Summary
Este artigo descreve a aplicação de equipamentos automatizados para separar e coletar substâncias de forma fácil e eficiente, como DNA livre de células e células tumorais circulantes, do sangue total.
Abstract
Recentemente, biópsias líquidas têm sido usadas para diagnosticar várias doenças, incluindo câncer. Os fluidos corporais contêm muitas substâncias, incluindo células, proteínas e ácidos nucleicos originários de tecidos normais, mas algumas dessas substâncias também se originam da área doente. A investigação e análise dessas substâncias nos fluidos corporais desempenham um papel fundamental no diagnóstico de várias doenças. Portanto, é importante separar com precisão as substâncias necessárias, e várias técnicas são desenvolvidas para serem usadas para esse fim.
Desenvolvemos um tipo de dispositivo e plataforma lab-on-a-disc chamado CD-PRIME. Este dispositivo é automatizado e tem bons resultados para contaminação da amostra e estabilidade da amostra. Além disso, tem vantagens de um bom rendimento de aquisição, um curto tempo de operação e alta reprodutibilidade. Além disso, dependendo do tipo de disco a ser montado, plasma contendo DNA livre de células, células tumorais circulantes, células mononucleares do sangue periférico ou casacos bufantes podem ser separados. Assim, a aquisição de uma variedade de materiais presentes nos fluidos corporais pode ser feita para uma variedade de aplicações a jusante, incluindo o estudo da ômica.
Introduction
A detecção precoce e precisa de várias doenças, incluindo o câncer, é o fator mais importante para o estabelecimento de uma estratégia de tratamento 1,2,3,4. Em particular, a detecção precoce do câncer está intimamente relacionada ao aumento das chances de sobrevida do paciente 5,6,7,8. Recentemente, biópsias líquidas têm estado no centro das atenções para a detecção precoce do câncer. Os tumores sólidos sofrem angiogênese e liberam várias substâncias no sangue. Em particular, DNAs circulantes (ctDNAs), RNAs circulantes (ctRNAs), proteínas, vesículas, como exossomos, e células tumorais circulantes (CTCs) foram encontrados no sangue de pacientes com câncer 2,9. Embora existam diferenças na quantidade dessas substâncias, elas são consistentemente observadas não apenas nos estágios iniciais, mas também nos estágios posteriores 6,10. No entanto, essas diferenças individuais são muito altas; por exemplo, a quantidade de DNA livre de células (cfDNA) contendo ctDNA é inferior a 1.000 ng, e o número de CTCs é inferior a 100 em 10 mL de sangue total de pacientes com câncer11,12,13. Muitos estudos caracterizaram o câncer usando essas substâncias presentes em quantidades menores (ou seja, cfDNA, ctDNA e CTCs). Para obter resultados precisos, é importante separar com precisão pequenas quantidades de substâncias com alta pureza13,14. Os métodos convencionais de centrifugação são comumente usados, mas são difíceis de manusear e têm baixa pureza, dependendo da habilidade do usuário. Desde a descoberta das CTCs, várias técnicas de separação foram desenvolvidas, como centrifugação ou separação de grau de densidade, imunoesferas e métodos microfluídicos. Várias técnicas de contenção foram desenvolvidas desde a descoberta das CTCs. No entanto, essas técnicas são frequentemente limitadas quando é necessário isolar células dos vários cavacos e membranas utilizados para isolá-las15. Além disso, os métodos de marcação exigem equipamentos como o FACS, e há limites para o processo a jusante devido à contaminação por marcação.
