Summary
Pyrosequencing assays maken de robuuste en snelle genotypering van mitochondriaal DNA single nucleotide polymorfismen in heteroplasmatische cellen of weefsels mogelijk.
Abstract
Mutaties in het mitochondriale genoom (mtDNA) zijn in verband gebracht met maternaal overgeërfde genetische ziekten. De belangstelling voor mtDNA-polymorfismen is de afgelopen jaren echter toegenomen vanwege het recent ontwikkelde vermogen om modellen te produceren door mtDNA-mutagenese en een nieuwe waardering van de associatie tussen mitochondriale genetische afwijkingen en veel voorkomende leeftijdsgerelateerde ziekten zoals kanker, diabetes en dementie. Pyrosequencing is een sequencing-by-synthesis-techniek die op grote schaal wordt gebruikt in het mitochondriale veld voor routinematige genotyperingsexperimenten. De relatieve betaalbaarheid in vergelijking met massale parallelle sequencingmethoden en het gemak van implementatie maken het een onschatbare techniek op het gebied van mitochondriale genetica, waardoor de snelle kwantificering van heteroplasmie met verhoogde flexibiliteit mogelijk is. Ondanks de praktische bruikbaarheid van deze methode, vereist de implementatie ervan als een middel voor mtDNA-genotypering de observatie van bepaalde richtlijnen, met name om bepaalde vooroordelen van biologische of technische oorsprong te voorkomen. Dit protocol schetst de noodzakelijke stappen en voorzorgsmaatregelen bij het ontwerpen en implementeren van pyrosequencing assays voor gebruik in de context van heteroplasmiemeting.
Introduction
Het mitochondriale genoom bestaat in de vorm van kleine (16,5 kb) circulaire moleculen (mtDNA) aanwezig in het binnenste compartiment van de mitochondriën genaamd de matrix en codeert voor 13 subeenheden van de mitochondriale ademhalingsketen, evenals de tRNA's en rRNA's die nodig zijn voor hun vertaling in situ door het mitochondriale ribosoom1. Dit genoom vertegenwoordigt ongeveer 1% van alle eiwitten die nodig zijn voor de mitochondriale functie, waarvan de rest wordt gecodeerd door het nucleaire DNA (nDNA). Algemeen wordt aangenomen dat mitochondriën zijn afgeleid van een endosymbiotische fusiegebeurtenis tussen een alfa-proteobacteriële voorouder en een voorouderlijke eukaryote cel. Zodra deze hypothetische symbiose plaatsvond, werd de genetische informatie van de mitochondriën geleidelijk overgebracht naar de kern gedurende eonen, wat de bovengenoemde compactheid van het mtDNA verklaart in vergelijking met de genomen van moderne cyanobacteriën2. Een dergelijke overdracht van genen wordt het sterkst aangetoond door het bestaan van lange stukken nDNA die zeer homoloog zijn voor de sequenties in mtDNA. Deze nucleaire mitochondriale sequenties (NUT's) zijn een veel voorkomende bron van verkeerde interpretatie tijdens genotypering en bepaalde voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om nucleaire vooroordelen te voorkomen bij het genotyperen van mtDNA3 (figuur 1A).
Een ander onderscheidend kenmerk van mtDNA is dat het aantal kopieën varieert afhankelijk van het celtype, met een aantal van tienduizenden tot duizenden kopieën per cel4. Vanwege deze multi-copy aard kan mtDNA een breed scala aan genotypen binnen een enkele cel herbergen, wat kan resulteren in een meer continue verdeling van allelen in tegenstelling tot de discrete allelen geassocieerd met nucleaire genen bij het overwegen van de zygositeit van chromosomen. Deze heterogeniteit van mitochondriale allelen wordt mitochondriale heteroplasmie genoemd, die meestal wordt uitgedrukt in de procentuele prevalentie van een bepaalde mutatie als een percentage van het totale mtDNA in een bepaalde cel. Heteroplasmie kan worden vergeleken met homoplasmie, wat verwijst naar een unieke soort mtDNA die in een cel aanwezig is.
Het meten van mitochondriale heteroplasmie is van bijzonder belang bij het kwantificeren van het aandeel mtDNA-moleculen dat pathogene varianten herbergt. Dergelijke varianten komen voor in de vorm van single nucleotide polymorphisms (SNP's), kleine indebellen of grootschalige deleties5. De meeste mensen zijn heteroplasmatisch voor pathogene varianten; ze vertonen echter geen klinische fenotypen, die zich vaak alleen manifesteren bij hogere heteroplasmieniveaus van pathogeen mtDNA in een fenomeen dat het drempeleffect6 wordt genoemd. Hoewel de waarden geassocieerd met pathogeniciteit sterk afhankelijk zijn van de aard van de pathogene mutatie en het weefsel waarin deze optreedt, liggen ze meestal boven 60% heteroplasmie7.
