. Por lo general, la concentración de cfDNA mide hasta el tamaño de 50 pb a 700 pb. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Conteo de CTC mediante tinción por membrana. Después de la tinción inmunocitoquímica de membrana, las células muestran señales DAPI (Nuclear positivas) en azul, mientras que EpCAM / CK (CTC positivo) y CD45 (WBC positivo) se resaltan en verde y rojo, respectivamente. Las señales de fluorescencia se midieron utilizando un microscopio de fluorescencia. La barra de escala indica 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla complementaria 1: Composición del volumen final para el uso de la solución de gradiente de densidad. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Cuadro complementario 2: Cuestiones generales y precauciones para el mantenimiento. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La cantidad y concentración de cfDNA y CTC depende del individuo, la etapa y el tipo de cáncer. También depende de la condición del paciente 2,4,5,10,20. En particular, en las etapas tempranas o precancerosas del cáncer, las concentraciones de sustancias relacionadas con el cáncer son muy bajas, por lo que existe una alta posibilidad de que no se pueda detectar. Sin embargo, la detección temprana tiene un efecto muy positivo en la supervivencia del paciente y el establecimiento de la estrategia de tratamiento. Dado que el cfDNA y la CTC tienen una vida media corta en la sangre, reflejan información en tiempo real sobre el cáncer 21,22,23,24,25. Por lo tanto, para adquirir simultáneamente varias sustancias relacionadas con el cáncer, se requiere una gran cantidad de sangre en las mismas condiciones. El sistema que se muestra aquí proporciona a los usuarios un método simple. El usuario puede seleccionar y utilizar el disco correspondiente al material requerido de sangre total. Usando uno de los cartuchos dados, se puede obtener plasma que contiene cfDNA, y se pueden recolectar CTC de la misma muestra de sangre, capa leucocitaria desperdiciada o PBMC mediante reinyección en un disco automático FAST (Figura 1).
La captura de CTC basada en el tamaño es simple, pero tiene limitaciones de pureza. Hay muchas formas y tamaños diferentes de células en la sangre26. Los glóbulos blancos varían en tamaño de 8 a 16 μm27. En otro estudio, el tamaño medio del leucocitos medido fue de 9 μm. Por otro lado, el tamaño mínimo de las CTC aisladas es de 16 μm, y el tamaño promedio es de 30 μm28. Además, las CTC están presentes en una cantidad muy pequeña en la sangre del paciente en comparación con otras células sanguíneas. Minimizar la contaminación por leucocitos es importante para los análisis posteriores. Aunque la detección basada en anticuerpos puede capturar CTC, el análisis de alta resolución como NGS requiere técnicas adicionales de selección de células individuales o un alto nivel de análisis bioinformático.
Recientemente, se han implementado métodos para observar intuitivamente la presencia de CTC antes del análisis de alta resolución utilizando diversas técnicas de captura29. Como se muestra en los resultados, la membrana adquirida del cartucho FAST-auto se puede teñir directamente para la detección de CTC. Los CTC capturados también se pueden resuspender fácilmente de la membrana mediante vórtice para almacenamiento o aplicaciones adicionales, como el cultivo celular (Figura 1).
Este método utiliza los principios de centrifugación y microfluídica. Por lo tanto, el equilibrio del equipo y el disco es importante, y también es importante asegurarlo con el soporte del disco. Es importante llenar cualquier volumen total insuficiente inicial con PBS. Si la cantidad inicial es insuficiente, puede haber un problema que conduzca a dificultades para pasar al siguiente espacio. Saque el soporte del disco sobre una mesa para evitar la contaminación del equipo y para mover los líquidos dentro y fuera del disco. En el caso del disco FAST-auto, procese las muestras rápidamente para reducir el daño al CTC en la membrana. En particular, tenga cuidado de evitar la contaminación al manipular la membrana y siga el protocolo establecido para el almacenamiento a largo plazo.
Sin embargo, este método es fácil de usar y puede procesar de una a cuatro muestras simultáneamente. Además, se pueden obtener varios sustratos de líquido simplemente reemplazando el disco. Además, no se requieren reactivos adicionales aparte del uso de una solución de gradiente de densidad para obtener PBMC. Por lo tanto, el material obtenido es bueno para su uso posterior.
Este método todavía tiene algunas limitaciones. El usuario no puede modificar el disco arbitrariamente, y no se pueden utilizar diferentes tipos de discos al mismo tiempo. Además, hay límites para el volumen máximo, por lo que se deben usar múltiples discos para grandes volúmenes de sangre. Todavía se necesitan métodos adicionales para obtener cfDNA. Usando la membrana, es difícil obtener solo CTC utilizando el método de captura del tamaño de un poro. Por lo tanto, se requiere la selección o clasificación de células para experimentos de aplicación específicos de CTC.
Hay varios fluidos en el cuerpo, y la producción de ciertos fluidos corporales está asociada con la enfermedad30. Actualmente, el uso del fluido corporal sanguíneo solo se ha realizado para el análisis. En el futuro, se puede establecer un protocolo óptimo confirmando el rendimiento en varios fluidos corporales como orina, ascitis, líquido pleural y líquido cefalorraquídeo. Para proporcionar un método más conveniente para los usuarios, actualmente se están desarrollando dispositivos que extraen automáticamente cfDNA del disco. Además, se está desarrollando un equipo capaz de realizar PCR cuantitativa directamente dentro del disco después de la extracción.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses relacionados con este trabajo.
Acknowledgments
Este manuscrito fue apoyado en parte por el Fondo de Desarrollo de Dispositivos Médicos de Corea (KMDF, Subvención No. RS-2020-KD000019) y el Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI, Subvención No. HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
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