Recentemente, o uso de biópsias líquidas aumentou, e vários estudos estão sendo realizados para a detecção precoce do câncer. Embora esse método seja simples, ainda existem dificuldades na análise a jusante, e vários estudos estão tentando superar essas dificuldades16,17. Além disso, muitos locais, incluindo hospitais, exigem métodos automatizados, reprodutíveis e de alta pureza que sejam convenientes de usar. Aqui, desenvolvemos um laboratório em um disco para a separação automatizada de substâncias de amostras de sangue após uma biópsia líquida. Esses dispositivos são baseados no princípio da centrifugação, microfluídica e captura de células do tamanho de poros. Existem três tipos de discos: LBx-1 pode adquirir plasma e pelagem bufante, enquanto LBx-2 pode adquirir plasma e PBMC do sangue total com um volume inferior a 10 mL; O FAST-auto também pode adquirir CTCs usando uma membrana removível do disco. Até quatro de cada disco podem ser usados em uma execução. Acima de tudo, a vantagem deste dispositivo e método é que ele pode obter uma variedade de substâncias derivadas do câncer da mesma amostra usando uma pequena quantidade de sangue. Isso significa que o sangue do paciente só precisa ser retirado uma vez. Além disso, tem a vantagem de excluir erros devido a diferenças no período de amostragem de sangue. Esta plataforma é fácil de usar e fornece resultados precisos para biópsias líquidas e aplicações a jusante. Neste protocolo, o uso do dispositivo e do cartucho é introduzido.
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Protocol
Todas as amostras de sangue total foram obtidas de pacientes com câncer de pulmão. A pesquisa e a análise na Clinomics são realizadas pelo Cancer Genomics Research Institute, e a aprovação da pesquisa do IRB pelo governo é liderada pelo Comitê de Revisão Institucional do Asan Medical Center (IRB NO. 2021-0802) com o número do IRB registrado para pesquisa na Clinomics.
1. Preparação da amostra
- Colete 9 mL de sangue total em um tubo de coleta de sangue estável em EDTA ou cfDNA.
- Misture bem virando o tubo para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes.
- Conservar as amostras à temperatura ambiente (RT; para armazenagem a curto prazo) ou a 4 °C (para armazenagem a longo prazo). Não congele e descongele.
2. Preparação do dispositivo
- Pressione o interruptor de energia para ligar o instrumento.
NOTA: Uma tela de carregamento aparece no touchpad e o instrumento é inicializado. Mantenha as mãos afastadas do instrumento durante a inicialização. A tela de seleção do cartucho é exibida após a conclusão da inicialização do instrumento. - Selecione o modo de exemplo a ser usado. Altere o número de amostras pressionando a seta.
3. Operação do dispositivo e coleta de amostras
- Carregamento do cartucho LBx-1
- Selecione o tipo de cartucho no painel touchscreen do instrumento. Altere o número de amostras pressionando o botão de seta.
- Abra a porta do instrumento e insira todos os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Certifique-se de que insere corretamente o cartucho e o suporte do cartucho. Se o cartucho não for inserido corretamente, pode causar danos consideráveis ao instrumento.
- Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho.
- Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo.
- Feche a porta e pressione o botão RUN na tela do touchpad. O instrumento fecha as válvulas nos cartuchos, o que leva aproximadamente 30 s.
- Siga a mensagem para abrir a porta, remover a roda de suporte e remover o cartucho fechado com válvula do suporte do cartucho.
- Coloque o cartucho sobre a mesa e prepare-se para injetar a amostra de sangue total. Pipetar um máximo de 10 ml de amostra de sangue total utilizando uma pipeta serológica.
CUIDADO: Perigos de manusear sangue. Durante todo o procedimento de manuseio de amostras de sangue e reagentes, é importante usar um jaleco de laboratório e luvas de laboratório. A FISPQ fornecida deve ser minuciosamente estudada pelos trabalhadores do laboratório. - Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total.
NOTA Ao usar mais ou igual a 9 mL de amostra de sangue total, nenhuma adição de solução salina tamponada com fosfato (PBS) é necessária. Ao usar menos de 9 mL de amostra de sangue total, adicione PBS para fazer o volume total para 9 mL. Por exemplo, ao usar 7,2 mL de sangue total, adicione 1,8 mL de PBS na entrada da amostra. Uma pipeta sorológica ou uma ponta de pipeta pode ser usada para a injeção de sangue total e PBS. Ao usar menos de 8 mL de amostra de sangue total, o revestimento bufante pode não ser recuperado, mesmo adicionando 1 mL de PBS. Para a preparação do gDNA, use 200 μL de sangue total, que foi separado antes desta etapa. - Insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão OK .
