Summary
Questo documento descrive l'applicazione di apparecchiature automatizzate per separare e raccogliere in modo semplice ed efficiente sostanze, come il DNA privo di cellule e le cellule tumorali circolanti, dal sangue intero.
Abstract
Recentemente, le biopsie liquide sono state utilizzate per diagnosticare varie malattie, tra cui il cancro. I fluidi corporei contengono molte sostanze, tra cui cellule, proteine e acidi nucleici provenienti da tessuti normali, ma alcune di queste sostanze provengono anche dall'area malata. L'indagine e l'analisi di queste sostanze nei fluidi corporei svolgono un ruolo fondamentale nella diagnosi di varie malattie. Pertanto, è importante separare accuratamente le sostanze richieste e vengono sviluppate diverse tecniche da utilizzare a tale scopo.
Abbiamo sviluppato un tipo di dispositivo e piattaforma lab-on-a-disc chiamato CD-PRIME. Questo dispositivo è automatizzato e ha buoni risultati per la contaminazione del campione e la stabilità del campione. Inoltre, ha vantaggi di una buona resa di acquisizione, un breve tempo di funzionamento e un'elevata riproducibilità. Inoltre, a seconda del tipo di disco da montare, il plasma contenente DNA privo di cellule, cellule tumorali circolanti, cellule mononucleate del sangue periferico o buffy coat può essere separato. Pertanto, l'acquisizione di una varietà di materiali presenti nei fluidi corporei può essere effettuata per una varietà di applicazioni a valle, incluso lo studio dell'omica.
Introduction
La diagnosi precoce e accurata di varie malattie, incluso il cancro, è il fattore più importante nello stabilire una strategia di trattamento 1,2,3,4. In particolare, la diagnosi precoce del cancro è strettamente correlata all'aumento delle possibilità di sopravvivenza per il paziente 5,6,7,8. Recentemente, le biopsie liquide sono state sotto i riflettori per la diagnosi precoce del cancro. I tumori solidi subiscono angiogenesi e rilasciano varie sostanze nel sangue. In particolare, DNA circolanti (ctDNA), RNA circolanti (ctRNA), proteine, vescicole come esosomi e cellule tumorali circolanti (CTC) sono stati trovati nel sangue di pazienti oncologici 2,9. Sebbene ci siano differenze nella quantità di queste sostanze, sono costantemente osservate non solo nelle fasi iniziali ma anche nelle fasi successive 6,10. Tuttavia, queste differenze individuali sono molto elevate; ad esempio, la quantità di DNA privo di cellule (cfDNA) contenente ctDNA è inferiore a 1.000 ng e il numero di CTC è inferiore a 100 in 10 ml di sangue intero da pazienti oncologici11,12,13. Molti studi hanno caratterizzato il cancro utilizzando queste sostanze presenti in quantità minori (cioè cfDNA, ctDNA e CTC). Per ottenere risultati accurati, è importante separare accuratamente piccole quantità di sostanze con elevata purezza13,14. I metodi di centrifugazione convenzionali sono comunemente usati, ma sono difficili da gestire e hanno una bassa purezza a seconda dell'abilità dell'utente. Dalla scoperta dei CTC, sono state sviluppate diverse tecniche di separazione, come la centrifugazione o la separazione del grado di densità, l'immunobead e i metodi microfluidici. Diverse tecniche di contenimento sono state sviluppate dalla scoperta dei CTC. Tuttavia, queste tecniche sono spesso limitate quando è necessario isolare le cellule dai vari chip e membrane utilizzati per isolarle15. Inoltre, i metodi di etichettatura richiedono attrezzature come FACS e ci sono limiti al processo a valle a causa della contaminazione dell'etichettatura.