Er zijn verschillende onderzoeksgebieden waarin mitochondriale genotypering veel voorkomt. Op medisch gebied kan het testen op of kwantificeren van mtDNA-mutaties dienen als een diagnostisch criterium voor mitochondriale ziekten, waarvan vele mtDNA-afwijkingen als oorsprong hebben5. Naast de studie van menselijke pathogene mutaties, zal de prevalentie van diermodellen met pathogene SNP's in het mtDNA waarschijnlijk toenemen, gezien de recente komst van mitochondriale basenbewerking mogelijk gemaakt door mitochondriaal gerichte DddA-afgeleide cytosine-base editors (DdCBEs)8 en TALE-gebaseerde deaminasen (TALEDs) voor adenine base editing9. Deze benadering zal een belangrijke rol spelen bij het begrijpen van de wisselwerking tussen afwijkende mitochondriale genotypen en de resulterende disfuncties. Er is ook lopend wetenschappelijk onderzoek naar het hermodelleren van het mitochondriale genoom voor ultiem gebruik als een therapeutische strategie bij menselijke mitochondriale ziekten via een benadering die bekend staat als heteroplasmieverschuiving. Dit onderzoeksgebied omvat voornamelijk het richten van mutatiespecifieke nucleasen op de mitochondriale matrix; dit resulteert in de preferentiële afbraak van pathogeen mtDNA, wat leidt tot reddingen in fenotype10,11,12,13. Alle experimenten met betrekking tot de remodellering van het mitochondriale genotype vereisen een robuuste kwantitatieve methode om heteroplasmieverschuivingen te beoordelen.
Een breed scala aan methoden wordt gebruikt om mtDNA te genotyperen, en deze variëren afhankelijk van de aard van de mutatie. Next-generation sequencing (NGS) methoden zijn nauwkeuriger als het gaat om het kwantificeren van SNP's in mtDNA; Deze methoden blijven echter onbetaalbaar voor de routinematige kwantificering van mitochondriale heteroplasmie, vooral als het aantal monsters klein is. Sanger-sequencing kan ook de detectie van SNP's mogelijk maken; Deze benadering is echter niet kwantitatief en slaagt er vaak niet in om lage niveaus van heteroplasmie te detecteren of kan onnauwkeurig zijn bij het schatten van hoge heteroplasmieën. Pyrosequencing, als een test die minimale voorbereiding vereist en de snelle kwantificering van heteroplasmie voor elk mtDNA-monster mogelijk maakt, wordt voorgesteld als een geschikt compromis tussen deze twee uitersten. Deze methode is routinematig gebruikt om mitochondriale SNP's te kwantificeren door tal van onderzoekers in verschillende contexten, waaronder forensische analyse 14,15, klinische diagnose16 of de genotypering van mtDNA uit afzonderlijke cellen17.
Deze test omvat een eerste PCR-preamplificatiestap van een gebied dat de SNP in het mtDNA flankeert, gevolgd door een sequencing-by-synthesis assay met behulp van één streng van het eerder gegenereerde amplicon. Een van de twee primers die in de voorversterkerstap worden gebruikt, moet aan het 5'-uiteinde worden gebiotinyleerd, waardoor het pyrosequencing-apparaat de enkele DNA-streng kan isoleren om als sjabloon voor de sequencingreactie te worden gebruikt. Een derde sequencing primer wordt vervolgens uitgegloeid op de vastgehouden gebiotinyleerde streng, waardoor ontluikende DNA-synthese als deoxynucleotiden in een vooraf gedefinieerde volgorde in de reactiekamer kan worden gedoseerd. De pyrosequencer registreert de hoeveelheid van elke opgenomen base op basis van een luminescerende uitlezing, waardoor de relatieve kwantificering van mutante en wild-type mitochondriale allelen bij DNA-synthese mogelijk is (figuur 1B). De luminescentie wordt gegenereerd door een luciferase-enzym, dat licht uitzendt in aanwezigheid van ATP dat een ATP-zwavelylase de novo synthetiseert bij elke incorporatiegebeurtenis van de pyrofosfaten die door elk nucleotide worden vrijgegeven. Deze twee reacties kunnen als volgt worden samengevat:
1. PPi (van nucleotide-incorporatie) + APS → ATP + sulfaat (ATP-zwavelylase)
2. ATP + luciferine + O 2 → AMP + PPi + oxyluciferine + CO2 + licht (luciferase)
Het detecteren van adeninebasen door de pyrosequencer zonder ATP-kruisreactie met de luciferase in de tweede reactie is een uitdaging. Dit wordt echter opgelost door een adenine-analoog te gebruiken voor DNA-synthese, namelijk dATPαS. Ondanks dat het geen perfect substraat is voor luciferase, produceert het een sterkere luminescentie in vergelijking met de drie andere nucleotiden, die digitaal wordt aangepast door de pyrosequencer en ingesteld op een factor 0,9. Vanwege deze inherente variabiliteit wordt voorgesteld om sequencing adenine op de SNP-positie te vermijden (zie de discussie voor meer informatie).