NOTA: O plasma e o inchaço são separados do sangue total automaticamente, o que leva aproximadamente 30 minutos.
CUIDADO Perigo durante a operação. Abrir a porta ou tocar no instrumento durante operações de rotação de alta velocidade pode causar ferimentos graves. Há também um risco de lesão devido à carga assimétrica do rotor. Se ocorrerem vibrações e ruídos incomuns quando o instrumento for iniciado no enriquecimento celular assistido ou no modo especialista, a colocação do cartucho pode ser assimétrica. Pressione imediatamente a tecla liga/desliga para parar e instalar corretamente o cartucho. - Procure a mensagem na tela acompanhada por um som de alarme, que aparece quando a separação do plasma e do casaco bufante está completa.
- Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão STOP . Abra a porta, retire o cartucho e coloque-o sobre a mesa.
- Recupere 3 mL de plasma da saída plasmática usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Recupere a pelagem bufante de 3 mL da saída da pelagem bufante usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
- Carregando o cartucho LBx-2
- Selecione o nome do cartucho no painel touchscreen do instrumento. Altere o número de amostras pressionando o botão de seta.
- Abra a porta e insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho.
- Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho.
- Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Certifique-se de inserir corretamente o cartucho no suporte do cartucho. Se o cartucho não for inserido corretamente, pode causar danos consideráveis ao instrumento.
- Feche a porta e pressione o botão RUN na tela do touchpad. O instrumento fecha as válvulas no cartucho, o que leva aproximadamente 30 s.
- Siga a mensagem para abrir a porta, remover a roda de suporte, remover o cartucho fechado com válvula do suporte do cartucho e colocá-lo sobre a mesa.
- Coloque o cartucho sobre a mesa e prepare-se para injetar a solução de gradiente de densidade e a amostra de sangue total. Verificar o volume da solução de gradiente de densidade e PBS a injetar, dependendo do volume da amostra de sangue total (Tabela Suplementar 1).
- Pipetar a solução de gradiente de densidade utilizando uma pipeta serológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada do cartucho e injete lentamente a solução de gradiente de densidade.
- Após a injeção da solução de gradiente de densidade, pipetar a amostra de sangue total utilizando uma pipeta serológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total.
NOTA: Ao usar menos de 9 mL da amostra de sangue total, adicione PBS consultando esta tabela (Tabela Suplementar 1). - Insira os cartuchos a serem usados em ordem de acordo com o número no suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão OK .
- O plasma e o PBMC são separados do sangue total automaticamente, o que leva aproximadamente 30 minutos. Procure a mensagem que aparece acompanhada por um som de alarme, quando a separação do plasma e do PBMC estiver completa.
- Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão STOP . Abra a porta, retire o cartucho e coloque-o sobre a mesa.
- Recupere 3 mL de plasma da saída plasmática usando uma ponta de pipeta de 1 mL. Recupere 3 mL do PBMC da saída do PBMC usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
- Carregando o cartucho FAST-auto
- Selecione o cartucho no painel de tela sensível ao toque do instrumento. Altere o número de amostras pressionando o botão de seta.
- Abra a porta e insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Para um total de quatro cartuchos, coloque o cartucho fictício no espaço vazio do suporte do cartucho.
- Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo.
- Feche a porta e pressione o botão RUN na tela do touch pad. O instrumento fecha as válvulas no cartucho, o que leva aproximadamente 30 s.
- Siga a mensagem para abrir a porta, remover a roda de suporte e remover o cartucho fechado com válvula do suporte do cartucho.
- Coloque o cartucho sobre a mesa e prepare-se para injetar a solução de PBS e a amostra de sangue total. Pipeta 6 mL de solução de PBS utilizando uma pipeta sorológica. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada PBS do cartucho e injete lentamente 6 mL da solução PBS.
