Genotypning af enkeltnukleotidpolymorfier i mitokondriegenomet ved pyrosekventering

Summary

Pyrosekventering assays muliggør robust og hurtig genotypning af mitokondrie-DNA enkeltnukleotidpolymorfier i heteroplasmatiske celler eller væv.

Abstract

Mutationer i mitokondriegenomet (mtDNA) har været forbundet med moderens arvelige genetiske sygdomme. Imidlertid er interessen for mtDNA-polymorfier steget i de senere år på grund af den nyligt udviklede evne til at producere modeller ved mtDNA-mutagenese og en ny forståelse af sammenhængen mellem mitokondrie genetiske aberrationer og almindelige aldersrelaterede sygdomme som kræft, diabetes og demens. Pyrosequencing er en sekventerings-for-syntese teknik, der er bredt anvendt på tværs af mitokondriefeltet til rutinemæssige genotypeforsøg. Dens relative overkommelighed sammenlignet med massive parallelle sekventeringsmetoder og nem implementering gør det til en uvurderlig teknik inden for mitokondriegenetik, hvilket giver mulighed for hurtig kvantificering af heteroplasmi med øget fleksibilitet. På trods af den praktiske anvendelse af denne metode kræver dens implementering som et middel til mtDNA-genotypning overholdelse af visse retningslinjer, specifikt for at undgå visse forstyrrelser af biologisk eller teknisk oprindelse. Denne protokol skitserer de nødvendige trin og forholdsregler ved design og implementering af pyrosekventering assays til brug i forbindelse med heteroplasmi måling.

Introduction

Mitokondriegenomet findes i form af små (16,5 kb) cirkulære molekyler (mtDNA), der er til stede i mitokondriernes inderste rum ved navn matrixen og koder for 13 underenheder af mitokondrie-respirationskæden samt de tRNA'er og rRNA'er, der er nødvendige for deres oversættelse in situ af mitokondrieribosomet¹. Dette genom repræsenterer ca. 1% af alle de proteiner, der er nødvendige for mitokondriefunktionen, hvoraf resten er kodet af det nukleare DNA (nDNA). Det antages almindeligvis, at mitokondrier stammer fra en endosymbiotisk fusionsbegivenhed mellem en alfa-proteobakteriel forfader og en forfædres eukaryot celle. Når denne hypotetiske symbiose fandt sted, blev mitokondriernes genetiske information gradvist overført til kernen over æoner, hvilket forklarer den førnævnte kompakthed af mtDNA sammenlignet med genomerne af moderne cyanobakterier². En sådan overførsel af gener er stærkest bevist ved eksistensen af lange strækninger af nDNA, der er meget homologe med sekvenserne fundet i mtDNA. Disse nukleare mitokondriesekvenser (NUMT'er) er en almindelig kilde til fejlfortolkning under genotypning, og der skal træffes visse forholdsregler for at undgå nukleare forstyrrelser ved genotypning af mtDNA³ (figur 1A).

Et andet særpræg ved mtDNA er, at dets kopinummer varierer afhængigt af celletypen, der nummererer alt fra titusinder til tusinder af kopier pr.^{Celle 4}. På grund af denne multikopi-natur kan mtDNA rumme en bred vifte af genotyper inden for en enkelt celle, hvilket kan resultere i en mere kontinuerlig fordeling af alleler i modsætning til de diskrete alleler forbundet med nukleare gener, når man overvejer kromosomernes zygositet. Denne heterogenitet af mitokondriealleler kaldes mitokondriel heteroplasmi, som typisk udtrykkes i procentprævalensen af en given mutation som en andel af det samlede mtDNA i en given celle. Heteroplasmi kan kontrasteres med homoplasmi, som refererer til en unik art af mtDNA, der er til stede på tværs af en celle.

Måling af mitokondriel heteroplasmi er af særlig interesse ved kvantificering af andelen af mtDNA-molekyler, der huser patogene varianter. Sådanne varianter kommer i form af enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er), små indels eller store deletioner⁵. De fleste mennesker er heteroplasmatiske for patogene varianter; De udviser imidlertid ingen kliniske fænotyper, som ofte kun manifesterer sig ved højere heteroplasmatiske niveauer af patogent mtDNA i et fænomen, der kaldes tærskeleffekten⁶. Mens værdierne forbundet med patogenicitet er stærkt afhængige af arten af den patogene mutation og vævet, hvori den forekommer, ligger de typisk over 60% heteroplasmi⁷.