Recentemente, l'uso di biopsie liquide è aumentato e sono stati condotti vari studi per la diagnosi precoce del cancro. Sebbene questo metodo sia semplice, ci sono ancora difficoltà nell'analisi a valle, e vari studi stanno tentando di superare queste difficoltà16,17. Inoltre, molti siti, compresi gli ospedali, richiedono metodi automatizzati, riproducibili e ad alta purezza che siano convenienti da usare. Qui, abbiamo sviluppato un lab-on-a-disc per la separazione automatica delle sostanze dai campioni di sangue dopo una biopsia liquida. Questi dispositivi si basano sul principio della centrifugazione, della microfluidica e della cattura cellulare delle dimensioni dei pori. Esistono tre tipi di dischi: LBx-1 può acquisire plasma e buffy coat, mentre LBx-2 può acquisire plasma e PBMC da sangue intero con un volume inferiore a 10 ml; FAST-auto può anche acquisire CTC utilizzando una membrana rimovibile dal disco. È possibile utilizzare fino a quattro di ciascun disco in una sola esecuzione. Soprattutto, il vantaggio di questo dispositivo e metodo è che può ottenere una varietà di sostanze derivate dal cancro dallo stesso campione utilizzando una piccola quantità di sangue. Ciò significa che il sangue del paziente deve essere prelevato solo una volta. Inoltre, ha il vantaggio di escludere errori dovuti a differenze nel periodo di prelievo del sangue. Questa piattaforma è facile da usare e fornisce risultati accurati per biopsie liquide e applicazioni a valle. In questo protocollo, viene introdotto l'utilizzo del dispositivo e della cartuccia.
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Protocol
Tutti i campioni di sangue intero sono stati ottenuti da pazienti affetti da cancro del polmone. La ricerca e l'analisi presso Clinomics sono condotte dal Cancer Genomics Research Institute e l'approvazione della ricerca IRB da parte del governo è guidata dal Comitato di revisione istituzionale dell'Asan Medical Center (IRB NO. 2021-0802) con il numero IRB registrato per la ricerca presso Clinomics.
1. Preparazione del campione
- Raccogliere 9 ml di sangue intero in una provetta di raccolta del sangue stabile con EDTA o cfDNA.
- Mescolare bene capovolgendo il tubo su e giù circa 10 volte.
- Conservare i campioni a temperatura ambiente (RT; per la conservazione a breve termine) o a 4 °C (per la conservazione a lungo termine). Non congelare e scongelare.
2. Preparazione del dispositivo
- Premere l'interruttore di alimentazione per accendere lo strumento.
NOTA: sul touchpad viene visualizzata una schermata di caricamento e lo strumento viene inizializzato. Tenere le mani lontane dallo strumento durante l'inizializzazione. La schermata di selezione della cartuccia viene visualizzata al termine dell'inizializzazione dello strumento. - Selezionare la modalità campione da utilizzare. Modificare il numero di campioni premendo la freccia.
3. Funzionamento del dispositivo e raccolta dei campioni
- Caricamento della cartuccia LBx-1
- Selezionare il tipo di cartuccia sul pannello touchscreen dello strumento. Modificare il numero di campioni premendo il pulsante freccia.
- Aprire lo sportello dello strumento e inserire tutte le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce. Assicurarsi di inserire correttamente la cartuccia e il portacartucce. Se la cartuccia non è inserita correttamente, potrebbe causare danni considerevoli allo strumento.
- Per un totale di quattro cartucce, posizionare la cartuccia fittizia nello spazio vuoto del portacartucce.
- Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo.
- Chiudere lo sportello e premere il pulsante RUN sullo schermo del touchpad. Lo strumento chiude le valvole sulle cartucce, il che richiede circa 30 s.
- Seguire il messaggio per aprire lo sportello, rimuovere la ruota di supporto e rimuovere la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia.
- Posizionare la cartuccia sul tavolo e prepararsi a iniettare l'intero campione di sangue. Pipettare un massimo di 10 ml di campione di sangue intero utilizzando una pipetta sierologica.
ATTENZIONE: Pericoli della manipolazione del sangue. Durante l'intera procedura di manipolazione di campioni di sangue e reagenti, è importante indossare un camice da laboratorio e guanti da laboratorio. La scheda di sicurezza fornita deve essere studiata accuratamente dagli operatori di laboratorio. - Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso del campione della cartuccia e iniettare lentamente l'intero campione di sangue.
NOTA Quando si utilizzano più o uguali a 9 ml di campione di sangue intero, non è necessaria l'aggiunta di soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Quando si utilizzano meno di 9 ml di campione di sangue intero, aggiungere PBS per rendere il volume totale a 9 ml. Ad esempio, quando si utilizzano 7,2 ml di sangue intero, aggiungere 1,8 ml di PBS nell'ingresso del campione. Una pipetta sierologica o una punta di pipetta può essere utilizzata per l'iniezione di sangue intero e PBS. Quando si utilizzano meno di 8 ml di campione di sangue intero, il buffy coat non può essere recuperato anche aggiungendo 1 mL di PBS. Per la preparazione del gDNA, utilizzare 200 μL di sangue intero, che è stato separato prima di questo passaggio. - Inserire le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo. Chiudere lo sportello e premere il pulsante OK .