- Após a injeção da solução de PBS, pipeta 3 mL de sangue total ou amostra de PBMC obtida de LBx-2 utilizando uma pipeta sorológica, que foi previamente enxaguada com 1% de BSA para evitar a aderência do resíduo. Insira a ponta da pipeta profundamente na entrada da amostra do cartucho e injete lentamente a amostra de sangue total.
- Insira os cartuchos a serem usados na ordem do número no suporte do cartucho. Use a roda de suporte para montar o cartucho e aperte a porca de bloqueio para prendê-lo. Feche a porta e pressione o botão OK .
- CTCs são enriquecidos a partir de sangue total automaticamente, o que leva aproximadamente 15 min. Procure uma mensagem que apareça acompanhada por um som de alarme quando o enriquecimento das CTCs estiver concluído. Pare o alarme abrindo a porta ou pressionando o botão STOP .
- Abra a porta, retire o cartucho e coloque-o sobre a mesa. Insira o removedor da placa traseira (BPR) nos quatro orifícios na parte frontal do cartucho. Pressione a asa azul escura com os polegares de ambas as mãos e, em seguida, pressione o corpo azul claro até que ele clique.
- Remova cuidadosamente o corpo do cartucho levantando-o. Pegue muito suavemente a membrana do filtro pela borda usando um tweezer. Certifique-se de usar a borda externa (a parte da borda de 1 mm de largura) da membrana do filtro para apertar e segurar a membrana do filtro.
- Coloque cuidadosamente a membrana filtrante (na qual as CTCs enriquecidas estão residindo) em um tubo de 1,5 mL para preparação de ácido nucleico. Se necessário, recupere o sangue filtrado para a saída de sangue usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
4. Manutenção do sistema
- Preparação para limpeza e desinfecção do instrumento
- Limpe todas as superfícies acessíveis do instrumento e dos acessórios uma vez por semana usando etanol e tecido seco, e também imediatamente quando contaminado.
- Limpe a tigela e o eixo do rotor regularmente usando álcool (etanol e isopropanol) ou desinfetantes à base de álcool.
- Limpeza e desinfecção do instrumento
NOTA: Para obter soluções gerais de problemas e outras observações sobre a máquina, consulte a Tabela Suplementar 2.- Desligue o instrumento usando o interruptor de alimentação principal. Desconecte o plugue de alimentação da fonte de alimentação.
- Abra a porta e limpe e desinfete todas as superfícies acessíveis do instrumento, incluindo o cabo de alimentação, usando um pano úmido e os agentes de limpeza recomendados.
- Verifique se há danos no eixo do rotor. Inspecione o instrumento quanto à corrosão e danos.
- Conecte o instrumento à fonte de alimentação somente se ele estiver totalmente seco por dentro e por fora.
- Desconecte o plugue de alimentação principal e remova o suporte do fusível. O suporte do fusível está localizado acima da tomada de energia. Substitua o fusível usado por um reservado do recipiente.
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Representative Results
O objetivo desta técnica é isolar de forma fácil e automática substâncias associadas ao câncer do sangue total. Em particular, qualquer um pode usar esta técnica em todos os campos adequados de pesquisa e análise. A separação simultânea e reprodutível de múltiplas substâncias em uma única amostra de sangue é significativa em biópsias líquidas. Os discos LBx-1 e LBx-2 são usados para isolar plasma e buffy coat ou PBMC do sangue total. A Figura 1 mostra os materiais separados pela aplicação deste dispositivo. Primeiro, o plasma foi obtido a partir de 10 mL de sangue usando LBx-1 ou os PBMCs foram obtidos usando LBx-2. Em segundo lugar, 3 mL do buffy coat separado foram reinjetados com PBS no FAST-auto, e as CTCs foram filtradas através da membrana. Em terceiro lugar, a membrana foi transferida para um tubo preenchido com tampão de armazenamento ou imediatamente usado para coloração. Para outras aplicações ou armazenamento a longo prazo, as CTCs podem ser facilmente removidas da membrana por vórtice.