Der er flere forskningsområder, hvor mitokondriel genotypebestemmelse er almindelig. På det medicinske område kan testning for eller kvantificering af mtDNA-mutationer tjene som et diagnostisk kriterium for mitokondriesygdomme, hvoraf mange har mtDNA-aberrationer som deres oprindelse⁵. Ud over undersøgelsen af humane patogene mutationer vil forekomsten af dyremodeller, der huser patogene SNP'er i mtDNA'et, sandsynligvis stige i betragtning af den nylige fremkomst af mitokondriebaseredigering muliggjort af mitokondrielt målrettede DddA-afledte cytosinbaseeditorer (DdCBE'er)⁸ og TALE-baserede deaminaser (TALED'er) til adeninbaseredigering⁹. Denne tilgang vil være medvirkende til at forstå samspillet mellem afvigende mitokondriegenotyper og de deraf følgende dysfunktioner. Der er også igangværende videnskabelig forskning i ombygning af mitokondriegenomet til ultimativ anvendelse som en terapeutisk strategi i humane mitokondriesygdomme via en tilgang kendt som heteroplasmi shifting. Dette forskningsfelt involverer primært at dirigere mutationsspecifikke nukleaser til mitokondriematrixen; dette resulterer i den præferentielle nedbrydning af patogent mtDNA, hvilket fører til redning i fænotype^10,11,12,13. Ethvert eksperiment, der involverer ombygning af mitokondriegenotypen, kræver en robust kvantitativ metode til vurdering af heteroplasmiskift.

En lang række metoder bruges til at genotype mtDNA, og disse varierer alt efter mutationens art. Næste generations sekventeringsmetoder (NGS) er mere præcise, når det kommer til kvantificering af SNP'er i mtDNA; Disse metoder forbliver imidlertid uoverkommeligt dyre til rutinemæssig kvantificering af mitokondriel heteroplasmi, især hvis antallet af prøver er lille. Sanger-sekventering kan også give mulighed for detektion af SNP'er; Denne tilgang er imidlertid ikke kvantitativ og undlader ofte at detektere lave niveauer af heteroplasmi eller kan være unøjagtig, når man estimerer høje heteroplasmier. Pyrosekventering som et assay, der involverer minimal forberedelse og muliggør hurtig kvantificering af heteroplasmi for enhver mtDNA-prøve, foreslås som et passende kompromis mellem disse to ekstremer. Denne metode er blevet brugt rutinemæssigt til at kvantificere mitokondrie SNP'er af adskillige forskere i forskellige sammenhænge, herunder retsmedicinsk analyse 14,15^, klinisk diagnose¹⁶ eller genotypning af mtDNA fra enkeltceller¹⁷.

Dette assay involverer et første PCR-præamplifikationstrin i en region, der flankerer SNP i mtDNA'et, som efterfølges af et sekventerings-for-syntese-assay ved anvendelse af en streng af den tidligere genererede amplicon. En af de to primere, der anvendes i præamplifikationstrinnet, skal biotinyleres på 5'-enden, hvilket gør det muligt for pyrosekventering at isolere den enkelte DNA-streng, der skal bruges som skabelon for sekventeringsreaktionen. En tredje sekventeringsprimer udglødes derefter på den tilbageholdte biotinylerede streng, hvilket gør det muligt at dispensere spirende DNA-syntese som deoxynukleotider i en foruddefineret rækkefølge i reaktionskammeret. Pyrosequenceren registrerer mængden af hver base, der er inkorporeret, baseret på en selvlysende aflæsning, hvilket muliggør den relative kvantificering af mutante og vildtype-mitokondriealleler ved DNA-syntese (figur 1B). Luminescensen genereres af et luciferaseenzym, som udsender lys i nærvær af ATP, som en ATP-sulfurylase syntetiserer de novo ved hver inkorporeringsbegivenhed fra pyrophosphaterne frigivet af hvert nukleotid. Disse to reaktioner kan opsummeres som følger:

1. PP_i (fra nukleotidinkorporering) + APS → ATP + sulfat (ATP sulfurylase)

2. ATP + luciferin +_O2 → AMP + PP_i + oxyluciferin + CO₂ + lys (luciferase)

Det er en udfordring at detektere adeninbaser af pyrosequenceren uden ATP-krydsreaktion med luciferase i den anden reaktion. Dette løses imidlertid ved at anvende en adeninanalog til DNA-syntese, nemlig dATPαS. På trods af at det ikke er et perfekt substrat til luciferase, producerer det en stærkere luminescens sammenlignet med de tre andre nukleotider, som justeres digitalt af pyrosequenceren og indstilles til en faktor på 0,9. På grund af denne iboende variabilitet foreslås det at undgå sekventering af adenin ved SNP-positionen (se diskussionen for yderligere detaljer).