NOTA: Il plasma e il buffy coat vengono separati automaticamente dal sangue intero, il che richiede circa 30 minuti.
ATTENZIONE Pericolo durante il funzionamento. L'apertura della porta o il contatto con lo strumento durante le operazioni di rotazione ad alta velocità può causare gravi lesioni. C'è anche il rischio di lesioni dovute al carico asimmetrico del rotore. Se si verificano vibrazioni e rumori insoliti quando lo strumento si avvia in modalità di arricchimento cellulare assistito o esperto, il posizionamento della cartuccia può essere asimmetrico. Premere immediatamente il tasto di accensione per arrestare e installare correttamente la cartuccia. - Cerca il messaggio sullo schermo accompagnato da un suono di allarme, che appare quando la separazione di plasma e buffy coat è completa.
- Arrestare l'allarme aprendo la porta o premendo il pulsante STOP . Aprire la porta, rimuovere la cartuccia e posizionarla sul tavolo.
- Recuperare 3 mL di plasma dall'uscita del plasma utilizzando una punta da pipetta da 1 mL. Recuperare il buffy coat da 3 mL dall'uscita del buffy coat utilizzando una punta per pipetta da 1 mL.
- Caricamento della cartuccia LBx-2
- Selezionare il nome della cartuccia sul pannello touchscreen dello strumento. Modificare il numero di campioni premendo il pulsante freccia.
- Aprire lo sportello e inserire le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce.
- Per un totale di quattro cartucce, posizionare la cartuccia fittizia nello spazio vuoto del portacartucce.
- Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo. Assicurarsi di inserire correttamente la cartuccia nel supporto della cartuccia. Se la cartuccia non è inserita correttamente, potrebbe causare danni considerevoli allo strumento.
- Chiudere lo sportello e premere il pulsante RUN sullo schermo del touchpad. Lo strumento chiude le valvole sulla cartuccia, che richiede circa 30 s.
- Seguire il messaggio per aprire lo sportello, rimuovere la ruota di supporto, rimuovere la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia e posizionarla sul tavolo.
- Posizionare la cartuccia sul tavolo e prepararsi a iniettare la soluzione con gradiente di densità e l'intero campione di sangue. Controllare il volume della soluzione a gradiente di densità e della PBS da iniettare in funzione del volume dell'intero campione di sangue (Tabella supplementare 1).
- Pipettare la soluzione del gradiente di densità utilizzando una pipetta sierologica. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso della cartuccia e iniettare lentamente la soluzione con gradiente di densità.
- Dopo aver iniettato la soluzione a gradiente di densità, pipettare l'intero campione di sangue utilizzando una pipetta sierologica. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso del campione della cartuccia e iniettare lentamente l'intero campione di sangue.
NOTA: Quando si utilizzano meno di 9 ml di campione di sangue intero, aggiungere PBS facendo riferimento a questa tabella (Tabella supplementare 1). - Inserire le cartucce da utilizzare in base al numero riportato sul portacartucce. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo. Chiudere lo sportello e premere il pulsante OK .
- Il plasma e la PBMC vengono separati automaticamente dal sangue intero, il che richiede circa 30 minuti. Cerca il messaggio che appare accompagnato da un suono di allarme, quando la separazione di plasma e PBMC è completa.
- Arrestare l'allarme aprendo la porta o premendo il pulsante STOP . Aprire la porta, rimuovere la cartuccia e posizionarla sul tavolo.
- Recuperare 3 mL di plasma dall'uscita del plasma utilizzando una punta da pipetta da 1 mL. Recuperare 3 mL di PBMC dalla presa PBMC utilizzando una punta per pipetta da 1 mL.
- Caricamento della cartuccia FAST-auto
- Selezionare la cartuccia sul pannello touch screen dello strumento. Modificare il numero di campioni premendo il pulsante freccia.
- Aprire lo sportello e inserire le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce. Per un totale di quattro cartucce, posizionare la cartuccia fittizia nello spazio vuoto del portacartucce.
- Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo.
- Chiudere lo sportello e premere il pulsante RUN sullo schermo del touchpad. Lo strumento chiude le valvole sulla cartuccia, che richiede circa 30 s.
- Seguire il messaggio per aprire lo sportello, rimuovere la ruota di supporto e rimuovere la cartuccia chiusa a valvola dal supporto della cartuccia.
- Posizionare la cartuccia sul tavolo e prepararsi a iniettare la soluzione PBS e il campione di sangue intero. Pipettare 6 mL di soluzione PBS utilizzando una pipetta sierologica. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso PBS della cartuccia e iniettare lentamente 6 mL della soluzione PBS.