O cfDNA foi extraído do plasma usando isolamento de DNA magnético baseado em contas capaz de capturar tamanho a tamanho do DNA por concentração de grânulos. A concentração e a pureza do cfDNA foram medidas utilizando o Bioanalisador. É sabido que a concentração de cfDNA, incluindo ctDNA, varia de acordo com o tipo e estágio do câncer18. Além disso, a maioria dos cfDNA tem um comprimento de 166 pb, e alguns são cerca de duas ou três vezes mais longos. Embora haja diferença na quantidade obtida de cada amostra individual, como 8,47 ng/mL e 5,2 ng/mL, os resultados da extração do cfDNA foram bons tanto para a concentração quanto para a distribuição de tamanho em todos os casos (Figura 2). Estes resultados indicam que o método LBx-1 separa com precisão o plasma contendo cfDNA.
No FAST-auto, a membrana foi removida e corada com anticorpos fluorescentes para a detecção de CTCs e leucócitos (leucócitos). A membrana corada colocada em lâminas de vidro foi observada em microscópio de fluorescência. Coloração e estudos microscópicos foram realizados após estudo prévio19. Somente CTCs podem ser especificamente distinguidas usando os anticorpos EpCAM/Citoqueratina (marcador CTC positivo) e CD45 (marcador positivo para leucócitos). Cada membrana capturou um total de 310 e 998 células, respectivamente. Dentre elas, um total de 3 e 43 CTCs foram contadas nas amostras 1 e 2, respectivamente (Figura 3). O método utilizado neste estudo facilita a determinação da presença e do número de CTCs. Além disso, mudanças na concentração de cfDNA e no número de CTC podem ser usadas para monitorar facilmente a presença e a recorrência de câncer no campo. Em particular, uma vez que estes métodos não utilizam outros reagentes que possam afectar os resultados, são possíveis experiências a jusante com o material obtido.
Figura 1: Fluxo de trabalho do método de mistura de discos para separação simultânea de substâncias do sangue total . (A) O plasma contendo cfDNA é obtido. (B) As CTCs são removidas da pelagem bufante. (C,D) Após o vórtice, as CTCs são separadas da membrana, e uma pequena quantidade de CTC ainda permanece na membrana. Tanto as células obtidas quanto a membrana podem ser submetidas a armazenamento a longo prazo por congelamento de amostras no tampão de armazenamento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Pureza e quantidade de cfDNA extraído. Os cfDNAs extraídos foram avaliados por meio do Bioanalyzer, e fitas de tela de cfDNA foram utilizadas em conjunto com uma escada eletrônica. A linha verde foi utilizada para o alinhamento entre a escada (esquerda) e a amostra (direita). As marcas triangulares indicam a banda de DNA. A maior parte do cfDNA é de 166 pb, e alguns existem em múltiplos inteiros de comprimento. Normalmente, a concentração de cfDNA mede até o tamanho de 50 pb a 700 pb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Contagem das CTCs utilizando coloração por membrana. Após a coloração imunocitoquímica da membrana, as células apresentam sinais DAPI (Nuclear positivo) em azul, enquanto EpCAM/CK (CTCs positivas) e CD45 (WBC positivo) são destacadas em verde e vermelho, respectivamente. Os sinais de fluorescência foram medidos usando um microscópio de fluorescência. A barra de escala indica 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quadro suplementar 1: Composição do volume final para utilização da solução de gradiente de densidade. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar 2: Questões gerais e precauções para manutenção. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A quantidade e a concentração de cfDNA e CTC dependem do indivíduo, estágio e tipo de câncer. Depende também da condição do paciente 2,4,5,10,20. Em particular, nos estágios iniciais ou pré-cancerosos do câncer, as concentrações de substâncias relacionadas ao câncer são muito baixas, por isso há uma grande possibilidade de que não possa ser detectado. No entanto, a detecção precoce tem um efeito muito positivo na sobrevida do paciente e no estabelecimento da estratégia de tratamento. Como o cfDNA e o CTC têm meia-vida curta no sangue, eles refletem informações em tempo real sobre o câncer 21,22,23,24,25. Portanto, para adquirir simultaneamente várias substâncias relacionadas ao câncer, uma grande quantidade de sangue é necessária sob as mesmas condições. O sistema mostrado aqui fornece aos usuários um método simples. O usuário pode selecionar e usar o disco correspondente ao material necessário do sangue total. Usando um dos cartuchos fornecidos, o plasma contendo cfDNA pode ser obtido, e as CTCs podem ser coletadas da mesma amostra de sangue, pelo buffy rejeito ou PBMC por reinjeção em um disco FAST-auto (Figura 1).