Følgende protokol beskriver metoden til mtDNA-heteroplasmatisk vurdering ved pyrosekventering og skitserer de nødvendige forholdsregler ved design af amplifikationsprimere for at undgå biologisk eller teknisk bias ved genotypebestemmelse af SNP'er i mtDNA. Sidstnævnte involverer digital opmåling og udvælgelse af primersæt, optimering af forforstærknings-PCR og endelig sekventering og raffinering af analysen. To anvendte eksempelanalyser demonstreres: for det første optimering af den mest almindelige humane patogene variant m.3243A>G¹⁸ og for det andet genotypning af museembryonale fibroblastceller (MEF), der har gennemgået heteroplasmiskift ved hjælp af teknologier udviklet på Minczuk-laboratoriet i Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

Protocol

Der blev givet informeret samtykke til brug af de humane 3243A>G cybridceller og de udødeliggjorte m.5024C>T MEF'er, der blev anvendt i dette studie. Etisk godkendelse var ikke påkrævet i dette tilfælde, da patientcellerne ikke blev indsamlet på University of Cambridge. Anvendelsen af humane fibroblaster kan dog kræve etisk godkendelse. Det anbefales stærkt at følge bedste praksis for PCR-opsætning, når prøve-DNA forberedes til pyrosekventering af prøven. Hyppig forstærkning ved hjælp af identiske primere kan føre til amplicon kontaminering og indføre bias til den efterfølgende genotype, hvis streng adskillelse mellem præ-PCR- og post-PCR-områderne ikke overholdes. Rørledningen, der præsenteres her, bruger specifikt udstyr fra en eneste producent; detaljerne findes i materialefortegnelsen. Primerdesignet til PCR kan udføres manuelt, hvis det ønskes; Det anbefales dog at bruge eksisterende software til dette formål (se materialetabellen).

1. Pyrosekventering primer design og assay valg

1. Indhentning af primerkandidater med software
   1. Få en mtDNA-sekvensfil for den art, der genotypes, og identificer SNP's position. Sørg for, at den anvendte referencesekvens anvender den korrekte basisnummerering for den undersøgte mutation, således at SNP's position let kan identificeres.
   2. Kopier 1.000 basepar opstrøms og nedstrøms for SNP-stedet, og indsæt den afkortede sekvens i softwaren, der er beregnet til pyrosekventering af primerdesignet (se materialetabellen).
   3. Indstil den analyserede SNP-base som mål for pyrosekventering assay i softwaren ved at fremhæve den polymorfe base og højreklikke på og derefter vælge sæt målregion.
   4. Tryk på afspilningsikonet i øverste højre hjørne af grænsefladen for at starte grundvalg.
   5. Vent på, at softwaren nu automatisk genererer primertrioer: to primere til præamplifikation af skabelon-DNA'et og en tredje primer til sekventering ved syntese i pyrosekventering maskinen. Bevar alle primersæt ved at højreklikke på og vælge kopier alle primersæt.
2. Valg af de optimale primersæt fra den genererede liste
   1. Behold primersættene med den højeste kvalitetsscore baseret på softwareoutputtet, som giver primersæt i faldende rækkefølge baseret på kvalitetsresultatet. Hvis det er muligt, udelad primersæt med en score under 80.
   2. For de tilbageholdte primersæt skal du identificere og kopiere ampliconen produceret af amplifikationsprimerne.
   3. Juster de producerede ampliconer med hele genomet af organismen, der skal genotypes ved hjælp af NCBI Blast ved hjælp af online indsendelsesportalen på https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Vælg følgende i rullemenuerne under indsendelse:
      1. Vælg database | Genomiske + transkriptionsdatabaser.
      2. Vælg Menneske eller Mus i rullemenuen, afhængigt af den analyserede SNP.
      3. Vælg Optimer til | Noget lignende sekvenser (Blastn).
   4. (Valgfrit) Hvis der genotypebestemmes en organisme, der ikke er en mus eller et menneske, skal du vælge følgende under indsendelsen:
      1. Vælg database | Standard database.
      2. Vælg RefSeq-repræsentative genomer i rullemenuen
      3. Vælg Optimer til | Noget lignende sekvenser (Blastn)
   5. Når det er muligt, udelades amplicons, der har perfekt homologi til mtDNA-amplicon, især hvis primerbindingsregionerne er perfekt homologe (se diskussionen).
      BEMÆRK: BLAST-justeringsværktøjet returnerer enhver sekvens med betydelig homologi til forforstærkningsforstærkerne. Dette giver mulighed for påvisning af de NUMT'er, der er beskrevet i indledningen, som, hvis de ikke tages i betragtning, kan fremkalde en bias, da de forstærkes sammen med mitokondrie-DNA'et.
   6. Bestil oligoerne opnået via denne rørledning. Sørg for, at 5' biotinmodifikation tilsættes til den korrekte amplifikationsprimer under synteserækkefølgen, således at sekventeringsprimeren vil være komplementær til den biotinylerede streng.
      BEMÆRK: Valget af sekventeringsprimer er mere fleksibelt end forstærkningsprimerne, og det anbefales at have mindst en base, der adskiller 3'-enden af sekventeringsprimeren og den variable position.