- Dopo aver iniettato la soluzione PBS, pipettare 3 ml di sangue intero o campione di PBMC ottenuto da LBx-2 utilizzando una pipetta sierologica, che è stata precedentemente risciacquata con BSA all'1% per evitare l'attaccamento del residuo. Inserire la punta della pipetta in profondità nell'ingresso del campione della cartuccia e iniettare lentamente l'intero campione di sangue.
- Inserire le cartucce da utilizzare in ordine di numero sul portacartucce. Utilizzare la rotella di supporto per montare la cartuccia e serrare il dado di bloccaggio per fissarlo. Chiudere lo sportello e premere il pulsante OK .
- I CTC sono arricchiti automaticamente dal sangue intero, il che richiede circa 15 minuti. Cerca un messaggio che appaia accompagnato da un suono di allarme quando l'arricchimento dei CTC è completo. Arrestare l'allarme aprendo la porta o premendo il pulsante STOP .
- Aprire la porta, rimuovere la cartuccia e posizionarla sul tavolo. Inserire il dispositivo di rimozione della piastra posteriore (BPR) nei quattro fori sulla parte anteriore della cartuccia. Premere l'ala blu scuro con i pollici di entrambe le mani, quindi premere il corpo azzurro fino a quando non scatta.
- Rimuovere con cautela il corpo della cartuccia sollevandolo. Raccogliere molto delicatamente la membrana filtrante dal bordo usando una pinzetta. Assicurarsi di utilizzare il bordo esterno (la parte del bordo larga 1 mm) della membrana filtrante per pizzicare e tenere la membrana filtrante.
- Posizionare con cautela la membrana filtrante (su cui risiedono i CTC arricchiti) in un tubo da 1,5 mL per la preparazione degli acidi nucleici. Se necessario, recuperare il sangue filtrato all'uscita del sangue utilizzando una punta di pipetta da 1 ml.
4. Manutenzione del sistema
- Preparazione per la pulizia e la disinfezione dello strumento
- Pulire tutte le superfici accessibili dello strumento e degli accessori una volta alla settimana utilizzando etanolo e fazzoletto essiccato, e anche immediatamente quando contaminati.
- Pulire regolarmente la ciotola e l'albero del rotore utilizzando alcool (etanolo e isopropanolo) o disinfettanti a base alcolica.
- Pulizia e disinfezione dello strumento
NOTA: per la risoluzione generale dei problemi e altre note sulla macchina, fare riferimento alla tabella supplementare 2.- Spegnere lo strumento utilizzando l'interruttore di alimentazione principale. Scollegare la spina di alimentazione dall'alimentatore.
- Aprire lo sportello e pulire e disinfettare tutte le superfici accessibili dello strumento, compreso il cavo di alimentazione, utilizzando un panno umido e i detergenti consigliati.
- Controllare che l'albero del rotore non sia danneggiato. Ispezionare lo strumento per verificare la presenza di corrosione e danni.
- Collegare lo strumento all'alimentatore solo se è completamente asciutto dentro e fuori.
- Scollegare la spina di alimentazione principale e rimuovere il portafusibili. Il portafusibili si trova sopra la presa di corrente. Sostituire il fusibile usato con uno di ricambio dal contenitore.
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Representative Results
L'obiettivo di questa tecnica è quello di isolare facilmente e automaticamente le sostanze associate al cancro dal sangue intero. In particolare, chiunque può utilizzare questa tecnica in tutti i campi adatti di ricerca e analisi. La separazione simultanea e riproducibile di più sostanze in un singolo campione di sangue è significativa nelle biopsie liquide. I dischi LBx-1 e LBx-2 sono utilizzati per isolare il plasma e il buffy coat o PBMC dal sangue intero. La Figura 1 mostra i materiali separati dall'applicazione di questo dispositivo. In primo luogo, il plasma è stato ottenuto da 10 ml di sangue utilizzando LBx-1 o le PBMC sono state ottenute utilizzando LBx-2. In secondo luogo, 3 ml del buffy coat separato sono stati reiniettati con PBS in FAST-auto e i CTC sono stati filtrati attraverso la membrana. In terzo luogo, la membrana è stata trasferita in un tubo riempito con tampone di stoccaggio o immediatamente utilizzata per la colorazione. Per altre applicazioni o stoccaggio a lungo termine, i CTC possono essere facilmente rimossi dalla membrana mediante vortice.