Het volgende protocol beschrijft de methode van mtDNA-heteroplasmiebeoordeling door pyrosequencing en schetst de nodige voorzorgsmaatregelen bij het ontwerpen van de amplificatieprimers om biologische of technische vertekening te voorkomen bij het genotyperen van SNP's in mtDNA. Dit laatste omvat het digitaal inmeten en selecteren van de primersets, het optimaliseren van de pcr voor voorversterking en ten slotte het sequencen en verfijnen van de test. Twee toegepaste voorbeeldtests worden gedemonstreerd: ten eerste, de optimalisatie van de meest voorkomende menselijke pathogene variant m.3243A>G18, en ten tweede, de genotypering van muis embryonale fibroblast (MEF) cellen die heteroplasmieverschuiving hebben ondergaan met behulp van technologieën ontwikkeld in het Minczuk-laboratorium in Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Geïnformeerde toestemming werd gegeven voor het gebruik van de menselijke 3243A>G cybride cellen en de onsterfelijke m.5024C>T MEF's die in deze studie werden gebruikt. Ethische goedkeuring was in dit geval niet vereist, omdat de cellen van de patiënt niet werden verzameld aan de Universiteit van Cambridge. Het gebruik van menselijke fibroblasten kan echter ethische goedkeuring vereisen. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de beste praktijken voor PCR-instellingen te volgen bij het voorbereiden van het monster-DNA voor pyrosequencing. Frequente versterking met behulp van identieke primers kan leiden tot ampliconbesmetting en vertekening introduceren in de daaropvolgende genotypering als een strikte scheiding tussen de pre-PCR- en post-PCR-gebieden niet wordt waargenomen. De hier gepresenteerde pijplijn maakt gebruik van specifieke apparatuur van een enkele fabrikant; de details zijn te vinden in de Materiaaltabel. Het primerontwerp voor de PCR kan desgewenst handmatig worden uitgevoerd; het wordt echter aanbevolen om hiervoor bestaande software te gebruiken (zie de Materiaaltabel).
1. Pyrosequencing primer ontwerp en assay selectie
- Het verkrijgen van primer kandidaten met software
- Verkrijg een mtDNA-sequentiebestand voor de soort die wordt gegenotypeerd en identificeer de positie van de SNP. Zorg ervoor dat de gebruikte referentiesequentie de juiste basisnummering voor de bestudeerde mutatie gebruikt, zodat de positie van de SNP gemakkelijk kan worden geïdentificeerd.
- Kopieer 1.000 basenparen stroomopwaarts en stroomafwaarts van de SNP-site en plak de afgekapte reeks in de software die bedoeld is voor het ontwerp van de pyrosequencingprimer (zie de materiaaltabel).
- Stel de geanalyseerde SNP-basis in als het doel van de pyrosequencing-test in de software door de polymorfe basis te markeren en met de rechtermuisknop te klikken op en vervolgens het doelgebied in te stellen.
- Druk op het afspeelpictogram in de rechterbovenhoek van de interface om de primerselectie te starten.
- Wacht tot de software nu automatisch primertrio's genereert: twee primers voor voorversterking van het sjabloon-DNA en een derde primer voor sequencing door synthese in de pyrosequencingmachine. Behoud alle primersets door met de rechtermuisknop op alle primersets te klikken en deze te selecteren.
- De optimale primersets selecteren uit de gegenereerde lijst
- Behoud de primersets met de hoogste kwaliteitsscore op basis van de software-uitvoer, die primersets in aflopende volgorde biedt op basis van de kwaliteitsscore. Laat indien mogelijk primersets weg met een score onder de 80.
- Voor de bewaarde primersets identificeert en kopieert u het amplicon dat door de amplificatieprimers wordt geproduceerd.
- Stem de geproduceerde amplicons af op het volledige genoom van het te gegenotyperen organisme met behulp van NCBI Blast met behulp van het online indieningsportaal op https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Selecteer in de vervolgkeuzemenu's tijdens het indienen het volgende:
- Selecteer Database | Genomische + Transcript databases.
- Selecteer Mens of Muis in het vervolgkeuzemenu, afhankelijk van de geanalyseerde SNP.
- Selecteer Optimaliseren voor | Enigszins vergelijkbare sequenties (Blastn).
- (Optioneel) Als u een ander organisme dan een muis of mens genotypeert, selecteert u tijdens het indienen het volgende:
- Selecteer Database | Standaard database.
- Selecteer RefSeq Representatieve genomen in het vervolgkeuzemenu
- Selecteer Optimaliseren voor | Enigszins vergelijkbare sequenties (Blastn)
- Laat indien mogelijk amplicons weg die een perfecte homologie hebben aan het mtDNA-amplicon, vooral als de primerbindingsgebieden perfect homoloog zijn (zie de discussie).
OPMERKING: De BLAST-uitlijningstool retourneert elke reeks met aanzienlijke homologie naar de voorversterkingsamplicons. Dit maakt de detectie mogelijk van de NUMTs beschreven in de inleiding, die, als er geen rekening mee wordt gehouden, een vertekening kunnen veroorzaken omdat ze samen met het mitochondriale DNA worden versterkt. - Bestel de oligo's verkregen via deze pijplijn. Zorg ervoor dat 5' biotinemodificatie wordt toegevoegd aan de juiste amplificatieprimer tijdens de synthesevolgorde, zodat de sequencingprimer complementair is aan de gebiotinyleerde streng.
