Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Contactovergevoeligheid als een muizenmodel van allergische contactdermatitis

Published: September 26, 2022 doi: 10.3791/64329
Automatic Translation
1, 2, 1, 3
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

ERRATUM NOTICE

Summary

Contactovergevoeligheid (CHS) is een muizenexperimenteel model van allergische contactdermatitis (ACD). CHS is gebaseerd op sensibilisatie met reactieve hapten door de geschoren huid van de borst en buik te schilderen, met een daaropvolgende oorhuiduitdaging met een verdunde hapten, waardoor een zwellingsreactie ontstaat die op verschillende manieren wordt beoordeeld.

Abstract

Contactovergevoeligheid (CHS) is een experimenteel model van allergische contactdermatitis (ACD) dat kan worden bestudeerd bij muizen. Deze studie heeft tot doel een objectieve laboratoriummethode te presenteren die kan helpen bij het bestuderen van de CHS-reactie bij muizen, die kan worden gemeten en gekwantificeerd door verschillende tests. Om CHS te induceren, werden muizen op dag "0" op een eerder geschoren plek gesensibiliseerd door buikhuid te schilderen met het hapten 2,4,6-trinitrochlorobenzeen (TNCB) in een aceton-ethanolmengsel, terwijl negatieve controlemuizen werden gesensibiliseerd met een voertuig-aceton-ethanolmengsel. Op dag "4" werd de oordikte gemeten met een micrometer voorafgaand aan de elicitatie van CHS (challenge) door beide oren te schilderen met verdunde TNCB zowel in de test- als in de controlegroep. Na 24 uur werd de oorzwelling gemeten met een micrometer. CHS is een voorbeeld van een T-cel-gemedieerde immuunrespons die zwelling veroorzaakt in ontstoken weefsel, met een piek van 24 uur na de huiduitdaging met dezelfde hapten. Een toename van ooroedeem gecorreleerd met verhoogd oorgewicht, myeloperoxidase (MPO) activiteit, pro-inflammatoire cytokineconcentratie in de oorextracten, verhoogde verdikking van de oedemateuze dermis in het histologisch onderzoek en oor vasculaire permeabiliteit. Er was ook een toename van de concentratie van TNP-specifieke IgG1-antilichamen in de sera van de testgroep in vergelijking met de controlemuizen. Bovendien kan CHS met succes worden overgedragen met de CHS-effectorcellen die zijn verkregen van donoren die eerder zijn gesensibiliseerd met TNCB. De CHS-effectorcellen werden intraveneus toegediend aan naïeve ontvangende muizen, die vervolgens werden uitgedaagd met dezelfde verdunde hapten. Oorzwelling werd 24 uur later gemeten met een micrometer.

Introduction

Allergische contactdermatitis (ACD) is een veel voorkomende huidontstekingsziekte in geïndustrialiseerde landen veroorzaakt door een type IV overgevoeligheidsreactie als gevolg van blootstelling aan chemicaliën met een laag molecuulgewicht die haptens worden genoemd. De stoffen die contactsensibilisatie bij de mens veroorzaken, zijn onder meer zware metaalionen (chroom, nikkel, ijzer, kobalt), terpentijn, geurstoffen, kleurstoffen en conserveermiddelen die aanwezig zijn in cosmetica (bijv. p-fenyleendiamine), sommige geneesmiddelen (bijv. neomycine, benzocaïne), β-lactamantibiotica (d.w.z. penicilline), chemicaliën geproduceerd door planten (pentadecacatechol, een stof die aanwezig is in poison ivy), evenals hydrochinon die wordt gebruikt in de fotografische industrie 1,2 . ACD-etiologische middelen zijn erg hoog, omdat alleen al in de industrie meer dan 100.000 chemicaliën worden gebruikt en elk jaar 2.000 nieuwe worden gesynthetiseerd. Tot op heden zijn meer dan 3.700 moleculen geïdentificeerd die contact haptens/allergenen kunnen zijn3. De contactovergevoeligheidsreactie (CHS) is een experimenteel model van ACD dat kan worden bestudeerd bij muizen, cavia's en ratten en kan worden geïnduceerd door de plaatselijke huidtoepassing van reactieve chemische haptens opgelost in organische oplosmiddelen 4,5,6. Deze studie heeft tot doel een objectieve laboratoriummethode te beschrijven die kan helpen bij het bestuderen van de CHS-reactie bij muizen, die kan worden gemeten en gekwantificeerd door verschillende tests.

Het CHS bestaat uit sensibilisatie (inductie) en effector (challenge) fasen. In diermodellen binden haptens eerst covalent aan eiwitten in het lichaam om neoantigenen te creëren. Tijdens de sensibilisatiefase bevorderen geactiveerde keratinocyten de migratie en rijping van huiddendritische cellen (sDC's) door pro-inflammatoire cytokines-tumornecrosefactor α (TNF-α) en interleukine 1β (IL-1β)7 te produceren. Epidermale Langerhans-cellen (LC's) presenteren antigenen tijdens de CHS-inductie- en effectorfasen8. LCs blootgesteld aan hapten tijdens sensibilisatie bevorderen de inductie van zowel regulerende als effectorcellen9. Toenemend bewijs uit verschillende studies suggereert dat CHS-responsen kunnen worden gemedieerd door CD4 + MHC klasse II-beperkte Th1-cellen, waarbij lokaal interferon-γ (IFN-γ) vrijkomen om een karakteristiek ontstekingsinfiltraat te gebruiken, CD8 + MHC klasse I-beperkte Tc1-lymfocyten die ook IFN-γ kunnen afgeven, maar meestal cytotoxische schade aan keratinocyten kunnen bemiddelen, en nu ook interleukine 17 (IL-17) -producerende Th17-cellen10, 11.

Er zijn verschillende CHS-modellen ontwikkeld met verschillende soorten1 2,13,14 en haptens (een gedetailleerde vergelijking van verschillende haptens, oplosmiddelen en toedieningstijd is samengevat in tabel 1). De muis, een veelgebruikte laboratoriumsoort, biedt een paar voordelen bij het bestuderen van CHS. Er zijn meer stammen, knock-outs (KO) en transgene dieren onder muizen in vergelijking met andere soorten, waardoor ze een zeer aantrekkelijk dierzijn 15. Bovendien vereist het CHS-model veel dieren en zijn muizen hier zuiniger. Diermodellen bootsen ACD niet in alle opzichten na; in het bijzonder vertonen ze korstvorming en desquamatie, wat niet gebruikelijk is voor mensen 16,17. De kenmerken van chronische ziekten zijn een uitdaging om te reproduceren, vooral omdat het beschreven model niet uitgaat van de toepassing van de hapten voor een lange periode van tijd. Hier is echter bevestigd dat veel van de belangrijke aspecten van ACD worden gereproduceerd. Het is ook aangetoond dat, net als bij mensen, deze kenmerken geassocieerd zijn met lokale allergische reacties. De keuze van hapten, het oplosmiddel en de toepassing ervan die in dit protocol wordt beschreven, werden bepaald door het feit dat de resultaten zijn bevestigd door talrijke in vitro tests en dat het vele jaren in het laboratorium is getest en gewijzigd totdat de huidige versie werd vastgesteld. Muizenmodellen maken de analyse mogelijk van de celsubsets of cytokines die betrokken zijn bij de ontwikkeling van ACD en zijn essentieel voor preklinische beoordelingen van nieuwe behandelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle experimenten die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn uitgevoerd volgens de richtlijnen van de 1e lokale ethische commissie voor dierproeven in Krakau. Alle beschreven procedures werden uitgevoerd volgens de lokale aanbevelingen, vooral met betrekking tot het gebruik van ketamine / xylazine als verdovingsmiddel, het gebruik van beide zijden van de oren om de stof / hapten aan te brengen, het oor af te snijden en bloed te verzamelen door oogbolverwijdering. BALB/c (haplotype H-2d), CBA/J (H-2k) en C57BL/6 (H-2b) mannelijke en vrouwelijke muizen, 6-12 weken oud, werden gebruikt voor dit onderzoek (zie Materiaaltabel). Voor statistische significantie is het het beste als elke groep muizen uit 10-12 dieren bestaat.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Reinig de operatietafel met een 70% ethanoloplossing voor en na alle procedures. Als u muizen gebruikt die steriele omstandigheden vereisen, voert u alle bewerkingen uit in een bioveiligheidskast.