A captura CTC baseada em tamanho é simples, mas tem limitações de pureza. Existem muitas formas e tamanhos diferentes de células no sangue26. Os leucócitos variam em tamanho de 8 a 16 μm27. Em outro estudo, o tamanho médio do leucococo medido foi de 9 μm. Por outro lado, o tamanho mínimo das CTCs isoladas é de 16 μm, e o tamanho médio é de 30 μm28. Além disso, as CTCs estão presentes em uma quantidade muito pequena no sangue do paciente em comparação com outras células sanguíneas. Minimizar a contaminação por leucócitos é importante para análises a jusante. Embora a detecção baseada em anticorpos possa capturar CTCs, a análise de alta resolução, como a NGS, requer técnicas adicionais de coleta de célula única ou um alto nível de análise de bioinformática.
Recentemente, métodos de observação intuitiva da presença de CTCs antes da análise de alta resolução utilizando diversas técnicas de captura têm sido implementados29. Como mostrado nos resultados, a membrana adquirida do cartucho FAST-auto pode ser corada diretamente para detecção de CTC. As CTCs capturadas também podem ser facilmente ressuspensas da membrana por vórtice para armazenamento ou outras aplicações, como cultura de células (Figura 1).
Este método utiliza os princípios da centrifugação e da microfluídica. Portanto, o equilíbrio do equipamento e do disco é importante, e também é importante prendê-lo com o suporte do disco. É importante preencher qualquer volume total insuficiente inicial com PBS. Se a quantidade inicial for insuficiente, pode haver um problema que leve a dificuldades em se mover para o próximo espaço. Leve o suporte do disco para fora em uma mesa para evitar a contaminação do equipamento e para mover os líquidos para dentro e para fora do disco. No caso do disco FAST-auto, processe as amostras rapidamente para reduzir os danos ao CTC na membrana. Em particular, tenha cuidado para evitar a contaminação ao manusear a membrana e seguir o protocolo estabelecido para armazenamento a longo prazo.
No entanto, este método é fácil de usar e pode processar de uma a quatro amostras simultaneamente. Além disso, vários substratos de líquido podem ser obtidos simplesmente substituindo o disco. Além disso, não são necessários reagentes adicionais além do uso de uma solução de gradiente de densidade para obter PBMCs. Portanto, o material obtido é bom para uso a jusante.
Este método ainda tem algumas limitações. O usuário não pode modificar o disco arbitrariamente, e diferentes tipos de discos não podem ser usados ao mesmo tempo. Além disso, existem limites para o volume máximo, portanto, vários discos devem ser usados para grandes volumes de sangue. Métodos adicionais ainda são necessários para obter o cfDNA. Usando a membrana, é difícil obter apenas CTCs usando o método de captura do tamanho de poros. Portanto, a seleção ou classificação de células é necessária para experimentos de aplicação específicos do CTC.
Existem vários fluidos no corpo, e a produção de certos fluidos corporais está associada à doença30. Atualmente, o uso do fluido corporal do sangue só foi realizado para análise. No futuro, um protocolo ideal pode ser estabelecido confirmando o desempenho em vários fluidos corporais, como urina, ascite, líquido pleural e líquido espinhal. Para fornecer um método mais conveniente para os usuários, dispositivos que extraem automaticamente o cfDNA do disco estão sendo desenvolvidos. Além disso, equipamentos capazes de realizar PCR quantitativa diretamente dentro do disco após a extração estão em desenvolvimento.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse relacionados a este trabalho.