OPMERKING: De keuze van sequencing primer is flexibeler dan de amplification primers, en het wordt aanbevolen om ten minste één basis te hebben die het 3'-uiteinde van de sequencing primer en de variabele positie scheidt.
2. Voorversterking PCR optimalisatie
- Bereid de DNA-monsters voor door het totale genomische DNA te extraheren met behulp van een geschikte methode.
OPMERKING: Dit hangt grotendeels af van het aantal cellen dat wordt gegenotypeerd en hun oorsprong. Bij het isoleren van DNA uit afzonderlijke cellen met behulp van een lysisbuffer die proteïnase K bevat, moet het monster gedurende 10 minuten bij 95 °C worden gedenatureerd om het polymerase tijdens de daaropvolgende PCR niet te verstoren. - PCR-instelling en thermische blokinstellingen
- Stel de PCR in met een high-fidelity polymerase naar keuze. Bereid een Master Mix voor vier reacties. Aangezien slechts 10 μL PCR-reactie nodig is voor een pyrosequencing run, bereidt u 25 μL PCR-reacties voor (om indien nodig een technische herhaling mogelijk te maken). Gebruik 40 cycli PCR met ongeveer 10 ng genomisch DNA als uitgangsmateriaal met 1 μM van zowel de voorwaartse als de omgekeerde primers.
- Stel de verlengingstijd in volgens de specificaties van de fabrikant voor het gebruikte polymerase, rekening houdend met de lengte van de gekozen voorversterkingsprimers.
- Gebruik een thermische cycler met variabele gloeitemperatuurinstellingen. Omdat de gloeitemperatuur kan verschillen afhankelijk van de primervolgorde, het zoutgehalte van de polymerasebuffer en andere factoren, programmeert u vier verschillende gloeitemperaturen in het thermische cyclusprogramma.
OPMERKING: In het bewerkte voorbeeld in de representatieve resultaten werden de volgende temperaturen gebruikt: 55 °C, 60 °C, 65 °C en 70 °C. - Splits de Master Mix in vier PCR-buizen van 200 μL en stel ze in op elk van de vier geselecteerde gloeitemperaturen in de thermische cycler gedurende 40 cycli.
- Voorversterkingsbandvisualisatie
- Bereid tijdens de PCR-run een 2% (w/v) agarosegel in 1x TBE met SYBR Safe of ethidiumbromide als visualisatiemiddel.
OPMERKING: Een gel met een hoger percentage wordt aanbevolen voor visualisatie, omdat de versterkte fragmenten meestal kort zijn, meestal variërend van 100 tot 500 basenparen. - Nadat de PCR in stap 2.2 is voltooid, mengt u 10 μL van de reactie met een geschikte hoeveelheid DNA-belastingbuffer en voert u de 2% agarose-gel gedurende ongeveer 45 minuten met 7 V/cm in.
- Visualiseer de resulterende DNA-fragmenten op een UV-transilluminator.
OPMERKING: De thermische cyclusomstandigheden die voor de voorversterkingsstap zijn geselecteerd, moeten een enkele schone band van de verwachte grootte produceren. Lagere gloeitemperaturen kunnen af en toe resulteren in off-target versterking, wat vooroordelen kan introduceren in de daaropvolgende pyrosequencing. - Selecteer de laagste gloeitemperatuur die een schone band van de juiste grootte produceert voor latere versterkingen.
- (Optioneel) Snijd een band van de verwachte grootte weg, zuiver met behulp van een gelextractiekit naar keuze en analyseer door Sanger-sequencing om de geschatte heteroplasmie van het monster als referentie te bevestigen.
- Bereid tijdens de PCR-run een 2% (w/v) agarosegel in 1x TBE met SYBR Safe of ethidiumbromide als visualisatiemiddel.
3. Instrument instellen en uitvoeren
OPMERKING: Zodra de PCR-stap in de vorige sectie is geoptimaliseerd, omvat de volgende stap het programmeren van de pyrosequencer met de juiste nucleotidesequentie om te analyseren voor de specifieke SNP. Dit omvat het invoeren van 10 bases direct stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van de sequencingprimer. Dit wordt in de volgende sectie beschreven.
- Testconfiguratie
- Open de run-software die bij de pyrosequencer is geleverd en selecteer New Assay in de linkerbovenhoek van de interface.
- Selecteer de sjabloon Allelkwantificeringstest .
- Voer de te analyseren sequentie in het overeenkomstige vak in door de nucleotiden in te typen die direct stroomafwaarts van de sequencingprimer moeten worden opgenomen, die stroomopwaarts van de SNP van belang moeten zijn. Geef voor de variabele positie de twee mogelijke bases aan, gescheiden door een schuine streep (bijvoorbeeld A/T).
- Druk op Dispensatievolgorde genereren en laat de software automatisch een geschikte volgorde bepalen voor de nucleotiden die moeten worden afgegeven in de sequencing-by-synthesis-reactie.
- Sla de test op en geef deze een naam op.
- Reagensbereiding en -opslag
- Verdun de bestelde sequencingprimer tot 4 μM in de gloeibuffer die in de pyrosequencer-reagenskit wordt geleverd.