2. Muizen markeren voor identificatie

  1. Label de muizen door de huid te scheren met een scheermesje: #0 - ongemarkeerd, #2 - op de rechtervoorpoot, #3 - aan de rechterkant, #4 - aan de rechter achterpoot, #5 - aan de basis van de staart, #6 - aan de linker achterpoot, #7 - aan de linkerkant, #8 - aan de linkervoorpoot.
    OPMERKING: Vanwege de geïnduceerde reactie kunnen muizen niet klassiek worden gemarkeerd door oorstoten of tagging. De muizen werden niet verdoofd tijdens het etiketteren.

3. Inductie van CHS

OPMERKING: Deze procedure is weergegeven in figuur 1.

  1. Voer de sensibilisatie (inductie) uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Scheer op dag "0" muizen op de borst en buik (vierkant 2 cm x 2 cm) door grijze zeep met water aan te brengen en te scheren met een scheermesje.
      LET OP: Wacht voor het aanbrengen van hapten 6 uur zodat de huid niet geïrriteerd raakt.
    2. Bereid 5% hapten: 2,4,6-trinitrochlorobenzeen (TNCB, zie Materiaaltabel) in een aceton-ethanolmengsel (verhouding 1:3) of alleen in een voertuig (aceton-ethanol). Bereid oplossingen vlak voor gebruik in een glazen injectieflacon en bescherm deze tegen licht door de injectieflacon te bedekken met aluminiumfolie.
    3. Sensibiliseer de muizen op dezelfde dag door 150 μL van 5% hapten aan te brengen op de eerder geschoren plek. In de groep controlemuizen past u alleen het medium toe om de niet-specifieke ontstekingsreactie te beoordelen. Voordat u het dier terug in de kooi plaatst, wacht u 30 s en laat u de hapten drogen.
      LET OP: Gebruik handschoenen; TNCB veroorzaakt bij de meeste mensen een ernstige allergische reactie.
  2. Voer elicitatie (challenge) en oorzwelling uit.
    1. Bereid op dag "4" 0,4% hapten: TNCB in een aceton-ethanolmengsel (verhouding 1:1). Bereid de oplossing vlak voor gebruik in een glazen injectieflacon en bescherm deze tegen licht door de injectieflacon te bedekken met aluminiumfolie.
    2. Verdoof de muizen met een intraperitoneale (i.p.) injectie van een mengsel van ketamine (90-120 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg) (zie Materiaaltabel) voor diepe anesthesie. Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd is gedurende ten minste 5 minuten door teen te knijpen.
    3. Meet de oordikte (0 uur meting, baseline) met een micrometer (zie Materiaaltabel) door een waarnemer die niet op de hoogte is van de experimentele groepen.
    4. Breng 10 μL van 0,4% hapten aan beide zijden van de oren aan in beide groepen (test en controle). Voordat u het dier terug in de kooi plaatst, wacht u 30 s en laat u de hapten drogen.
    5. Herhaal op dag "5", 24 uur na het aanbrengen van hapten, stap 3.2.2-3.2.3 voor de meting van 24 uur.
    6. Evalueer de CHS-respons door het verschil in oorschelpdikte voor en na de challenge te berekenen met de hapten: 24 h oordikte (μm) - 0 h oordikte (μm). Tel elk oor als een afzonderlijke meting. Druk vervolgens de oorzwelling uit in micrometers (μm) ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) (tabel 2, figuur 3).

4. Oorbiopten

  1. Direct na de 24 uur meting van de oordikte (wanneer de muis nog onder diepe anesthesie is), knipt u de oren zo dicht mogelijk bij de schedel af met een schaar. Verzamel de biopsieën van de distale kant van de oren door een pons met een diameter van 6 mm te maken met behulp van een biopsiepunch (zie Materiaaltabel).
    1. Meet het oorgewicht (stap 4.2) en voer daarnaast een van de volgende tests uit op dezelfde oorbiopsie: myeloperoxidase (MPO) assay (stap 4.3) of in vitro meting van cytokineconcentratie in de oorextracten (bijv. IFN-γ, IL-17A, TNF-α [stap 4.4]).
      OPMERKING: Snijd de oren voordat het bloed wordt afgenomen. Na deze procedure moeten de muizen worden geëuthanaseerd (bijvoorbeeld door cervicale dislocatie).
  2. Meet het gewicht van elke oorbiopsie op de analytische balans en druk deze uit in milligrammen (mg) (figuur 4).
  3. Voer een MPO-test uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Bereid homogenisatiebuffer voor door 0,5% hexadecyltrimethylammoniumbromide op te lossen in 50 mmolfosforaatbuffer KH2PO4/Na2HPO4 en de pH aan te passen op 6,0 (gebruik bij kamertemperatuur, RT).
    2. Homogeniseer de biopten in 2 ml microcentrifugebuizen met 500 μL bereide buffer gedurende 10 minuten met behulp van een homogenisator met roestvrijstalen kralen met een diameter van 5 mm (voeg twee kralen / injectieflacon toe) (zie materiaaltabel). Laat het monster vervolgens 15 minuten afkoelen bij 4 °C en homogeniseer het nog eens 10 minuten.
      OPMERKING: Microcentrifugebuizen hebben een ronde bodem, zodat de kralen gemakkelijk kunnen bewegen.
    3. Vries de homogenaten gedurende 30 minuten in bij −20 °C. Ontdooien en vortex (zorg ervoor dat de monsters worden ontdooid). Herhaal deze procedure 3x.
    4. Centrifugeer de homogenaten bij 3.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C. Oogst de supernatanten met een pipet. Druk de MPO-activiteit uit in eenheden (U) per 1 mg eiwit.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters zijn stabiel bij −20 °C gedurende 3 maanden.
    5. Om de MPO-activiteit te meten, voert u een enzymatische reactie uit door 20 μL supernatant en 200 μL MPO-substraat (0,167 mg/ml orthodianisinedihydrochloride te mengen in 50 mmol KH2PO4/Na2HPO4-buffer met 5 x 10−4% H202) en toe te voegen aan 96-well platte bodemplaten. Incubeer de platen gedurende 20 minuten bij RT.
    6. Bereid de standaardcurve voor met behulp van 20 μL van de MPO-standaard bij concentraties van 0,008 U tot 0,5 U in 200 μL van het MPO-substraat. Bereid het lege monster voor met alleen het MPO-substraat.
      LET OP: Gebruik een masker tijdens het werken met ortho-dianisine dihydrochloride.
      OPMERKING: De platen moeten gemaakt zijn van polypropyleen, dat een lager bindingsvermogen heeft, zodat eiwitten of DNA niet binden.
    7. Meet de optische dichtheid (OD) bij een golflengte van λ = 460 nm. De enzymatische reactie is stabiel gedurende 10 minuten. Lees de MPO-activiteit in geteste monsters van de standaardcurve.
    8. Om de eiwitconcentratie te meten, gebruikt u 20 μL van het supernatant, voert u een test uit met een bicinchonininezuurkit voor eiwitbepaling (zie tabel met materialen) en meet u de OD bij λ = 562 nm (figuur 5).
  4. Voer in vitro metingen uit van cytokines in het oorextract.
    1. Homogeniseer de oorbiopten bij RT in 2 ml microcentrifugebuizen met 500 μL weefseleiwitextractiereagens (T-PER) gedurende 10 minuten met behulp van een homogenisator met roestvrijstalen kralen met een diameter van 5 mm (voeg twee kralen / injectieflacon toe). Laat het monster vervolgens 15 minuten afkoelen bij 4 °C en homogeniseer het nog eens 10 minuten.
      OPMERKING: Microcentrifugebuizen hebben een ronde bodem, zodat de kralen gemakkelijk kunnen bewegen.
    2. Centrifugeer de homogenaten bij 3.000 x g gedurende 30 min bij 4 °C.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. De monsters zijn stabiel bij −80 °C gedurende 6 maanden.
    3. Beoordeel de cytokineniveaus met behulp van een in de handel verkrijgbare ELISA-set (bijv. IFN-γ) (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant (figuur 6).