2. PCR-optimering af forforstærkning

1. DNA-prøverne fremstilles ved at ekstrahere det samlede genomiske DNA ved hjælp af en passende metode.
   BEMÆRK: Dette afhænger i høj grad af antallet af celler, der genotypes og deres oprindelse. Hvis DNA isoleres fra enkeltceller ved hjælp af en lysisbuffer indeholdende proteinase K, skal prøven denatureres ved 95 °C i 10 minutter for ikke at forstyrre polymerasen under den efterfølgende PCR.
2. PCR-opsætning og termiske blokindstillinger
   1. Opsæt PCR med en high-fidelity-polymerase efter eget valg. Forbered en Master Mix til fire reaktioner. Da der kun kræves 10 μL PCR-reaktion til en pyrosekventering under fremstilling, fremstilles 25 μL PCR-reaktioner (om nødvendigt for at muliggøre en teknisk gentagelse). Brug 40 cyklusser PCR med ca. 10 ng genomisk DNA som udgangsmateriale med 1 μM af både fremadgående og omvendte primere.
   2. Indstil forlængelsestiden i henhold til producentens specifikationer for den anvendte polymerase under hensyntagen til længden af de valgte forforstærkningsprimere.
   3. Brug en termisk cyklist med variable udglødningstemperaturindstillinger. Da udglødningstemperaturen kan variere afhængigt af primersekvensen, programmerer saltindholdet i polymerasebufferen og andre faktorer fire forskellige udglødningstemperaturer i det termiske cyklusprogram.
      BEMÆRK: Det arbejdede eksempel i de repræsentative resultater brugte følgende temperaturer: 55 °C, 60 °C, 65 °C og 70 °C.
   4. Opdel Master Mix i fire 200 μL PCR-rør, og indstil dem til at køre ved hver af de fire valgte udglødningstemperaturer i den termiske cyklist i 40 cyklusser.
3. Visualisering af forforstærkningsbånd
   1. Under PCR-kørslen fremstilles en 2% (w/v) agarosegel i 1x TBE med SYBR Safe eller ethidiumbromid som visualiseringsmiddel.
      BEMÆRK: En højere procentdel gel anbefales til visualisering, da de forstærkede fragmenter normalt er korte, typisk fra 100 til 500 basepar.
   2. Når PCR i trin 2.2 er afsluttet, blandes 10 μL af reaktionen med en passende mængde DNA-belastningsbuffer og køres på 2% agarosegelen ved 7 V/cm i ca. 45 minutter.
   3. Visualiser de resulterende DNA-fragmenter på en UV-transilluminator.
      BEMÆRK: De termiske cykelbetingelser, der er valgt til forforstærkningstrinnet, skal producere et enkelt rent bånd med den forventede størrelse. Lavere udglødningstemperaturer kan lejlighedsvis resultere i forstærkning uden for målet, hvilket kan introducere forstyrrelser i den efterfølgende pyrosekventering .
   4. Vælg den laveste udglødningstemperatur, der giver et rent bånd af den korrekte størrelse til efterfølgende forstærkninger.
   5. (Valgfrit) Punktafgifter et bånd af den forventede størrelse, rens ved hjælp af et gelekstraktionssæt efter eget valg og analyser ved Sanger-sekventering for at bekræfte den omtrentlige heteroplasmi af prøven som reference.

3. Instrumentopsætning og kørsel

BEMÆRK: Når PCR-trinnet i det foregående afsnit er optimeret, involverer det næste trin programmering af pyrosequenceren med den korrekte nukleotidsekvens til analyse for den specifikke SNP. Dette indebærer indtastning af 10 baser direkte nedstrøms for 3'-enden af sekventeringsprimeren. Dette er detaljeret beskrevet i det følgende afsnit.