Il cfDNA è stato estratto dal plasma utilizzando l'isolamento del DNA basato su perline magnetiche in grado di catturare dimensione per dimensione il DNA mediante concentrazione di perline. La concentrazione e la purezza del cfDNA sono state misurate utilizzando il Bioanalyzer. È noto che la concentrazione di cfDNA, incluso il ctDNA, varia a seconda del tipo e dello stadio del cancro18. Inoltre, la maggior parte del cfDNA ha una lunghezza di 166 bp, e alcuni sono circa il doppio o tre volte più lunghi. Sebbene vi sia una differenza nella quantità ottenuta da ogni singolo campione, come 8,47 ng / ml e 5,2 ng / ml, i risultati dell'estrazione del cfDNA sono stati buoni sia per la concentrazione che per la distribuzione delle dimensioni in tutti i casi (Figura 2). Questi risultati indicano che il metodo LBx-1 separa accuratamente il plasma contenente cfDNA.
In FAST-auto, la membrana è stata rimossa e colorata con anticorpi fluorescenti per la rilevazione di CTC e globuli bianchi (WBC). La membrana colorata posta su vetrini è stata osservata al microscopio a fluorescenza. Studi di colorazione e microscopici sono stati effettuati a seguito di uno studio precedente19. Solo le CTC possono essere specificamente distinte utilizzando gli anticorpi EpCAM/Cytokeratin (marcatore CTC positivo) e CD45 (marcatore WBC positivo). Ogni membrana ha catturato un totale di 310 e 998 cellule, rispettivamente. Tra questi, un totale di 3 e 43 CTC sono stati contati rispettivamente nei campioni 1 e 2 (Figura 3). Il metodo utilizzato in questo studio rende facile determinare la presenza e il numero di CTC. Inoltre, i cambiamenti nella concentrazione di cfDNA e il numero di CTC possono essere utilizzati per monitorare facilmente la presenza e la recidiva del cancro sul campo. In particolare, poiché questi metodi non utilizzano altri reagenti che possono influenzare i risultati, sono possibili esperimenti a valle con il materiale ottenuto.
Figura 1: Flusso di lavoro del metodo di miscelazione del disco per la separazione simultanea di sostanze dal sangue intero . (A) Si ottiene il plasma contenente cfDNA. (B) I CTC vengono rimossi dal buffy coat. (C,D) Dopo il vortice, i CTC vengono staccati dalla membrana e una piccola quantità di CTC rimane ancora sulla membrana. Sia le cellule ottenute che la membrana possono essere sottoposte a conservazione a lungo termine congelando i campioni nel tampone di stoccaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Purezza e quantità di cfDNA estratto. I cfDNA estratti sono stati valutati utilizzando Bioanalyzer e i nastri dello schermo cfDNA sono stati utilizzati insieme a una scala elettronica. La linea verde è stata utilizzata per l'allineamento tra la scala (a sinistra) e il campione (a destra). I segni del triangolo indicano la banda del DNA. La maggior parte del cfDNA è di 166 bp, e alcuni esistono in multipli interi di lunghezza. Di solito, la concentrazione di cfDNA misura fino alla dimensione di 50 bp a 700 bp. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Conteggio dei CTC mediante colorazione a membrana. Dopo la colorazione immunocitochimica della membrana, le cellule mostrano segnali DAPI (positivi nucleari) in blu, mentre EpCAM / CK (CTC positivi) e CD45 (WBC positivi) sono evidenziati rispettivamente in verde e rosso. I segnali di fluorescenza sono stati misurati utilizzando un microscopio a fluorescenza. La barra della scala indica 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella supplementare 1: Composizione del volume finale per l'uso della soluzione a gradiente di densità. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare 2: Problemi generali e precauzioni per la manutenzione. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
La quantità e la concentrazione di cfDNA e CTC dipende dall'individuo, dallo stadio e dal tipo di cancro. Dipende anche dalle condizioni del paziente 2,4,5,10,20. In particolare, nelle fasi iniziali o precancerose del cancro, le concentrazioni di sostanze correlate al cancro sono molto basse, quindi c'è un'alta possibilità che non possa essere rilevato. Tuttavia, la diagnosi precoce ha un effetto molto positivo sulla sopravvivenza dei pazienti e sulla strategia di trattamento. Poiché cfDNA e CTC hanno una breve emivita nel sangue, riflettono informazioni in tempo reale sul cancro 21,22,23,24,25. Pertanto, per acquisire contemporaneamente varie sostanze correlate al cancro, è necessaria una grande quantità di sangue nelle stesse condizioni. Il sistema mostrato qui fornisce agli utenti un metodo semplice. L'utente può selezionare e utilizzare il disco corrispondente al materiale richiesto dal sangue intero. Utilizzando una delle cartucce fornite, è possibile ottenere plasma contenente cfDNA e i CTC possono essere raccolti dallo stesso campione di sangue, dal buffy coat sprecato o dal PBMC mediante reiniezione in un disco FAST-auto (Figura 1).