OPMERKING: De sequencing primer kan eerst worden verdund in water tot 100 μM als stockoplossing en vervolgens verder worden verdund in gloeibuffer tot 4 μM indien nodig. - Enzym- en substraatpreparatie en -behandeling
- Los bij het eerste uitpakken het gelyofiliseerde enzym en substraat opnieuw op volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Bewaren bij −20 °C wanneer niet in gebruik.
- Ontdooi bij volgend gebruik de injectieflacons met enzym en substraat vanaf −20 °C.
OPMERKING: Alle andere reagentia in de meegeleverde kit kunnen gekoeld bij 4 °C worden bewaard. Verdunde sequencing primers kunnen ook op 4 °C worden gehouden.
- Plaats de benodigde hoeveelheid van elk reagens op ijs.
- Houd de overige benodigde componenten, namelijk de met streptavidin beklede magnetische kralen, absorberstrips en pyrosequencingschijven, op 4 °C.
- Verdun de bestelde sequencingprimer tot 4 μM in de gloeibuffer die in de pyrosequencer-reagenskit wordt geleverd.
- Uitvoering uitvoeren
OPMERKING: Wanneer een test voor het eerst wordt ontworpen, moet deze worden gekalibreerd met behulp van PCR-producten van bekende heteroplasmie, wat ervoor zorgt dat de test nauwkeurig heteroplasmieën kan onderscheiden. Onderzoekers kunnen mengsels van PCR-producten van bekende heteroplasmie als standaard gebruiken. Monsters kunnen ook worden geverifieerd met behulp van andere methoden die in de inleiding en de discussie worden genoemd, met name NGS.- Verdun het te analyseren DNA tot 5 ng/μL. Zorg er vooral in de eerste run voor dat u monsters van bekende heteroplasmie als referentie en/of wild-type monsters opneemt.
- Voer een presequencing PCR uit van 5 μL verdund DNA in 25 μL reacties met behulp van de amplificatieprimers en parameters geïdentificeerd in sectie 1 en sectie 2. Voer technische PCR-replica's uit voor elk monster.
OPMERKING: De voorversterkings-PCR kan op korte termijn bij 4 °C of op lange termijn bij −20 °C worden bewaard voordat tot sequencing wordt overgegaan. - Bestandsinstellingen uitvoeren
- Selecteer New Run in de linkerbovenhoek van de pyrosequencer-software.
- De pyrosequencer kan tegelijkertijd 48 afzonderlijke voorversterkte reacties sequencen, waarbij een leeg vierkant een enkele sequencingput op een pyrosequencingschijf vertegenwoordigt. Laad de in paragraaf 3.1 geconfigureerde assays door met de rechtermuisknop op een vierkantje te klikken en load assay te selecteren. Indien nodig, sequentieer maximaal vier afzonderlijke assays met verschillende sequencing primers.
- Stel de primerdispensatiemodus in op Automatisch om automatisch een injectiekamer toe te wijzen voor elke sequencingprimer die voor de run wordt gebruikt.
- Stel de uitvoeringsmodus in op Standaard , tenzij u vier verschillende typen tests uitvoert op één sequencingschijf.
- Zorg ervoor dat het aantal testen in het run-sjabloonbestand overeenkomt met het aantal PCR-reacties dat wordt versterkt.
OPMERKING: Als u meer dan 48 voorbeelden uitvoert, moeten extra uitvoerbestanden worden ingesteld. - Sla de uitgevoerde bestanden op een USB-station op.
- Priming van de pyrosequencer
- Druk op de knop Reinigen op het hoofdaanraakscherm van het apparaat en reinig alle injectoren met zeer zuiver water volgens de instructies op het scherm. Wanneer u de absorberstrip in de machine steekt, moet u ervoor zorgen dat de uiteinden elkaar ontmoeten in de "9 uur" -positie (direct links van het midden).
- Sluit de USB-stick aan met de runs die zijn ingesteld in stap 3.3.3 en laad de run-bestanden die zijn gedefinieerd in stap 3.3.3.
OPMERKING: De uitgevoerde bestanden moeten buiten een map of map op de USB worden opgeslagen, anders kunnen ze niet door het apparaat worden gelezen. - Volg de instructies op het apparaat om de reagentia naar behoefte te laden en te primen in de overeenkomstige injectoren op de machine.
- Voorbereiding van de monsterschijf en het starten van de test
- Laat de met streptavidin gecoate magnetische kralen in evenwicht komen tot kamertemperatuur.
OPMERKING: Met deze kralen kan het apparaat de gebiotinyleerde streng van de pcr-stap voorversterking opvangen. Ze moeten apart van de kit worden gekocht. - Laad 3 μL kralen in de putjes die zijn gedefinieerd in het run-bestand uit stap 3.3.3.
- Laad 10 μL van elke PCR-reactie die in het overeenkomstige monster moet worden gesequenced en pipetteer op en neer om het monster met de magnetische kralen te mengen. Vermijd bubbels indien mogelijk.
- Zoek naar de indicatie in de geprimeerde pyrosequencer dat de schijf in de machine kan worden geladen. Schroef de plaatbevestigingsmoer los voordat u de geladen monsterplaat uitlijnt met de metalen pen in het schijfcompartiment.