1. Assay konfiguration
   1. Åbn kørselssoftwaren, der følger med pyrosequenceren, og vælg Nyt assay i øverste venstre hjørne af grænsefladen.
   2. Vælg skabelonen Allele kvantificeringsassay .
   3. Indtast sekvensen, der skal analyseres, i den tilsvarende boks ved at indtaste nukleotiderne, der skal inkorporeres direkte nedstrøms for sekventeringsprimeren, som skal være opstrøms for SNP af interesse. For den variable position angives de to mulige baser adskilt af en skråstreg (f.eks. A / T).
   4. Tryk på Generer dispensationsordre, og lad softwaren automatisk bestemme en passende rækkefølge for nukleotiderne, der skal dispenseres i sekventerings-ved-syntese-reaktionen.
   5. Gem og angiv et navn til analysen.
2. Forberedelse og opbevaring af reagens
   1. Fortynd sekventeringsprimeren bestilt til 4 μM i udglødningsbufferen, der leveres i pyrosequencer-reagenssæt.
      BEMÆRK: Sekventeringsprimeren kan først fortyndes i vand til 100 μM som stamopløsning og derefter fortyndes yderligere i udglødningsbuffer til 4 μM efter behov.
   2. Forberedelse og håndtering af enzymer og substrater
      1. Ved første udpakning opløses det frysetørrede enzym og substrat i henhold til producentens anbefalinger. Opbevares ved -20 °C, når den ikke er i brug.
      2. Efter efterfølgende brug optøs hætteglassene med enzym og substrat fra -20 °C.
         BEMÆRK: Alle de andre reagenser i det medfølgende sæt kan opbevares nedkølet ved 4 °C. Fortyndede sekventeringsprimere kan også opbevares ved 4 °C.
   3. Anbring den nødvendige mængde af hvert reagens på is.
   4. Opbevar de resterende nødvendige komponenter, nemlig de streptavidinbelagte magnetperler, absorberstrimler og pyrosekventering ved 4 °C.
3. Kør udførelse
   BEMÆRK: Når et assay først designes, skal det kalibreres ved hjælp af PCR-produkter med kendt heteroplasmi, hvilket sikrer, at analysen nøjagtigt kan skelne heteroplasmier. Forskere kan bruge blandinger af PCR-produkter af kendt heteroplasmi som standarder. Prøver kan også verificeres ved hjælp af andre metoder, der er nævnt i indledningen og diskussionen, navnlig NGS.
   1. Fortynd DNA'et, der skal analyseres til 5 ng / μL. Især i den første kørsel skal du sørge for at inkludere prøver af kendt heteroplasmi som reference og / eller vildtypeprøver.
   2. Der udføres en prækventering af PCR på 5 μL fortyndet DNA i 25 μL reaktioner ved hjælp af amplifikationsprimere og parametre identificeret i afsnit 1 og 2. Udfør tekniske PCR-replikater for hver prøve.
      BEMÆRK: Præamplifikations-PCR'en kan opbevares kortvarigt ved 4 °C eller langvarig ved -20 °C, før den fortsættes til sekventering.
   3. Kør filopsætning
      1. Vælg Ny kørsel i øverste venstre hjørne af pyrosequencer-softwaren.
      2. Pyrosequenceren kan samtidig sekvensere 48 separate forstærkede reaktioner, hvor en tom firkant repræsenterer en enkelt sekventeringsbrønd på en pyrosekventering disk. Indlæs de analyser, der er konfigureret i afsnit 3.1, ved at højreklikke på en firkant og vælge indlæs assay. Hvis det er nødvendigt, sekvenseres op til fire separate assays med forskellige sekventeringsprimere.
      3. Indstil primerdispensationstilstanden til Automatisk for automatisk at tildele et injektionskammer for hver sekventeringsprimer, der bruges til kørslen.
      4. Indstil kørselstilstand til Standard , medmindre du kører fire forskellige typer assays på en sekventeringsdisk.
      5. Sørg for, at antallet af assays på kørselsskabelonfilen svarer til antallet af PCR-reaktioner, der forstærkes.
         BEMÆRK: Hvis der køres mere end 48 eksempler, skal der konfigureres yderligere kørselsfiler.
      6. Gem de kørende filer på et USB-drev.
   4. Priming af pyrosequenceren
      1. Tryk på knappen Rengøring på enhedens primære berøringsskærm, og rengør alle injektorer med vand med høj renhed ved at følge instruktionerne på skærmen. Når du sætter absorberstrimlen i maskinen, skal du sikre dig, at enderne mødes i positionen "9 o'clock" (direkte til venstre for midten).
      2. Tilslut USB-nøglen med de kørsler, der blev konfigureret i trin 3.3.3, og indlæs de kørselsfiler, der er defineret i trin 3.3.3.
         BEMÆRK: De kørende filer skal gemmes uden for enhver mappe eller mappe på USB, ellers kan de ikke læses af maskinen.
      3. Følg instruktionerne på enheden for at ilægge og prime reagenserne efter behov i de tilsvarende injektorer på maskinen.
   5. Prøvediskforberedelse og analyselancering
      1. Lad de streptavidinbelagte magnetiske perler ekvilibrere til stuetemperatur.
         BEMÆRK: Disse perler gør det muligt for enheden at fange den biotinylerede streng fra PCR-trinnet til forforstærkning. De skal købes separat fra sættet.
      2. Læg 3 μL perler i de huller, der er defineret i kørselsfilen fra trin 3.3.3.
      3. Der fyldes 10 μL af hver PCR-reaktion, der skal sekventeres, i den tilsvarende prøve, og pipetten lægges op og ned for at blande prøven med magnetperlerne. Undgå bobler, hvis det er muligt.
      4. Se efter indikationen i den grundede pyrosequencer om, at disken kan indlæses i maskinen. Skru pladen, der holder møtrikken, af, inden den ilagte prøveplade justeres med metalstiften i diskrummet.
      5. Når pladen er skruet ordentligt ind i pladerummet, skal du starte sekventeringskørslen ved at trykke på startknappen på berøringsskærmens grænseflade.