5. Histologie van oorweefsel

  1. Direct na de 24 uur meting van de oordikte, wanneer de muis nog diep verdoofd is, snijdt u de oren zo dicht mogelijk bij de schedel af met de schaar (stap 4.1).
    OPMERKING: Na deze procedure moeten de muizen worden geëuthanaseerd (bijvoorbeeld door cervicale dislocatie).
  2. Voer paraffine-inbedding van de weefselblokken uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Plaats direct na verwijdering het oor in ~ 10 ml 10% formaline gedurende 24 uur.
    2. Plaats de oren in een weefselverwerkingscassette. Plaats de cassettes in een geautomatiseerde processor (zie materiaaltabel) voor dehydratiecycli (alcohol 70%, 90%, 100%, 30 min elk bij RT), clearingcycli (xyleen 3x, 30 min elk bij RT) en wasinfiltratiecycli (paraffine 3x, 30 min elk bij 56 °C).
    3. Verwijder de cassettes uit de geautomatiseerde processor en houd de opwarmplaat vast totdat deze nodig is. Vul de wasvorm met warme was (uit de dispenser).
    4. Verwijder de secties van de cassette met een verwarmde tang en plaats ze in de mal; plaats vervolgens de cassettebasis op de bovenkant van de mal en vul deze vervolgens met meer was. Plaats het in gekoeld water op een koude plaat gedurende 30 minuten, zodat de paraffine stolt tot een blok met het monster.
    5. Gebruik een roterende microtoom (zie Tabel met materialen) om secties van ~ 5 μm dik te snijden. Drijf de secties in een warm bad om ze plat te maken. Pak de secties op een glazen microscoopglaasje. Laat ze drogen bij RT om ervoor te zorgen dat de secties aan de glijbaan hechten.
      OPMERKING: Gebruik dia's die de noodzaak om kleefmaterialen of eiwitcoatings aan te brengen elimineren om het verlies van weefselsecties tijdens het kleuren te voorkomen.
  3. Voer hematoxyline en eosine (H &E) kleuring uit.
    1. Bereid 17 kleuringsschalen met het volgende: xyleen (vier gerechten), 100% ethanol (absolute alcohol) (vier gerechten), 90% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol, 50% ethanol, PBS (drie gerechten), hematoxyline-oplossing, eosine-oplossing. Breng de dia's over van de ene schotel naar de volgende volgens de onderstaande stappen en voer ze allemaal uit bij RT.
      OPMERKING: De procedure in elk gerecht kan ongeveer 10x worden herhaald (bijvoorbeeld als een schaal met 20 dia's wordt gebruikt, kunnen 200 vlekken worden gemaakt zonder de vloeistoffen te veranderen).
    2. Deparaffineer de secties door incubatie bij 65 °C gedurende 30 minuten in de incubator. Dompel de dia's onder in xyleen gedurende 30 minuten. Herhaal 1x in nieuw xyleen gedurende 30 min.
    3. Dompel de dia's onder in 100% ethanol gedurende 5 minuten. Herhaal 1x in nieuwe 100% ethanol gedurende 5 min. Dompel de dia's onder in de ethanolrij, 90%, 80%, 70% en 50%, gedurende 2 minuten in elke verdunning.
    4. Dompel de dia's gedurende 5 minuten onder in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Veeg overtollige vloeistof weg van rond het weefsel en de achterkant van de dia's.
    5. Bevlek de secties in hematoxyline-oplossing (zie materiaaltabel) gedurende 7-8 minuten. Was gedurende 30 s in stromend water vanaf de achterkant om de secties niet te beschadigen. Herhaal stap 5.3.4.
    6. Beits de secties met eosine-oplossing (zie Materiaaltabel) gedurende 30 s. Wassen zoals vermeld in stap 5.3.5 en herhaal stap 5.3.4.
    7. Dompel de dia's onder in 100% ethanol (absolute alcohol) gedurende 2 minuten. Herhaal 1x in nieuwe 100% ethanol gedurende 2 min.
    8. Dompel de dia's onder in xyleen gedurende 5 minuten. Herhaal 1x in nieuw xyleen gedurende 5 min.
    9. Laat de secties 15 minuten aan de lucht drogen bij RT. Voeg een druppel montagemedium (zie Materiaaltabel) toe aan een coverslip en plaats deze vervolgens bovenaan de sectie.
  4. Bekijk het gedeelte onder een lichtmicroscoop onder een vergroting van 20x of 40x en leg beelden vast (figuur 7).

6. Vasculaire permeabiliteitstest

OPMERKING: Als alternatief voor het meten van de oordikte kan een vasculaire permeabiliteitstest worden uitgevoerd.