- Zodra de plaat stevig in het plaatcompartiment is geschroefd, start u de sequencing-run door op de startknop op de touchscreen-interface te drukken.
- Laat de met streptavidin gecoate magnetische kralen in evenwicht komen tot kamertemperatuur.
4. Resultaatverwerving
- Zodra de uitvoering is voltooid, verwijdert u het USB-station uit het apparaat en sluit u het weer aan op de computer waarop de pyrosequencer-software wordt uitgevoerd. Terwijl u doorgaat met de volgende stappen, gaat u verder met het reinigen van de pyrosequencer volgens de aanwijzingen als dit de laatste run van de dag is.
- Wacht tot het nieuw gegenereerde run-bestand op het USB-station verschijnt en dubbelklik op het run-resultaatbestand. Dit analyseert automatisch de luciferase-output van elke put bij nucleotide-opname en kwantificeert het mitochondriale allel van belang gedefinieerd tijdens de testconfiguratie in paragraaf 3.1.
- Zoek naar de volgende kleurscores die door de software worden weergegeven op basis van de kwaliteit van de aflezingen. Blauw geeft een optimale run aan, geel een run met een waarschuwing en rood een failed run. Als u de resultaten wilt opslaan, selecteert u Rapporten in het bovenste venster | Volledig rapport om een .pdf bestand te genereren met de pyrogrammen en resultaten van elke put van de run. U kunt de resultaten ook in andere indelingen downloaden op het tabblad Rapporten .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze sectie presenteert een voorbeeld van optimalisatie van een pyrosequencing assay voor een humane pathogene mtDNA mutatie, evenals sequencing data van de genotypering van heteroplasmatische (m.5024C>T) muis embryonale fibroblasten (MEF's) behandeld met mitochondriale zinkvinger nucleasen (mtZFN's). Het optimaliseren van de test voor menselijke cellen en het vergelijken van twee verschillende assays laat zien hoe de meest nauwkeurige kan worden geselecteerd, terwijl genotypering van genetisch gemodificeerde MEF-cellen in het tweede voorbeeld dient als een toegepast voorbeeld van het detecteren van heteroplasmieverschuivingen na gentherapie-interventie.
Menselijke m.3243A>G mutatie
Dit voorbeeld illustreert de genotypering van een veel voorkomende pathogene variant van mtDNA-m.3243A>G. De gemeenschappelijke m.3243A>G-mutatie ligt ten grondslag aan verschillende klinische ziekten, met name mitochondriale encefalopathie lactaatacidose en beroerte-achtige episodes (MELAS), maternale erfelijke doofheid en diabetes (MIDD) en progressieve externe oftalmoplegie (PEO)23. Deze test kan ook worden gebruikt om de minder vaak voorkomende m.3243A>T-variant24 te genotypen door de sequentie van op te nemen nucleotiden te herprogrammeren, zoals beschreven in paragraaf 3.1.3 van het protocol.
Naar aanleiding van de primeroptimalisatierichtlijnen in sectie 1 werden de volgende primersets geselecteerd, één voor beide strengen:
Test 1:
Vooruit: 5' - [Biotine] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Achterzijde: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Volgorde: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'
Amplicon grootte: 215 bp
Test 2:
Vooruit: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Achterzijde: 5' - [Biotine] GTTGGCCATGGGTATGTTGTT- 3'
Volgorde: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'
Amplicon grootte: 182 bp
Om de thermische cyclusomstandigheden voor de test te bepalen, werd eerst een PCR met thermische gradiënt met behulp van een Hot Start-polymerase (zie de materiaaltabel) uitgevoerd en geanalyseerd door elektroforese, volgens rubriek 2. Veertig cycli werden gebruikt om ongeveer 10 ng DNA als startsjabloon te amplificeren. Volgens de stappen onder punt 2.3 van het protocol werd een agarosegel-elektroforese uitgevoerd om de specificiteit van het amplificatieprotocol bij een bepaalde gloeitemperatuur te verifiëren (figuur 2A). Succesvolle banden van de juiste grootte (215 bp of 182 bp) konden bij alle temperaturen worden waargenomen; De lagere gloeitemperaturen in test 1 resulteerden echter in off-target amplificatie. De juiste gloeitemperatuur voor voorversterker werd vastgesteld op 70 °C (figuur 2A). Om de nauwkeurigheid van beide testen te bepalen en de beste te kiezen, werden molaire standaarden van het bekende m.3243A>G-percentage gegenereerd door de juiste volumes zuiver PCR-product in verschillende verhoudingen te mengen: respectievelijk 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% en 100% m.3243A>G (figuur 2B, stippellijn). Bij het uitvoeren van beide testen op de standaarden zagen we een grotere correlatie met de verwachte uitkomst in Assay 2 (Figuur 2B). Vervolgens gebruikten we beide assays op m.3243A>G cybride cellen in een genotyperingsexperiment en zagen we een uitgesproken bias in assay 1, met name in de buurt van homoplasmatische omstandigheden (figuur 2C).