4. Erhvervelse af resultater

1. Når kørslen er fuldført, skal du fjerne USB-drevet fra maskinen og sætte det tilbage i computeren, der kører pyrosequencer-softwaren. Mens du fortsætter med følgende trin, skal du fortsætte med at rengøre pyrosequenceren efter vejledningen, hvis det er dagens sidste kørsel.
2. Vent på, at den nyligt genererede kørselsfil vises på USB-drevet, og dobbeltklik på kørselsresultatfilen. Dette analyserer automatisk luciferaseoutputtet fra hver brønd ved nukleotidinkorporering og kvantificerer mitokondrieallel af interesse defineret under assaykonfigurationen i afsnit 3.1.
3. Se efter følgende farvescorer vist af softwaren baseret på kvaliteten af læsningerne. Blå angiver et optimalt løb, gult et løb med en advarsel og rødt et mislykket løb. Hvis du vil gemme resultaterne, skal du vælge Rapporter i det øverste vindue | Fuld rapport for at generere en .pdf fil, der indeholder pyrogrammerne og resultaterne fra hver brønd i kørslen. Alternativt kan du downloade resultaterne i andre formater under fanen Rapporter .

Representative Results

Dette afsnit præsenterer et eksempel på optimering af et pyrosekventering assay for en human patogen mtDNA-mutation samt sekventeringsdata fra genotypning af heteroplasmatiske (m.5024C>T) museembryonale fibroblaster (MEF'er) behandlet med mitokondrie zinkfingernukleaser (mtZFN'er). Optimering af analysen for humane celler og sammenligning af to forskellige assays viser, hvordan man vælger den mest nøjagtige, mens genotypning af genetisk modificerede MEF-celler i det andet eksempel tjener som et anvendt eksempel på påvisning af heteroplasmiskift efter genterapiintervention.

Human m.3243A>G mutation
Dette eksempel illustrerer genotypningen af en almindelig patogen variant af mtDNA-m.3243A>G. Den almindelige m.3243A>G-mutation ligger til grund for flere kliniske sygdomme, navnlig mitokondriel encefalopati, laktatacidose og slagtilfældelignende episoder (MELAS), maternelt arvelig døvhed og diabetes (MIDD) og progressiv ekstern oftalmoplegi (PEO)²³. Dette assay kan også anvendes til at genotypebestemme den mindre almindelige m.3243A>T-variant²⁴ ved at omprogrammere sekvensen af nukleotider, der skal inkorporeres, som beskrevet i protokollens afsnit 3.1.3.

Efter retningslinjerne for primeroptimering i afsnit 1 blev følgende primersæt valgt, et for begge strenge:

Indhold 1:

Fremad: 5' - [Biotin] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Baglæns: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Sekvens af handlinger: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'

Amplicon størrelse: 215 bp

Indhold 2:

Fremad: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Baglæns: 5' - [Biotin] GTTGGCCATGGGTATGTTGTT- 3'
Sekvens af handlinger: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'

Amplicon størrelse: 182 bp

For at bestemme de termiske cyklusbetingelser for analysen blev en termisk gradient PCR ved anvendelse af en Hot Start-polymerase (se materialetabellen) først udført og analyseret ved elektroforese efter afsnit 2. Fyrre cyklusser blev brugt til at amplificere ca. 10 ng DNA som startskabelon. Efter trinnene i afsnit 2.3 i protokollen blev der udført en agarosegelelektroforese for at verificere specificiteten af amplifikationsprotokollen ved en given udglødningstemperatur (figur 2A). Vellykkede bånd af de korrekte størrelser (enten 215 bp eller 182 bp) kunne observeres ved alle temperaturer; De lavere udglødningstemperaturer i analyse 1 resulterede imidlertid i forstærkning uden for målet. Den korrekte udglødningstemperatur for forforstærkning blev fastsat til 70 °C (figur 2A). For at fastslå nøjagtigheden af begge assays og vælge den bedste blev molære standarder for kendt m.3243A>G-procent genereret ved at blande passende mængder rent PCR-produkt i forskellige forhold: henholdsvis 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% og 100% m.3243A>G (figur 2B, stiplet linje). Ved udførelse af begge assays på standarderne observerede vi en større korrelation med det forventede resultat i Assay 2 (figur 2B). Vi brugte derefter begge assays på m.3243A>G cybridceller i et genotypeeksperiment og observerede en udtalt bias i assay 1, især nær homoplasmatiske forhold (figur 2C).