  1. Sensibiliseer muizen op dag "0" (stappen 3.1.1-3.1.3) en vervolgens, op dag "4", verdoof de muizen (stap 3.2.2) en breng direct hapten aan op de oren (stap 3.2.4), waarbij de 0 uur oormeting wordt weggelaten.
  2. Verdoof de muizen 23 uur na de challenge (stap 3.2.2).
  3. Injecteer intraveneus (i.v.) 8,3 μL/g lichaamsgewicht van 1% Evans blauwe kleurstof (zie Tabel van materialen) in Dulbecco′s Fosfaat-Gebufferde Zoutoplossing (DPBS).
  4. Verdoof de muizen opnieuw - diepe anesthesie (stap 3.2.2) - 1 uur na Evans blauwe injectie.
  5. Verzamel oorbiopten (stap 4.1).
    OPMERKING: Na deze procedure moeten de muizen worden geëuthanaseerd (bijvoorbeeld door cervicale dislocatie).
  6. Haal de kleurstof uit het weefsel, plaats oorponsen in de buisjes met 1 ml formamide en incubeer bij 37 °C in de atmosfeer van 5% CO2 gedurende 18 uur.
  7. Centrifugeer de biopten op 3.000 x g gedurende 3 min bij RT. Verzamel de supernatanten met een pipet.
  8. Meet de OD op een golflengte van λ = 565 nm in 96-well flat-bottom platen tegen een blanco die formamide bevat. De kleur is 24 uur stabiel. Lees de concentratie van de testmonsters uit de standaardcurve (gebruik de concentraties Evansblauw variërend van 0,2-30 μg kleurstof/ml formamide) (figuur 8).
    OPMERKING: De platen moeten gemaakt zijn van polypropyleen, dat een lager bindingsvermogen heeft, zodat eiwitten of DNA niet binden.

7. Serumverzameling en anti-TNP immunoglobuline (IgG1) antilichaammeting

  1. Na het verzamelen van oorbiopten (stap 4.1), wanneer de muis nog onder diepe anesthesie is, verwijdert u de oogbol met een pincet, oefent u zachte druk uit op de muis en verzamelt u bloed uit de retro-orbitale sinus in de buis (injectieflacon met gel voor het verkrijgen van serum, zie Materiaaltabel). Een alternatieve methode om bloed te verzamelen kan zijn om het hart te doorboren met een spuit en het bloed te verzamelen.
    OPMERKING: Het bloed moet worden verzameld na het verwijderen van de oren. Dezelfde bloedingsmethode moet in een heel onderzoek worden gebruikt vanwege mogelijke verschillen in bloedparameters18. Na deze procedure moeten muizen worden geëuthanaseerd (bijvoorbeeld door cervicale dislocatie).
  2. Keer minimaal 6x om, wacht 30 minuten tot het bloed stolt en centrifugeer vervolgens op 1.300-2.000 x g gedurende 10 minuten bij RT.
    OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Het monster is stabiel bij −20 °C gedurende 6 maanden.
  3. Bekleed een 96-well flat-bottom plaat met 50 μL runderserumalbumine geconjugeerd met 2,4,6-trinitrofenyl (TNP-BSA) opgelost in DPBS bij overleg van 10 μg/ml. Bedek vervolgens de tweede plaat met runderserumalbumine (BSA) alleen opgelost in DPBS (achtergrond) in een concentratie van 10 μg / ml. Incubeer een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Muizenserum bevat antilichamen (Abs) tegen BSA, dus de monsters moeten op beide platen worden getest en vervolgens moet een berekening worden uitgevoerd (OD TNP-BSA - OD BSA).
  4. Was de platen met 300 μL DPBS met 0,05% Tween 20. Herhaal 3x.
  5. Bereid assay diluent (AD): DPBS met 1% BSA. Blokkeer de putten met AD gedurende 1 uur bij RT. Opnieuw wassen (stap 7.4).
  6. Bereid een interne standaard (iSTD) voor: sensibiliseer de muizen met TNCB (stappen 3.1.1-3.1.3) en verzamel en peil het serum 10 dagen na de sensibilisatie bij alle donoren (stap 7.1 en stap 7.2).
  7. Voeg aan de plaat 50 μL van gegradeerde concentraties iSTD verdund met AD toe voor het maken van de standaardcurve (beschreven in tabel 3). Voeg aan de plaat 50 μL serummonsters toe. Test elk monster en elke standaardcurve op beide platen (TNP-BSA en BSA gecoat). Incubeer gedurende 2 uur bij RT. Was de platen (stap 7.4).
  8. Voeg 50 μL gebiotinyleerd antimuis IgG1 monoklonaal antilichaam (mAb, zie Materiaaltabel) verdund 1:250 met AD toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT. Opnieuw wassen (stap 7.4).
  9. Voeg 50 μL mierikswortelperoxidase streptavidin (HRD streptavidin, zie Materiaaltabel) verdund 1:2000 met AD toe en incubeer gedurende 30 minuten bij RT in het donker. Was de plaat (stap 7.4).
  10. Voeg 50 μL TMB-substraat toe (zie Materiaaltabel) en incubeer gedurende 30 minuten op RT in het donker.
  11. Stop de enzymatische reactie door toevoeging van 25 μL van 1 M H2SO4; de reactie is stabiel gedurende 30 minuten.
  12. Meet de OD op een golflengte van λ = 450 nm en een achtergrond van 570 nm (de achtergrond moet worden afgetrokken van elke 450 nm-meting). Trek bij het presenteren van de resultaten de BSA-metingen af van de TNP-BSA voor monsters en de standaardcurve. Bereken vervolgens de eenheid (U) van antilichamen volgens de standaardcurve (figuur 9).

8. Adoptieve overdracht van de CHS-effectorcellen

OPMERKING: Deze procedure is weergegeven in figuur 2.

  1. Donoren (in de verhouding van één donor:1 ontvanger): sensibiliseer muizen met TNCB op dag "0" (stappen 3.1.1-3.1.3).
  2. Verdoof op dag "4" de muizendiepe anesthesie (stap 3.2.2).
  3. Isoleer met een tang de oksel- en inguinale lymfeklieren (LAN's) en milt (SPL's). Bundel de LAN's in de ene injectieflacon en de SPL's in een andere.
    OPMERKING: Er is één oksellymfeklier achter de borstspier in elke oksel. Eén inguinale lymfeklier in het heupgebied bevindt zich naast drie bloedvaten. De milt bevindt zich aan de linkerkant van het lichaam achter de darm en maag19. Werk met steriele gereedschappen in een bioveiligheidskast om steriele omstandigheden te behouden. Na deze procedure moeten de muizen worden geëuthanaseerd (bijvoorbeeld door cervicale dislocatie).
  4. Pureer weefsel tussen de matte uiteinden van twee microscoopglaasjes. Laat de celsuspensie door een celzeef met een poriegrootte van 70 μm gaan (zie Materiaaltabel).
  5. Was de cellen met DPBS aangevuld met 1% foetaal runderserum (FBS). Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Decanteer het supernatant en resuspendeer de resterende celpellet in 1-5,0 ml DPBS.
  6. Tel de levende cellen met behulp van een hemocytometer20 met Trypan blue en meng 10 μL van de celsuspensie met 90-990 μL (afhankelijk van het celnummer) trypanblauw. Houd rekening met de verdunning bij het berekenen van het celgetal (10x-100x).
  7. Bereid een mengsel van LAN's en SPL's (verhouding 1:1): 8,0 x 106 tot 7,0 x 107/muis in 200 μL DPBS.
  8. Ontvangers (naïeve syngene muizen): verdoof naïeve ontvangende muizen (stap 3.2.2) en injecteer i.v. met een voorbereid mengsel van de CHS-effectorcellen (stap 8.7). Injecteer in de controlegroep van muizen geen cellen.
  9. Meet de oordikte vóór (0 h) en na (24 h) de challenge (stappen 3.2.1-3.2.6) (figuur 10).
  10. Voer daarnaast tests uit op geïsoleerde CHS-effectorcellen (bijv. celfenotypering of de meting van geproduceerde cytokines door de CHS-effectorcellen door flowcytometrie). Celculturen kunnen ook worden vastgesteld en het vermogen van de CHS-effectorcellen om zich te vermenigvuldigen in aanwezigheid van het antigeen of de hoeveelheid uitgescheiden cytokines in de kweeksupernatanten kan worden beoordeeld21,22 (gegevens niet gepresenteerd).
    OPMERKING: Het uitvoeren van aanvullende tests vereist dienovereenkomstig meer celdonoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor CHS-inductie werden de dieren gesensibiliseerd via huidverf (buik) met 150 μL van 5% TNCB of schijnsensibiliseerd met het voertuig alleen. Op dag "4" werden de oorzwellingsreacties van beide oren geïnduceerd door contactverf (challenge) met 10 μL van 0,4% TNCB bij beide muizen die eerder contact hadden met TNCB (testgroep) en de controlegroepmuizen (schijnsensibiliseerd). De gepresenteerde gegevens laten zien dat de muizen die gesensibiliseerd waren met TNCB en 4 dagen later werden uitgedaagd, een significant verhoogde oorzwelling ontwikkelden in vergelijking met de schijnsensibiliseerde muizen die op dezelfde manier werden uitgedaagd (figuur 3, tabel 2, test versus controlegroep). De resultaten van de oorzwelling werden volledig gevalideerd in verdere studies, waarbij werd benadrukt dat een toename van ooroedeem bepaald met een micrometer overeenkwam met verhoogd oorgewicht (figuur 4), MPO-activiteit (figuur 5), IFN-γ concentratie in de oorextracten (figuur 6), verhoogde verdikking van de oedemateuze dermis in het histologisch onderzoek (figuur 7) en oorvasculaire permeabiliteit (figuur 8). ). Een toename van de concentratie van TNP-specifieke IgG1-antilichamen werd ook gevonden in de sera van de testmuizen in vergelijking met de controledieren (figuur 9).