Acknowledgments
Este manuscrito foi apoiado em parte pelo Fundo de Desenvolvimento de Dispositivos Médicos da Coreia (KMDF, Grant No. RS-2020-KD000019) e pelo Korea Health Industry Development Institute (KHIDI, Grant No. HI19C0521020020).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 15 mL Conical Tube | SPL | 50015 | |
| 4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Cell-free DNA Screen Tape (Agilent, 5067-5630), Cell-free DNA Sample Buffer (Agilent, 5067-5633) |
| Apostle MiniMax High Efficiency Cell-Free DNA Isolation Kit | Apostle | A17622-250 | 5 mL X 50 preps version |
| BD Vacutainer blood collection tubes | BD | 367525 | EDTA Blood Collection Tube (10 mL) |
| BioViewCCBS | Clinomics | BioView Clinomics-Customized Bioview System. Allegro Plus microscope-based customization equipment | |
| CD45 Monoclonal Antibody (HI30), PE-Alexa Fluor 610 | Invitrogen | MHCD4522 | |
| FAST Auto cartridge | Clinomics | CLX-M3001 | |
| LBx-1 cartridge | Clinomics | CLX-M4101 | |
| LBx-2 cartridge | Clinomics | CLX-M4201 | |
| OPR-2000 instrument | Clinomics | CLX-I2001 | |
| Cover Glass | Marienfeld Superior | HSU-0101040 | |
| DynaMag 2 Magnet Stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Ficoll Paque Solution | GE healthcare | 17-1440-03 | density gradient solution |
| Filter Tip, 10 µL | Axygen | AX-TF-10 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 200 µL | Axygen | AX-TF-200 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 100 µL | Axygen | AX-TF-100 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| Filter Tip, 1000 µL | Axygen | AX-TF-1000 | Pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross contamination. |
| FITC anti-human CD326 (EpCAM) Antibody | BioLegend | 324204 | |
| FITC Mouse Anti-Human Cytokeratin | BD Biosciences | 347653 | |
| Formaldehyde solution (35 wt. % in H2O) | Sigma Aldrich | 433284 | |
| Kimtech Science Wipers | Yuhan-Kimberly | 41117 | |
| Latex glove | Microflex | 63-754 | |
| Magnetic Bead Separation Rack | V&P Scientific | VP 772F2M-2 | |
| Manual Pipetting (0.5-10 µL) | Eppendorf | 3120000020 | |
| Manual Pipetting (2-20 µL) | Eppendorf | 3120000038 | |
| Manual Pipetting (10-100 µL) | Eppendorf | 3120000046 | |
| Manual Pipetting (20-200 µL) | Eppendorf | 3120000054 | |
| Manual Pipetting (100-1000 µL) | Eppendorf | 3120000062 | |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | abcam | ab104139 | |
| Normal Human IgG Control | R&D Systems | 1-001-A | |
| OLYMPUS BX-UCB | Olympus | 9217316 | |
| Pan Cytokeratin Monoclonal Antibody (AE1/AE3), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | 53-9003-82 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline Solution) | Corning | 21-040CVC | |
| Portable Pipet Aid | Drummond | 4-000-201 | |
| Slide Glass | Marienfeld Superior | HSU-1000612 | |
| StainTray Staining box | Simport | M920 | |
| Sterile Serological Pipette (10 mL) | SPL | 91010 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | 93443 | |
| TWEEN 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Whole Blood | Stored at 4-8 °C by collecting in EDTA or cfDNA stable tube : If the whole blood is insufficient in 9 mL, add PBS (phosphate buffered saline) as much as necessary. | ||
| X-Cite 120Q (Fluorescence Lamp Illuminator) | Excelitas | 010-00157 |
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