Murin m.5024C>T mutation
Dette eksempel involverer MEF-celler behandlet med mtZFN'er udviklet til at reducere niveauet af m.5024C>T-mutation¹² som et eksempel på et mitokondrie-genterapieksperiment, hvor genotypning ved pyrosekventering er nyttig som en kvantitativ sammenligning mellem prøver. MEF-cellerne stammer fra en offentliggjort musemodel, der indeholder en C>T-mutation i position 5,024 i musens mtDNA (m.5024C>T)²⁵. Eksperimentet involverede elektroporering af MEF'erne med plasmider, kodning af mtZFN'er og forskellige fluorescerende reportere og efterfølgende sortering af cellerne, der udtrykker plasmiderne ved FACS efter 24 timer. Cellerne fik derefter lov til at komme sig i 2 uger før heteroplasmi sammenligning ved pyrosekventering .

Primersættet, der blev brugt til sekventering af m.5024C>T-positionen, var som følger:

Fremad: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Baglæns: 5' - [Biotin] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
Sekvens af handlinger: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'

Amplicon størrelse: 267 bp

Prøverne blev sekventeret i teknisk tredobbelt for at øge resultaternes troskab. Eksperimentet blev også udført i biologisk duplikat, hvilket gav seks separate værdier for hver af betingelserne (figur 3B). Data fra 2 af de 18 pyrogrammer blev brugt til at konstruere figur 3B; disse pyrogrammer er vist i figur 3A.

Figur 1: Skemaer, der repræsenterer mitokondriesekvenser i en celle og den generelle tekniske oversigt over pyrosekventering (A) Skematisk gengivelse af mitokondrie-DNA og nukleare mitokondriesekvenser. Figuren repræsenterer den evolutionære oprindelse af høje homologisekvenser. B) Skematisk gengivelse af pyrosekventering assayrørledningen med en afsluttende eksempelsekvens, der viser en omtrentlig 50% C>G heteroplasmiværdi. Skabelon-DNA forstærkes først af udvalgte amplifikationsprimere, hvoraf den ene biotinyleres på 5'-enden. Efter amplifikation bevarer pyrosequenceren en enkelt DNA-streng som skabelon til sekventering ved hjælp af streptavidin-belagte magnetiske perler, vist i blåt. Endelig tillader en sekventeringsprimer sekventering ved syntese af en foruddefineret serie nukleotider, der genererer et pyrogram, der er skematisk repræsenteret. Støkiometrierne for hver base opnås let ved at sammenligne de relative tophøjder ved hver inkorporeringsbegivenhed: det samme nukleotid to gange i træk vil generere en dobbelt top sammenlignet med en enkelt base. Skråstregen i den sekvens, der skal analyseres, angiver den hypotetiske SNP, som kunne være "C" eller "G". Bemærk den oprindelige dispensation af en mock "G" base på x-aksen af pyrogrammet, som typisk udføres af pyrosequenceren som en negativ kontrol. Forkortelser: mtDNA = mitokondrie-DNA; NUMT'er = nukleare mitokondriesekvenser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Optimering af pyroseprimersættet som illustreret på den humane m.3242A>G-mutation. (A) Agarosegelelektroforese (2% w/v) af en PCR-amplifikation ved anvendelse af amplifikationsprimere fra begge sæt udvalgt til m.3242A>G-mutationen. WT betegner vildtypekontrol-DNA, mens Het er den næsten homoplasmatiske m.3243A>G-prøve, der skal analyseres. Temperaturerne er den udglødningstemperatur, der anvendes i en 40 cyklus PCR-reaktion. (B). En sammenligning af ydeevnen for begge primersæt ved hjælp af molære kalibreringsstandarder, som blev opnået ved at blande forskellige forhold mellem ren vildtype og ren mutant m3243A>G-produkt. De målte værdier betegnes med de lodrette stiplede linjer. En X = Y lineær funktion vises for at illustrere, hvor tæt hver af de to testede assays er på en ideel måling. Navnene på cellelinjerne på x-aksen er navnene på de forskellige cybridkloner, der blev genotypet ved hjælp af dette assay. C) Genotypebestemmelse af fire cybridkloner af ukendt m.3243A>G heteroplasmi ved anvendelse af begge assays. Sekventering blev udført i teknisk tredobbelt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Heteroplasmimåling på FACS-sorterede m.5024C>T MEF'er behandlet med mtZFN-genredigeringsteknologi . A) Pyrogrammer fra to MEF-celleprøve-PCR-replikater anvendt til generering af figur 3B samt kontrol af vildtypegenotype. Luminescensværdierne på Y-aksen er i A.U. (B) Genotyperesultater af mtZFN-behandlede celler sammen med ubehandlede og mock-behandlede kontroller. MEF'erne blev elektroporeret med plasmider, der koder for mtZFN'er og forskellige fluorescerende reportere og efterfølgende sorteret efter FACS efter 24 timer. Cellerne fik derefter lov til at komme sig i 2 uger før heteroplasmi sammenligning ved pyrosekventering . Fejlbjælkerne blev beregnet med biologiske duplikater, som hver især gennemgik pyrosekventering i teknisk tredobbelt. Forkortelser: FACS = fluorescensaktiveret cellesortering; MEF = embryonale fibroblaster hos mus mtZFN = mitokondriel zinkfingernuklease; A.U. = vilkårlige enheder. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Et kritisk aspekt for protokollens succes er at undgå kontamineringer, især når der anvendes små mængder udgangsmateriale. Det anbefales at bruge en UV-hætte og filtrerede pipettespidser, når prøverne forberedes, hvor det er muligt, samt at holde områderne med forforstærkning og efterforstærkning adskilt. Blindprøver og prøver af kendt heteroplasmi (såsom vildtype-DNA) bør altid medtages for at blive brugt som benchmarks til kontrol af teknisk eller biologisk bias.