L'acquisizione CTC basata sulle dimensioni è semplice, ma presenta limitazioni per la purezza. Ci sono molte diverse forme e dimensioni di cellule nel sangue26. I globuli bianchi variano in dimensioni da 8 a 16 μm27. In un altro studio, la dimensione media del WBC misurato era di 9 μm. D'altra parte, la dimensione minima dei CTC isolati è di 16 μm e la dimensione media è di 30 μm28. Inoltre, le CTC sono presenti in una quantità molto piccola nel sangue del paziente rispetto ad altre cellule del sangue. Ridurre al minimo la contaminazione da globuli bianchi è importante per le analisi a valle. Sebbene il rilevamento basato su anticorpi possa catturare CTC, l'analisi ad alta risoluzione come NGS richiede ulteriori tecniche di prelievo di singole cellule o un alto livello di analisi bioinformatica.
Recentemente, sono stati implementati metodi per osservare intuitivamente la presenza di CTC prima dell'analisi ad alta risoluzione utilizzando varie tecniche di acquisizione29. Come mostrato nei risultati, la membrana acquisita dalla cartuccia FAST-auto può essere colorata direttamente per il rilevamento CTC. I CTC catturati possono anche essere facilmente risospesi dalla membrana mediante vortice per lo stoccaggio o ulteriori applicazioni come la coltura cellulare (Figura 1).
Questo metodo utilizza i principi della centrifugazione e della microfluidica. Pertanto, l'equilibrio dell'apparecchiatura e del disco è importante, ed è anche importante fissarlo con il supporto del disco. È importante riempire qualsiasi volume totale iniziale insufficiente con PBS. Se l'importo iniziale è insufficiente, potrebbe esserci un problema che porta a difficoltà nel passaggio allo spazio successivo. Estrarre il supporto del disco su un tavolo per evitare la contaminazione dell'apparecchiatura e per spostare i liquidi dentro e fuori dal disco. Nel caso del disco FAST-auto, elaborare rapidamente i campioni per ridurre il danno al CTC nella membrana. In particolare, prestare attenzione a prevenire la contaminazione durante la manipolazione della membrana e a seguire il protocollo stabilito per la conservazione a lungo termine.
Tuttavia, questo metodo è facile da usare e può elaborare da uno a quattro campioni contemporaneamente. Inoltre, vari substrati di liquido possono essere ottenuti semplicemente sostituendo il disco. Inoltre, non sono necessari reagenti aggiuntivi se non l'utilizzo di una soluzione a gradiente di densità per ottenere PBMC. Pertanto, il materiale ottenuto è buono per l'uso a valle.
Questo metodo presenta ancora alcune limitazioni. L'utente non può modificare il disco arbitrariamente e diversi tipi di dischi non possono essere utilizzati contemporaneamente. Inoltre, ci sono limiti al volume massimo, quindi è necessario utilizzare più dischi per grandi volumi di sangue. Sono ancora necessari ulteriori metodi per ottenere il cfDNA. Utilizzando la membrana, è difficile ottenere solo CTC utilizzando il metodo di cattura delle dimensioni dei pori. Pertanto, la selezione o l'ordinamento delle celle è necessario per gli esperimenti applicativi specifici di CTC.
Ci sono vari fluidi nel corpo e la produzione di alcuni fluidi corporei è associata alla malattia30. Attualmente, l'uso del fluido corporeo del sangue è stato intrapreso solo per l'analisi. In futuro, è possibile stabilire un protocollo ottimale confermando le prestazioni in vari fluidi corporei come urina, ascite, liquido pleurico e liquido spinale. Per fornire un metodo più conveniente per gli utenti, sono attualmente in fase di sviluppo dispositivi che estraggono automaticamente cfDNA dal disco. Inoltre, è in fase di sviluppo un'apparecchiatura in grado di eseguire la PCR quantitativa direttamente all'interno del disco dopo l'estrazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo lavoro.
Acknowledgments
Questo manoscritto è stato sostenuto in parte dal Korea Medical Device Development Fund (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) e dal Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
References
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