Als voorbeeld van T-cel-gemedieerde immuunrespons kan CHS ook worden overgedragen op naïeve syngene ontvangende muizen. Donoren werden gesensibiliseerd door TNCB-toepassing en vervolgens werden de CHS-effectorcellen i.v. toegediend aan de naïeve ontvangende muizen, die werden uitgedaagd met de hapten en 24 uur later werden getest op CHS (figuur 10). De dieren die de CHS-effectorcellen ontvingen van donoren die eerder gesensibiliseerd waren met TNCB vertoonden een significant verhoogde zwelling van het oor in vergelijking met dieren die alleen werden uitgedaagd (geen cellen ontvingen).

De CHS-reactie heeft een complex mechanisme en omvat verschillende cellen. Antigeenpresentatie en T/B-celactivering treden op in de perifere lymfeorganen (bijv. LAN's en SPL). Er werd vastgesteld dat CHS-effectorcellen uitgeput van CD4+ maar niet CD8+ cellen voorafgaand aan adoptieve celoverdracht resulteerden in de afwezigheid van de CHS-reactie bij de ontvangende muizen. Die cellen bleken positief te zijn voor IFN-γ (T-box transcriptiefactor TBX21, Tbet+) en IL-17A (retinoïnezuurreceptor-gerelateerd weeskernreceptor gamma, RORγT+) (aanvullende figuur 1).

De gepresenteerde resultaten van de representatieve experimenten werden uitgevoerd op C57BL/6 en CBA/J mannelijke en vrouwelijke muizen op de leeftijd van 8-12 weken. Volgens de 3R-regels in het gebruik van dieren23, met name reductie, voor de toepassing van dit artikel, worden de resultaten van experimenten weergegeven op kleine groepen dieren. De gegevens in de grafieken worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. De statistische significantie werd vastgesteld op p < 0,05. De grafieken zijn getekend met behulp van Prism-software (zie Materiaaltabel).