En bemærkelsesværdig teknisk bias, der er forbundet med analysen, er det øgede selvlysende signal produceret af den analoge adenininkorporering. Når adenin anvendes i en variabel position, producerer den ofte en resterende fluorescerende top (f.eks. Figur 2C). Det er af denne grund, at det anbefales at køre pyrosekventering assays på den modsatte streng (hvor en thymin vil blive inkorporeret), når det er muligt for at undgå at skulle inkorporere adeninanalogen i den variable position. I tilfælde af A>T- eller T>A-mutationer er dette imidlertid umuligt. Ikke desto mindre, som det fremgår af de repræsentative resultater, kan et passende valg af primere være af større betydning ved design af et assay. Indhold 2 for m.3243A>G-mutationen i første afsnit af de repræsentative resultater, sekvenser baseret på A/G-forholdet i den variable position i modsætning til analyse 1, som måler T/C-forholdet. På trods af at det er modtageligt for adeninininkorporeringsbias, leverer assay 2 mere nøjagtige resultater baseret på sammenligningen med de molære standarder, som vist ved en simpel lineær regressionsanalyse (figur 2B).

Bias er primært resultatet af NUMT co-amplification³. Det store mitokondriekopinummer forhindrer typisk nukleare off-target-sekvenser i at indføre nogen signifikant bias; visse regioner af mtDNA er dog til stede i mange NUMTS og bør undgås ved hjælp af de metoder, der er angivet i protokollen under afsnit 1.

Når du tager de ovennævnte forholdsregler, er denne metode et meget modulært, hurtigt og omkostningseffektivt middel til genotypebestemmelse af SNP'er i mtDNA. Metoden er imidlertid ikke egnet til alle mitokondriegenotypeapplikationer, især store deletioner, hvor digital dråbe-PCR anbefales²⁶. Variabilitet i sekvenserens udlevering af reagenser eller forskellige primere/amplifikationsbetingelser kan føre til, at der indføres små skævheder. Det er derfor, at tekniske triplicater normalt anbefales for at bekræfte rigtigheden af genotyperesultaterne. En anden begrænsning af tilgangen er omfanget, da kun korte, foruddefinerede spændvidder af mtDNA kan genotypes. Mens pyrosequencere kan programmeres til at sekvensere hundredvis af basepar af ukendt sekvens, bliver dette hurtigt mindre omkostningseffektivt end at bruge en NGS-tilgang. Forskere kunne oprindeligt implementere pyrosequencing som en hurtig genotypemetode, der giver et præcist kvantitativt svar, men kunne efterfølgende analysere udvalgte prøver af NGS for yderligere præcision og kontekst.

Afslutningsvis forbliver denne veletablerede metode en hæfteklammer i mitokondriel genetisk forskning, der giver hurtig og enkel adgang til kvantitative heteroplasmimålinger, der er nøglen i mange forskningssammenhænge på området, såsom patientdiagnose, genterapi eller genotypning af dyremodeller.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD Hot Start DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set	QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disks	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Magnetic beads	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 Software License (1)	QIAGEN	9024325