Murine m.5024C>T mutatie
Dit voorbeeld betreft MEF-cellen behandeld met mtZFN's die zijn ontwikkeld om het niveau van de m.5024C>T-mutatie12 te verlagen als een voorbeeld van een mitochondriaal gentherapie-experiment waarbij genotypering door pyrosequencing nuttig is als een kwantitatieve vergelijking tussen monsters. De MEF-cellen zijn afgeleid van een gepubliceerd muismodel met een C>T-mutatie op positie 5.024 in het mtDNA van de muis (m.5024C>T)25. Het experiment omvatte het elektropoleren van de MEF's met plasmiden die coderen voor mtZFN's en verschillende fluorescerende reporters en vervolgens het sorteren van de cellen die de plasmiden tot expressie brengen door FACS na 24 uur. De cellen mochten vervolgens gedurende 2 weken herstellen voordat heteroplasmievergelijking door pyrosequencing werd uitgevoerd.
De primerset die werd gebruikt voor het sequencen van de m.5024C>T positie was als volgt:
Vooruit: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Achterzijde: 5' - [Biotine] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
Sequencing: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'
Amplicon grootte: 267 bp
De monsters werden in technisch drievoud gesequenced om de betrouwbaarheid van de resultaten te vergroten. Het experiment werd ook uitgevoerd in biologisch duplicaat, waardoor zes afzonderlijke waarden voor elk van de omstandigheden werden geproduceerd (figuur 3B). De gegevens van 2 van de 18 pyrogrammen werden gebruikt om figuur 3B te construeren; deze pyrogrammen zijn weergegeven in figuur 3A.
Figuur 1: Schema's die mitochondriale sequenties in een cel weergeven en de algemene technische schets van pyrosequencing. (A) Schematische weergave van het mitochondriale DNA en nucleaire mitochondriale sequenties. De figuur vertegenwoordigt de evolutionaire oorsprong van hoge homologiesequenties. (B) Schematische weergave van de pyrosequencing assay pipeline met een laatste voorbeeldsequentie met een geschatte 50% C>G heteroplasmiewaarde. Sjabloon-DNA wordt eerst versterkt door geselecteerde amplificatieprimers, waarvan er één aan het 5'-uiteinde wordt gebiotinyleerd. Na amplificatie behoudt de pyrosequencer een enkele streng DNA als sjabloon voor sequencing met behulp van met streptavidin gecoate magnetische kralen, weergegeven in blauw. Ten slotte maakt een sequencing primer de sequencing mogelijk door synthese van een vooraf gedefinieerde reeks nucleotiden, waardoor een pyrogram wordt gegenereerd dat schematisch wordt weergegeven. De stoichiometrieën van elke base zijn gemakkelijk te verkrijgen door de relatieve piekhoogten bij elke incorporatiegebeurtenis te vergelijken: hetzelfde nucleotide twee keer achter elkaar zal een dubbele piek genereren in vergelijking met een enkele base. De schuine streep in de te analyseren reeks duidt op de hypothetische SNP, die "C" of "G" zou kunnen zijn. Let op de initiële dispensatie van een nep "G" -basis op de x-as van het pyrogram, die meestal wordt uitgevoerd door de pyrosequencer als een negatieve controle. Afkortingen: mtDNA = mitochondriaal DNA; NUMTs = nucleaire mitochondriale sequenties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Optimalisatie van de pyrosequencing primer set zoals geïllustreerd op de humane m.3242A>G mutatie. (A) Agarose gel elektroforese (2% m/v) van een PCR amplificatie met behulp van de amplificatie primers van beide sets geselecteerd voor de m.3242A>G mutatie. WT duidt op wild-type controle-DNA, terwijl Het het bijna homoplasmatische m.3243A>G-monster is dat moet worden geanalyseerd. De temperaturen zijn de gloeitemperatuur die wordt gebruikt in een 40-cyclus PCR-reactie. (B). Een vergelijking van de prestaties van beide primersets met behulp van molaire standaarden voor kalibratie, die werden verkregen door verschillende verhoudingen van zuiver wildtype en zuiver mutant m3243A>G-product te mengen. De gemeten waarden worden aangegeven door de verticale stippellijnen. Een lineaire functie X = Y wordt weergegeven om te illustreren hoe dicht elk van de twee geteste assays bij een ideale meting ligt. De namen van de cellijnen op de x-as zijn de namen van de verschillende cybride klonen die met behulp van deze test werden gegenotypeerd. (C) Genotyperingsresultaten op vier cybride klonen van onbekende m.3243A>G heteroplasmie met behulp van beide assays. Sequencing werd uitgevoerd in technische drievoud. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Heteroplasmiemeting op FACS-gesorteerde m.5024C>T MEF's behandeld met mtZFN-genbewerkingstechnologie . (A) Pyrogrammen van twee PCR-replicaties van MEF-celmonsters die worden gebruikt om figuur 3B te genereren, evenals de wild-type genotyperingscontrole. De luminescentiewaarden op de Y-as zijn in A.U. (B) Genotyperingsresultaten van mtZFN-behandelde cellen samen met onbehandelde en mock-treated controles. De MEF's werden geëlektropoeerd met plasmiden die coderen voor mtZFN's en verschillende fluorescerende reporters en vervolgens gesorteerd op FACS na 24 uur. De cellen mochten vervolgens gedurende 2 weken herstellen voordat heteroplasmievergelijking door pyrosequencing werd uitgevoerd. De foutbalken werden berekend met biologische duplicaten, die elk pyrosequencing ondergingen in technisch drievoud. Afkortingen: FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering; MEF's = embryonale fibroblasten van muizen; mtZFN = mitochondriaal zinkvingernuclease; A.U. = willekeurige eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een cruciaal aspect voor het succes van het protocol is het vermijden van verontreinigingen, vooral bij het gebruik van lage hoeveelheden uitgangsmateriaal. Het wordt aanbevolen om waar mogelijk een UV-kap en gefilterde pipetpunten te gebruiken bij het voorbereiden van de monsters, en om de voorversterkings- en naversterkingsgebieden gescheiden te houden. Blancometingen en monsters van bekende heteroplasmie (zoals wild-type DNA) moeten altijd worden opgenomen om te worden gebruikt als benchmarks om te controleren op technische of biologische vertekening.