Figure 1
Figuur 1: Inductie van CHS. Sensibilisatie, uitdaging en oormeting. Afkortingen: CHS = contactovergevoeligheidsreactie; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Adoptieve overdracht van de CHS-effectorcellen. Afkortingen: ALN's =axillaire en inguinale lymfeklieren; CHS = contactovergevoeligheidsreactie; i.v. = intraveneus; SPL's = milt; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Representatieve evaluatie van CHS tot TNCB door de meting van oorzwelling met een micrometer. Muizen werden TNCB (testgroep) of sham (controlegroep) gesensibiliseerd en vervolgens uitgedaagd. De dikte van de oorschelp werd voor en na de challenge gemeten en verschillen in oorzwelling werden berekend door de 0 h oordikte (μm) af te trekken van de 24 h oordikte (μm). Oorzwelling werd uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, ****p < 0,0001, n = 10 muizen/groep (gegevens uit tabel 2). Afkortingen: CHS = contactovergevoeligheidsreactie; SEM = standaardfout van het gemiddelde; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Representatieve evaluatie van CHS door de meting van het oorgewicht. Oorgewicht is een van de parameters die overeenkomt met oorzwelling. Muizen werden TNCB (testgroep) of sham (controlegroep) gesensibiliseerd en vervolgens uitgedaagd. Om 24 uur na de uitdaging werden stoten met een diameter van 6 mm uit de verwijderde oren gehaald. De stoten werden gewogen op een analytisch laboratoriumbalans. Het oorgewicht werd uitgedrukt in milligram (mg) als gemiddelde ± SEM, ***p < 0,001, n = 10 muizen/groep. Afkortingen: CHS = contactovergevoeligheidsreactie; SEM = standaardfout van het gemiddelde; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve evaluatie van MPO-activiteit. Verhoogde MPO-activiteit in weefselextracten correleert met oorontsteking. TNCB-gesensibiliseerde muizen (testgroep) en schijnsensibiliseerde muizen (controlegroep) werden uitgedaagd. Na 24 uur na de challenge werden de oren verwijderd en werden 6 mm diameter stoten van het oor geëxtraheerd en verwerkt. MPO-activiteit wordt uitgedrukt in U per eiwitgehalte (U/g eiwit). Resultaten weergegeven als gemiddelde ± SEM, **p < 0,01, n = 5-6 muizen/ groep. Afkortingen: CHS = contactovergevoeligheidsreactie; MPO = myeloperoxidase; SEM = standaardfout van het gemiddelde; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen; U = eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Representatieve evaluatie van cytokineproductie-IFN-γ concentratie in oorextracten. Muizen werden TNCB (testgroep) of sham (controlegroep) gesensibiliseerd en vervolgens uitgedaagd. Na 24 uur na de challenge werden de oren verwijderd en werden stoten van het oor met een diameter van 6 mm genomen. De concentratie ifn-γ werd bepaald in weefselhomogenaten door ELISA. Resultaten weergegeven als gemiddelde ± SEM, *p < 0,05, n = 5 muizen/groep. Afkortingen: CHS = contactovergevoeligheidsreactie; IFN-γ = interferon gamma; SEM = standaardfout van het gemiddelde; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Representatieve histologie van het oorweefsel. Hematoxyline en eosine kleuring. Muizen werden TNCB (testgroep) of sham (controlegroep) gesensibiliseerd en vervolgens uitgedaagd. (A-C) Histologisch onderzoek in de testgroep manifesteerde zich in een significant verhoogde concentratie van ontstekingscellen (mononucleaire en polymorfonucleaire cellen), voornamelijk in de dermis, met microabscesvorming in de epidermis. Verdikking van de oedemateuze dermis en een verdikte, hyperplastische epidermis werden ook opgemerkt. (D-E) Controlegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Representatieve vasculaire permeabiliteitstest. Waargenomen oorweefseloedeem is een gevolg van verhoogde vasculaire permeabiliteit. Om veranderingen in vasculaire permeabiliteit te bepalen, werden muizen TNCB (testgroep) of sham (controlegroep) gesensibiliseerd en vervolgens 4 dagen later uitgedaagd. Om 23 uur na de uitdaging werd Evans blauw geïnjecteerd en 1 uur na evans blauwe injectie werden de dieren geëuthanaseerd en werden 6 mm diameter stoten van het oor gemaakt. Resultaten weergegeven als gemiddelde ± SEM, **p < 0,01, n = 5 muizen/groep. Afkortingen: CHS = contactovergevoeligheidsreactie; SEM = standaardfout van het gemiddelde; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Representatieve anti-TNP IgG1 antilichaammeting. De concentratie van anti-TNP IgG1-antilichamen in serum werd 24 uur na de challenge gemeten met hapten TNCB in sham sensitized (control) en in TNCB-sensitized (testgroep) muizen. De verzamelde sera werden getest op antilichaamconcentratie door ELISA. Resultaten weergegeven als gemiddelde ± SEM, ***p < 0,001, n = 10 muizen/groep. Afkortingen: CHS = contactovergevoeligheidsreactie; IgG1 = immunoglobuline G subklasse 1; SEM = standaardfout van het gemiddelde; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 10
Figuur 10: Representatieve adoptieve overdracht van de CHS-effectorcellen. De CHS-effectorcellen werden verkregen van donoren die gesensibiliseerd waren met TNCB. Vervolgens werden de verzamelde immuuncellen geïnjecteerd, d.w.v., in naïeve syngene ontvangers, die werden uitgedaagd voor elicitatie van de CHS-effectorfase. De controlegroep van muizen ontving voorafgaand aan de uitdaging geen cellen. De dikte van de oorschelp werd voor en na de challenge gemeten. Resultaten weergegeven als gemiddelde ± SEM, ***p < 0,001, n = 7 muizen/groep. Afkortingen: CHS = contactovergevoeligheidsreactie; SEM = standaardfout van het gemiddelde; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Muizenstam Sensibilisatieoplossing (dosis)
op geschoren buik		 Elicitatieoplossing (dosis)
aan beide zijden van oor/en		 Sensibilisatie / elicitatie dag Refs
BALB/c (H-2d); C57BL/6 (H-2b)
TCRδ-/-, β2m-/-, CD1d-/- (B10 PL (H-2u achtergrond)		 25 μL van 0,5 % DNFB in aceton-olijfoliemengsel (verhouding 4:1) 5 μL van 0,1 % DNFB in aceton-olijfoliemengsel (verhouding 4:1) 0 / 5 22
C57BL/6 (H-2b) 50 μL van 0,5 % DNFB in aceton-olijfoliemengsel (verhouding 4:1) 25 μL van 0,2 % DNFB in aceton-olijfoliemengsel (verhouding 4:1) 0 / 5 32
C57BL/6 (H2b); IL-17A-/- (C57BL/6 achtergrond) 150 μL van 5% TNCB in aceton-ethanolmengsel (verhouding 1:3) 10 μL van 0,4 % TNCB in een mengsel van olijfolie en aceton (verhouding 1:1) 0 / 4 33
CBA/J (H-2k); C57BL/6 (H-2b)
TLR2-/-, MyD88-/-, IL-17A-/- (C57BL/6 achtergrond)		 150 μL van 5 % TNP-Cl (TNCB) in een aceton-ethanolmengsel (verhouding 1:3) 10 μl 0,4 % TNP-Cl (TNCB) in olijfolie-acetonmengsel (verhouding 1:1) 0 / 4 21
C57BL/6 (H-2b); BALB/c (H-2d) 25 μL van 1 % TNCB in een aceton 10 μL van 0,1 of 0,2 % TNCB in een aceton (en hoger tot 1 %) 0 / 7 34
C57BL/6 (H-2b); TLR2-/-/ TLR4-/-
(dubbele knock-out muizen op C57BL/6 achtergrond)		 100 μL van 3 % TNCB in een aceton 20 μL van 1 % TNCB in een aceton (net aan de achterkant van de oren) 0 / 5 31
C57BL/6 (H-2b)
MHC klasse II-deficiënte muizen (C57BL/6 achtergrond)		 100 μL van 3 % TNCB in aceton-olijfoliemengsel (verhouding 4:1) 20 μL van 0,5 of 1 % TNCB in aceton-olijfoliemengsel (verhouding 4:1) 0 / 6 35
C57BL/6 (H-2b) 100 μL van 7 % TNCB in een aceton 20 μL 1 % TNCB in een aceton 0 / 5 36
C57BL/6 (H-2b) 100 μL 3 % OX in ethanol 20 μL 1 % OX in een ethanol 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (C57BL/6 achtergrond) 25 μL 0,5 % DNFB in aceton-olijfolie (verhouding 4:1) 10 μL 0,2 % DNFB in aceton-olijfolie (verhouding 4:1) 0 / 5 10
C57BL/6 (H-2b); CD4-/-, CD8-/- (C57BL/6 achtergrond) 150 μL van 3 % OX in alcohol-aceton (verhouding 3:1) 10 μL 1% OX in alcohol-aceton (verhouding 3:1) 0 / 5
C57BL/6 (H-2b); C3H/HeN (H-2k); TLR4-/- (C3H/HeJ achtergrond); MyD88-/- (C57BL/6 achtergrond) 100 mg/oor van 10 % NiCl2 in witte vaseline aan de dorsale zijde van beide oren 10 % NiCl2 in witte vaseline 0,1,2 / 23, 24 37
NOD (H-2g7) MyD88-/- (NOD achtergrond) 400 μL van 0,5 % FITC in aceton en dibutylftalaat 10 μL van 0,1 % FITC in aceton en dibutylftalaat 0 / 5 25

Tabel 1: Vergelijking van het CHS-model in verschillende studies. Afkortingen: DNFB = 1-fluor-2,4-dinitrobenzeen; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; NiCl2 = nikkel(II)chloride; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen; TNP-Cl = trinitrifenylchloride; OX = oxazolon. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Controlegroep (negatief) Testgroep (CHS-reactie)
Muis # oor: L, R 0 h oordikte [μm] 24 h oordikte [μm] 24 h – 0 h oordikte [μm] Muis # oor: L, R 0 h oordikte [μm] 24 h oordikte [μm] 24 h – 0 h oordikte [μm]
1 l 365 380 15 1 l 345 427.5 82.5
1 R 335 380 45 1 R 340 455 115
2 l 345 355 10 2 l 355 475 120
2 R 327.5 352.5 25 2 R 342.5 457.5 115
3 l 340 370 30 3 l 340 460 120
3 R 325 355 30 3 R 345 495 150
4 l 335 380 45 4 l 357.5 432.5 75
4 R 340 350 10 4 R 335 402.5 67.5
5 l 350 380 30 5 l 335 387.5 52.5
5 R 337.5 360 22.5 5 R 335 425 90
6 l 335 365 30 6 l 350 430 80
6 R 340 375 35 6 R 342.5 405 62.5
7 l 345 337.5 0 7 l 340 502.5 162.5
7 R 345 335 0 7 R 327.5 447.5 120
8 l 370 380 10 8 l 327.5 515 187.5
8 R 375 355 0 8 R 327.5 540 212.5
9 l 385 370 0 9 l 330 415 85
9 R 342.5 362.5 20 9 R 327.5 390 62.5
10 l 307.5 340 32.5 10 l 337.5 445 107.5
10 R 325 350 25 10 R 352.5 455 102.5
Bedoelen 20.75 Bedoelen 108.5
± SEM 3.245 ± SEM 9.565

Tabel 2: Representatief voorbeeld van het berekenen van het verschil in oordikte in de effectorfase van CHS. Het berekenen van het verschil in de dikte van de oorschelp voor en na de challenge met de hapten: 24 h oordikte (μm) - 0 h oordikte (μm). Elk oor telt als een afzonderlijke meting. Oorzwelling uitgedrukt in micrometer (μm) ± SEM, n = 20. Afkortingen: L = links; R = juist. Klik hier om deze tabel te downloaden.

iSTD-verdunning met AD anti-TNP IgG1 Ab (U/ml)
100x 250
200x 125
400x 62.5
800x 31.25
1600x 15.63
3200x 7.8
alleen AD 0

Tabel 3: Bereiding van de verschillende concentraties iSTD voor de standaardcurve voor anti-TNP IgG1 Ab meting. De 100x iSTD-verdunning werd verondersteld 250 U anti-TNP IgG1 Ab te zijn. Afkortingen: Ab = antilichaam; AD = testverdunningsmiddel; iSTD = interne standaard; IgG1 = immunoglobuline G subklasse 1; TNP = 2,4,6-trinitrifenyl; U = eenheden. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Het fenotype van CHS-effectorcellen. De CHS-effectorcellen werden verkregen uit de ALN's en SPL's van donoren, die eerder werden gesensibiliseerd met TNCB. (A) Met behulp van de MACS-techniek werden de CHS-effectorcellen (hele ALN's en SPL's) uitgeput van CD4+ of CD8+ cellen. Vervolgens werd adoptieve celoverdracht uitgevoerd voorafgaand aan de elicitatie van de CHS-effectorfase. Oorzwelling werd uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. (B-E) Met behulp van een flowcytometrietechniek werden de CHS-effector en naïeve (verkregen uit naïeve muizen) cellen gekleurd voor IFN-γ, Tbet, IL-17A en RORγt voorafgaand aan de analyse. Cellen werden afgesloten voor de TCRβ+CD4+populatie. Resultaten weergegeven als gemiddelde ± SEM, ***p < 0,001, **p < 0,01, * p < 0,05, n = 4-6 muizen/groep. Afkortingen: ALN's = axillaire en inguinale lymfeklieren; CD4 = cluster van differentiatie 4; CHS = contactovergevoeligheidsreactie; IFN-γ = interferon gamma; IL = interleukine; MACS = magnetisch geactiveerde celsortering; ns = niet significant; RORγt = retinoïnezuur-zuur-receptor-gerelateerd weeskernreceptor gamma; SEM = standaardfout van het gemiddelde; SPL's = milt; Tbet = T-box transcriptiefactor TBX21; TCRβ = T-cel receptor bèta; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzeen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CHS wordt geïnduceerd via haptens, die zich binden aan zelfeiwitantigenen in de huid, waardoor neoantigenen ontstaan. CHS wordt gemedieerd door lokale extravasculaire rekrutering van circulerende antigeenspecifieke CHS-effector T-cellen, wat resulteert in zwelling in het uitgedaagde weefsel, met een piek van 24 uur na blootstelling van de secundaire huid aan dezelfde hapten6. De zwelling van het weefsel wordt voornamelijk veroorzaakt door de infiltratie van leukocyten en leukocytenafhankelijke fibrineafzetting24. Deze veranderingen kunnen worden gedetecteerd met een micrometer die de oorzwelling meet van hapten-gesensibiliseerde en uitgedaagde versus schijngevoelige en uitgedaagde muizen.

CHS kan ook worden bepaald door de vergelijking van het oorgewicht. Vervolgens kunnen de oorstoten die worden gebruikt voor het bepalen van het oorgewicht worden gebruikt voor verdere tests. De celinfiltranten in de ontstoken oren bestaan uit cytokineproducerende T-lymfocyten en MPO-positieve neutrofielen. In de oorweefselhomogenaten kunnen verschillende parameters worden gemeten, zoals MPO-activiteit of de concentratie van pro-inflammatoire cytokines (bijv. TNF-α, IFN-γ, IL-17A of anderen) met behulp van de ELISA-test of de expressie van het cytokine-mRNA in de huid met behulp van de qPCR-test25. Bovendien kunnen veranderingen in de permeabiliteit van het vat worden geëvalueerd met behulp van de Evans blue test21,26.

In het ontstoken oorweefsel kunnen de waargenomen veranderingen ook worden aangevuld met in vitro tests, waarbij de proliferatie van T-cellen en cytokineproductie wordt benadrukt. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door ALN's te kweken in de aanwezigheid van hapten-geconjugeerde eiwitantigenen22,27. De evaluatie van cytokinesecretie door ALN's geïsoleerd uit gesensibiliseerde maar niet uitgedaagde muizen geeft details over cytokineproductie door de CHS-effectorcellen op de plaats van hun inductie.

Beperkingen
Veel micrometers meten oorzwelling met verschillende nauwkeurigheid. De laagste druk wordt bijvoorbeeld uitgeoefend door een veerklauw, dus het lijkt erop dat de resultaten het beste de werkelijke dikte van de oormeting weerspiegelen. Micrometers die meer druk uitoefenen, zoals Mitutoyo, zullen echter waarschijnlijk de vloeistof die zich in de vroege fase van oedeemvorming in de oren ophoopt, strakker comprimeren. De bifasische aard van CHS kan duidelijker worden gevisualiseerd met behulp van dergelijke micrometers omdat er meer druk wordt uitgeoefend. Dit is moeilijker bij het gebruik van een veerklauw met lichte druk28. Niettemin werd in sommige studies de dikte van de oren gemeten met een remklauw29. Ook zorgt de ervaring van de waarnemer voor nauwkeurige metingen, die kunnen worden beïnvloed door subjectieve gevoelens, zelfs als de waarnemer zich niet bewust is van de experimentele groepen.

Hier zijn alternatieve methoden beschreven die kunnen helpen bij het bevestigen van de metingen van oorzwelling met een micrometer, waardoor de gepresenteerde gegevens betrouwbaarder en minder subjectief worden. Deze alternatieve strategieën voor het beoordelen van CHS kunnen echter slechts op één moment in de tijd worden gebruikt. Micrometermetingen kunnen op verschillende tijdstippen worden herhaald, waardoor de CHS-kinetiek kan worden bestudeerd.