Een opmerkelijke technische vertekening die inherent is aan de test is het verhoogde luminescerende signaal dat wordt geproduceerd door de analoge integratie van adenine. Wanneer adenine op een variabele positie wordt gebruikt, produceert het vaak een resterende fluorescerende piek (bijv. Figuur 2C). Het is om deze reden dat het wordt aanbevolen om pyrosequencing-assays uit te voeren op de tegenovergestelde streng (waar een thymine zal worden opgenomen), indien mogelijk om te voorkomen dat het adenine-analoog op de variabele positie moet worden opgenomen. In het geval van A>T- of T>A-mutaties is dit echter onmogelijk. Niettemin, zoals blijkt uit de representatieve resultaten, kan een geschikte keuze van primers van groter belang zijn bij het ontwerpen van een test. Assay 2 voor de m.3243A>G mutatie, in het eerste deel van de representatieve resultaten, sequenties gebaseerd op de A/G-verhouding op de variabele positie in tegenstelling tot assay 1, die de T/C-ratio meet. Ondanks dat het gevoelig is voor de adenine-incorporatiebias, levert test 2 nauwkeurigere resultaten op basis van de vergelijking met de molaire normen, zoals blijkt uit een eenvoudige lineaire regressieanalyse (figuur 2B).
Biases zijn voornamelijk het gevolg van NUMT co-amplificatie3. Het grote mitochondriale kopienummer voorkomt meestal dat nucleaire off-target sequenties significante vertekening introduceren; bepaalde gebieden van mtDNA zijn echter aanwezig in veel NUMTS en moeten worden vermeden met behulp van de methoden die worden aangegeven in het protocol onder sectie 1.
Bij het nemen van de bovengenoemde voorzorgsmaatregelen is deze methode een zeer modulaire, snelle en kosteneffectieve manier om SNP's in mtDNA te genotyperen. De methode is echter niet geschikt voor alle mitochondriale genotyperingstoepassingen, met name grootschalige deleties waarvoor digitale druppel-PCR wordt aanbevolen26. Variabiliteit in de dispensatie van reagentia door de sequencer of verschillende primers / amplificatieomstandigheden kan leiden tot kleine vooroordelen die worden geïntroduceerd. Het is om deze reden dat technische drievoudigingen meestal worden aanbevolen om de waarheidsgetrouwheid van de genotyperingsresultaten te bevestigen. Een andere beperking van de aanpak is de reikwijdte, omdat alleen korte, vooraf gedefinieerde overspanningen van mtDNA kunnen worden gegenotypeerd. Hoewel pyrosequencers kunnen worden geprogrammeerd om honderden basenparen van onbekende sequentie te sequencen, wordt dit al snel minder kosteneffectief dan het gebruik van een NGS-benadering. Onderzoekers zouden in eerste instantie pyrosequencing kunnen implementeren als een snelle genotyperingsmethode die een nauwkeurig kwantitatief antwoord oplevert, maar vervolgens gekozen monsters door NGS kunnen analyseren voor verdere precisie en context.
Kortom, deze gevestigde methode blijft een hoofdbestanddeel in mitochondriaal genetisch onderzoek en biedt snelle en eenvoudige toegang tot kwantitatieve heteroplasmiemetingen die essentieel zijn in veel onderzoekscontexten in het veld, zoals patiëntdiagnose, gentherapie of de genotypering van diermodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.M. is mede-oprichter, aandeelhouder en lid van de wetenschappelijke adviesraad van Pretzel Therapeutics, Inc. P.S.-P. en P.A.N. bieden adviesdiensten voor Pretzel Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
We willen Silvia Marchet en Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milaan) bedanken voor het voorbereiden en leveren van de m.3243A>G cybride cellen die als illustratieve voorbeelden voor dit protocol worden gebruikt. We willen ook de leden van de Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) bedanken voor nuttige discussie in de loop van dit onderzoek. Dit werk werd ondersteund door kernfinanciering van de Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 en MC_UU_00028/3). P.A.N. en P.S.-P. worden bovendien ondersteund door respectievelijk The Lily Foundation en The Champ Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G.
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M.
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