Wijzigingen
Het protocol voor het bestuderen van de CHS-reactie die we in ons laboratorium gebruiken, verschilt aanzienlijk van die in andere laboratoria, inclusief de dosis hapten en de oplosmiddelsamenstelling die wordt gebruikt voor zowel elicitatie als sensibilisatie, evenals het tijdstip waarop de reactie wordt beoordeeld. De oordikte kan op verschillende tijdstippen worden gemeten (bijv. 2 h, 24 h, 48 h en 72 h na de challenge)10,30. Tabel 1 toont verschillende experimentele modellen, met name de verschillen in de dierlijke stam, hapten en de sensibilisatie-/provocatietijden die in verschillende onderzoeken zijn gebruikt 10,21,22,26,31,32,33,34,35,36,37 . Het CHS-protocol kan ook worden uitgevoerd zonder eerder scheren van de buik van de muizen.

Het volgende verschil betreft de uitvoering van de elicitatie (challenge) zelf. Zoals gebruikelijk wordt de sensibilisatie gedaan door de buikhuid van geschoren muizen te schilderen met de hapten of het voertuig alleen. Vervolgens wordt in beide groepen één oor uitgedaagd met verdunde hapten aan elke oorzijde. Als controle is het tegenovergestelde oor gespoten met een identieke hoeveelheid voertuig alleen10,31.

Kritieke stappen
Het meest kritieke moment is om CHS te activeren, omdat de testresultaten ervan afhangen. (1) Hapten-oplossing is zeer vluchtig en lichtgevoelig, dus moet deze goed gesloten en beschermd tegen licht zijn, en wanneer zij in gebruik is, moet zij snel op de huid van de dieren worden aangebracht, zodat zij niet verdampt. (2) Na het aanbrengen van de hapten op de huid van de buik, moet deze worden gedroogd voordat het dier terugkeert naar de kooi, omdat muizen het tegen het strooisel kunnen smeren of het met hun poten op de oren kunnen aanbrengen (dan kan de meting van de dikte van de oorschelp onvoldoende zijn). (3) Er zijn ook verschillende methoden bekend om dieren te etiketteren, zoals het markeren van muizenstaarten met een oplosmiddelbestendige marker. De kleurstoffen die in de marker aanwezig zijn, kunnen echter (niet bestudeerd) een hapten worden en CHS activeren. Daarom is in dit onderzoek gekozen voor een markeringsmethode die de reactie niet beïnvloedt. (4) Het kiezen van een scheermethode is erg belangrijk omdat het de huid kan irriteren. In dit protocol werd een grijze zeep gebruikt omdat deze verzachtende eigenschappen heeft; het versnelt de behandeling van kleine snijwonden en etterende wonden, wat wordt geholpen door de antibacteriële effecten. Het kalmeert zwelling en ontsteking van de huid.

Verder onderzoek en standaardisatie van de experimentele procedures, inclusief het gebruik van dieren (stam en geslacht), zijn nodig om de resultaten van verschillende onderzoeken te vergelijken.

Veel verschillende omgevingsfactoren en nieuwe stoffen met biologische functies kunnen worden getest in het CHS-model. Dit model kan nuttig zijn als onderzoekers willen aantonen of geteste factoren T-celafhankelijke immuunresponsen moduleren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door subsidiëring SUBZ. A020.22.060 van de Medische Universiteit in Wroclaw, Polen, en door subsidies van het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs N N401 545940 aan MS en IP2012 0443 72 aan MMS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
70% ethanol Merck KGaA, Darmstadt, Germany 65350-M for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655101 for MPO and Evans blue measurement - plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 179124
Aluminum foil Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z185140
Analytical balance Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India MTP-E-212 automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum) Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination Merck KGaA, Darmstadt, Germany BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 553441
BSA (bovine serum albumine) Merck KGaA, Darmstadt, Germany A9418 protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm BIOLOGIX, China 15-1070 suitable for 50 mL tubes
Coverslip VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-1583 24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 14190144 no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology Merck KGaA, Darmstadt, Germany 6522 mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers - straight Animalab, Poznan, Poland 11251-10FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers - bent Animalab, Poznan, Poland 11272-50FST surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,086 polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL Eppenforf, Germany 3,01,20,094 polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.07017
Ethanol 96% Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.59010
Evans blue Merck KGaA, Darmstadt, Germany E2129
FBS (fetal bovine serum) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10% Merck KGaA, Darmstadt, Germany HT501128
Formamide 99.5% (GC) Merck KGaA, Darmstadt, Germany F7503
Freezer -20 °C Bosch, Germany GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C Bosch, Germany KGV36V10 mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism GraphPad Software Inc. v. 9.4.0
Grey soap Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland Bialy jelen soap bar grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.60313
Harris hematoxylin solution Merck KGaA, Darmstadt, Germany HHS16
Hemocytometer VWR, Avantor, U.S.A 612-5719 manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide Merck KGaA, Darmstadt, Germany H5882
Homogenizer QIAGEN Hilden, Germany Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin) Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202) Merck KGaA, Darmstadt, Germany H1009
Incubator Heracell 150i Thermo Electron LED Gmbh, Germany 41071068 37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis Merck KGaA, Darmstadt, Germany 1.05108
Laboratory Centrifuge Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany B00013899 speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany 75002425 speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2) VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 111-0917 for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland CBA/J, C57BL/6
Micrometer Mitutoyo, Tokyo, Japan 193-111 digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test) Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria 655061 with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives Leica Microsystems CMS GmbH, Germany DM1000, 294011-082007 histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard) Merck KGaA, Darmstadt, Germany M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate) Merck KGaA, Darmstadt, Germany S9390
Olive-oil Merck KGaA, Darmstadt, Germany 75343 pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555138
Ortho-dianisine dihydrochloride Merck KGaA, Darmstadt, Germany D3252
Paraffin wax Merck KGaA, Darmstadt, Germany 76242 beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline) ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA 20012027 pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter Elmetron, Poland CP-401
Pipettes, variable volume with tips Merck KGaA, Darmstadt, Germany EP3123000900-1EA 3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade VWR, Radnor, Pennsylvania, United States PERS94-0462 scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK HIS-202A
Scissors - straight, sharp / sharp Animalab, Poznan, Poland 14060-10FST Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27056 black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer BioTek Instruments, U.S.A 201446 universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 - 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 - 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack Merck KGaA, Darmstadt, Germany S6141 e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA 33-36
Surgical scissors Animalab, Poznan, Poland 52138-46 surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes Merck KGaA, Darmstadt, Germany Z672122 tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA 555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene) Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl) Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent) ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 78510
Tubes 15 mL sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430055 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile Merck KGaA, Darmstadt, Germany CLS430290 (Corning) polypropylene, conical bottom
Tween 20 Merck KGaA, Darmstadt, Germany P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL Merck KGaA, Darmstadt, Germany 27173 for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath AJL Electronic, Poland LW102
Wax (paraffin) dispenser VWR, Radnor, Pennsylvania, United States 114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland cat.# not avaliable
Xylene (histological grade) Merck KGaA, Darmstadt, Germany 534056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016 (2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765 (2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

Tags

Immunologie en infectie Nummer 187 Muizenmodel allergische contactdermatitis (ACD) contactovergevoeligheid (CHS) oorzwelling vasculaire permeabiliteit myeloperoxidase (MPO) cytokines 2,4,6-trinitrochlorobenzeen (TNCB) hapten

Erratum

Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 01/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 1
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 2
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Contactovergevoeligheid als een muizenmodel van allergische contactdermatitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zemelka-Wiacek, M.,… More

Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. J. Vis. Exp. (187), e64329, doi:10.3791/64329 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter