Summary
Pyrosequencing-analyser möjliggör robust och snabb genotypning av mitokondriellt DNA-enkelnukleotidpolymorfismer i heteroplasmatiska celler eller vävnader.
Abstract
Mutationer i mitokondriellt genom (mtDNA) har associerats med maternellt ärftliga genetiska sjukdomar. Intresset för mtDNA-polymorfismer har dock ökat de senaste åren på grund av den nyligen utvecklade förmågan att producera modeller med mtDNA-mutagenes och en ny uppskattning av sambandet mellan mitokondriella genetiska avvikelser och vanliga åldersrelaterade sjukdomar som cancer, diabetes och demens. Pyrosequencing är en sekvenserings-för-syntes-teknik som används allmänt över mitokondriella fältet för rutinmässiga genotypningsexperiment. Dess relativa överkomliga jämfört med massiva parallella sekvenseringsmetoder och enkel implementering gör det till en ovärderlig teknik inom mitokondriell genetik, vilket möjliggör snabb kvantifiering av heteroplasmi med ökad flexibilitet. Trots praktiken av denna metod kräver dess genomförande som ett medel för mtDNA-genotypning observation av vissa riktlinjer, särskilt för att undvika vissa fördomar av biologiskt eller tekniskt ursprung. Detta protokoll beskriver nödvändiga steg och försiktighetsåtgärder vid utformning och implementering av pyrosequencing-analyser för användning i samband med heteroplasmimätning.
Introduction
Det mitokondriella genomet existerar i form av små (16, 5 kb) cirkulära molekyler (mtDNA) närvarande i mitokondriernas innersta fack som heter matrisen och kodar för 13 subenheter i mitokondriell andningskedja, liksom de tRNA och rRNA som är nödvändiga för deras översättning in situ av mitokondriell ribosom1. Detta genom representerar ungefär 1% av alla proteiner som är nödvändiga för mitokondriell funktion, varav resten kodas av kärn-DNA (nDNA). Det antas vanligen att mitokondrier härrör från en endosymbiotisk fusionshändelse mellan en alfa-proteobakteriell förfader och en förfäders eukaryota cell. När denna hypotetiska symbios ägde rum överfördes mitokondriernas genetiska information gradvis till kärnan under eoner, vilket förklarar den ovannämnda kompaktiteten hos mtDNA jämfört med genomerna hos moderna cyanobakterier2. En sådan överföring av gener bevisas starkast av förekomsten av långa sträckor av nDNA som är mycket homologa med sekvenserna som finns i mtDNA. Dessa nukleära mitokondriella sekvenser (NUMT) är en vanlig källa till feltolkning under genotypning, och vissa försiktighetsåtgärder måste vidtas för att undvika nukleära fördomar vid genotypning mtDNA3 (figur 1A).
Ett annat särdrag hos mtDNA är att dess kopieringsnummer varierar beroende på celltyp, numrering var som helst från tiotusentals kopior per cell4. På grund av denna multi-copy natur kan mtDNA hysa ett brett spektrum av genotyper inom en enda cell, vilket kan resultera i en mer kontinuerlig distribution av alleler i motsats till de diskreta allelerna associerade med kärngener när man överväger kromosomernas zygositet. Denna heterogenitet av mitokondriella alleler kallas mitokondriell heteroplasmi, vilket typiskt uttrycks i procentuell prevalens av en given mutation som en andel av det totala mtDNA i en given cell. Heteroplasmi kan kontrasteras med homoplasmi, vilket hänvisar till en unik art av mtDNA som finns över en cell.
Mätning av mitokondriell heteroplasmi är av särskilt intresse vid kvantifiering av andelen mtDNA-molekyler som innehåller patogena varianter. Sådana varianter kommer i form av enkla nukleotidpolymorfismer (SNP), små indeler eller storskaliga borttagningar5. De flesta människor är heteroplasmatiska för patogena varianter; De uppvisar emellertid inga kliniska fenotyper, som ofta bara manifesterar sig vid högre heteroplasmatiska nivåer av patogent mtDNA i ett fenomen som kallas tröskeleffekt6. Medan värdena associerade med patogenicitet är starkt beroende av arten av den patogena mutationen och vävnaden i vilken den förekommer, ligger de vanligtvis över 60% heteroplasmi7.
Det finns flera forskningsområden där mitokondriell genotypning är vanligt. Inom det medicinska området kan testning eller kvantifiering av mtDNA-mutationer fungera som ett diagnostiskt kriterium för mitokondriella sjukdomar, varav många har mtDNA-avvikelser som ursprung5. Förutom studien av humana patogena mutationer kommer förekomsten av djurmodeller som innehåller patogena SNP i mtDNA sannolikt att öka, med tanke på den senaste tillkomsten av mitokondriell basredigering som möjliggjorts av mitokondriellt riktade DddA-härledda cytosinbasredigerare (DdCBE)8 och TALE-baserade deaminaser (TALED) för adeninbasredigering9. Detta tillvägagångssätt kommer att vara avgörande för att förstå samspelet mellan avvikande mitokondriella genotyper och de resulterande dysfunktionerna. Det pågår också vetenskaplig forskning om ombyggnad av mitokondriellt genom för ultimat användning som en terapeutisk strategi vid mänskliga mitokondriella sjukdomar via ett tillvägagångssätt som kallas heteroplasmiskiftning. Detta forskningsområde handlar främst om att rikta mutationsspecifika nukleaser till mitokondriell matris; Detta resulterar i preferensnedbrytning av patogent mtDNA, vilket leder till räddningar i fenotyp10,11,12,13. Alla experiment som involverar ombyggnad av mitokondriell genotyp kräver en robust kvantitativ metod för att bedöma heteroplasmiskift.
En mängd olika metoder används för att genotyp mtDNA, och dessa varierar beroende på mutationens natur. Nästa generations sekvenseringsmetoder (NGS) är mer exakta när det gäller att kvantifiera SNP i mtDNA; Dessa metoder förblir dock oöverkomligt dyra för rutinmässig kvantifiering av mitokondriell heteroplasmi, särskilt om antalet prover är litet. Sanger-sekvensering kan också möjliggöra detektering av SNP; Detta tillvägagångssätt är dock inte kvantitativt och misslyckas ofta med att upptäcka låga nivåer av heteroplasmi eller kan vara felaktigt vid uppskattning av höga heteroplasmier. Pyrosequencing, som en analys som involverar minimal förberedelse och möjliggör snabb kvantifiering av heteroplasmi för vilket mtDNA-prov som helst, föreslås som en lämplig kompromiss mellan dessa två ytterligheter. Denna metod har använts rutinmässigt för att kvantifiera mitokondriella SNP av många forskare i olika sammanhang, inklusive rättsmedicinsk analys 14,15, klinisk diagnos16 eller genotypning av mtDNA från enstaka celler17.
Denna analys innefattar ett första PCR-föramplifieringssteg av en region som flankerar SNP i mtDNA, vilket följs av en sekvenserings-för-syntesanalys med användning av en sträng av den tidigare genererade ampliconen. En av de två primrarna som används i föramplifieringssteget måste biotinyleras på 5'-änden, vilket gör det möjligt för pyrosequencing-apparaten att isolera den enda DNA-strängen som ska användas som mall för sekvenseringsreaktionen. En tredje sekvenseringsprimer glödgas sedan på den kvarhållna biotinylerade strängen, vilket möjliggör begynnande DNA-syntes som deoxinukleotider som ska dispenseras i en fördefinierad ordning i reaktionskammaren. Pyrosequencern registrerar mängden av varje bas som införlivas baserat på en självlysande avläsning, vilket möjliggör relativ kvantifiering av mitokondriella alleler av mutant och vildtyp vid DNA-syntes (figur 1B). Luminiscensen genereras av ett luciferasenzym, som avger ljus i närvaro av ATP som ett ATP-sulfurylas syntetiserar de novo vid varje inkorporeringshändelse från pyrofosfaterna som frigörs av varje nukleotid. Dessa två reaktioner kan sammanfattas enligt följande:
1. PPi (från nukleotidinkorporering) + APS → ATP + sulfat (ATP-sulfurylas)
2. ATP + luciferin +O2 → AMP + PPi + oxyluciferin + CO2 + ljus (luciferas)
Att detektera adeninbaser av pyrosequencern utan att ATP korsreagerar med luciferas i den andra reaktionen är en utmaning. Detta löses emellertid genom att använda en adeninanalog för DNA-syntes, nämligen dATPαS. Trots att det inte är ett perfekt substrat för luciferas, producerar det en starkare luminiscens jämfört med de tre andra nukleotiderna, som justeras digitalt av pyrosequenceren och ställs in på en faktor 0,9. På grund av denna inneboende variabilitet föreslås att man undviker sekvensering av adenin vid SNP-positionen (se diskussionen för mer information).
Följande protokoll beskriver metoden för mtDNA-heteroplasmibedömning genom pyrosequencing och beskriver de nödvändiga försiktighetsåtgärderna vid utformningen av amplifieringsprimrarna för att undvika biologisk eller teknisk bias vid genotypning av SNP i mtDNA. Det senare innebär digital kartläggning och val av primeruppsättningar, optimering av förförstärknings-PCR och slutligen sekvensering och raffinering av analysen. Två tillämpade exempelanalyser demonstreras: för det första optimeringen av den vanligaste humana patogena varianten m.3243A>G18, och för det andra genotypningen av musembryonala fibroblastceller (MEF) som har genomgått heteroplasmiförskjutning med hjälp av teknik som utvecklats vid Minczuk-laboratoriet i Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Informerat samtycke gavs för användning av humana 3243A>G cybridceller och de förevigade m.5024C>T MEF som användes i denna studie. Etiskt godkännande krävdes inte i detta fall eftersom patientcellerna inte samlades in vid University of Cambridge. Användning av humana fibroblaster kan dock kräva etiskt godkännande. Det rekommenderas starkt att följa bästa praxis för PCR-inställning när du förbereder prov-DNA för pyrosequencing. Frekvent amplifiering med identiska primrar kan leda till amplikonkontaminering och införa bias till den efterföljande genotypningen om strikt separation mellan pre-PCR- och post-PCR-områdena inte observeras. Rörledningen som presenteras här använder specifik utrustning från en enda tillverkare; detaljerna finns i materialförteckningen. Primerdesignen för PCR kan utföras manuellt om så önskas; Det rekommenderas dock att använda befintlig programvara för detta ändamål (se materialförteckningen).
1. Pyrosequencing primer design och analysval
- Skaffa primerkandidater med programvara
- Hämta en mtDNA-sekvensfil för arten som genotypas och identifiera SNP: s position. Se till att den referenssekvens som används använder lämplig basnumrering för den studerade mutationen så att SNP: s position lätt kan identifieras.
- Kopiera 1 000 baspar uppströms och nedströms SNP-platsen och klistra in den trunkerade sekvensen i programvaran avsedd för pyrosequencing-primerdesignen (se materialtabellen).
- Ställ in den analyserade SNP-basen som mål för pyrosequencing-analysen i programvaran genom att markera den polymorfa basen och högerklicka på och sedan välja ange målregion.
- Tryck på uppspelningsikonen i det övre högra hörnet av gränssnittet för att starta primervalet.
- Vänta tills programvaran nu automatiskt genererar primertrios: två primers för föramplifiering av mall-DNA och en tredje primer för sekvensering genom syntes i pyrosequencing-maskinen. Behåll alla primeruppsättningar genom att högerklicka på och välja kopiera alla primeruppsättningar.
- Välja optimala primeruppsättningar från den genererade listan
- Behåll primeruppsättningarna med högsta kvalitetspoäng baserat på programvarans utdata, vilket ger primeruppsättningar i fallande ordning baserat på kvalitetspoängen. Om möjligt, utelämna primeruppsättningar med en poäng under 80.
- För de kvarhållna primersatserna, identifiera och kopiera amplikonen som produceras av amplifieringsprimrarna.
- Justera amplicons som produceras med hela genomet hos organismen som ska genotypas med NCBI Blast genom att använda online-inlämningsportalen på https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Välj följande från rullgardinsmenyerna under inlämning:
- Välj databas | Genomiska + transkriptionsdatabaser.
- Välj Människa eller Mus i rullgardinsmenyn, beroende på vilken SNP som analyserats.
- Välj Optimera för | Något liknande sekvenser (Blastn).
- (Valfritt) Om genotypning av en annan organism än mus eller människa ska följande väljas under inlämningen:
- Välj databas | Standard databas.
- Välj RefSeq Representative genomes i rullgardinsmenyn
- Välj Optimera för | Något liknande sekvenser (Blastn)
- När det är möjligt, utelämna alla amplicons som har perfekt homologi till mtDNA-ampliconen, särskilt om primerbindningsregionerna är perfekt homologa (se diskussionen).
OBS: BLAST-justeringsverktyget returnerar alla sekvenser med betydande homologi till förförstärkningsamplikationsamplikerna. Detta möjliggör detektion av de NUMT som beskrivs i inledningen, som, om de inte redovisas, kan inducera en bias eftersom de samförstärks med mitokondriellt DNA. - Beställ oligos som erhålls via denna rörledning. Se till att 5'biotinmodifiering tillsätts till rätt amplifieringsprimer under syntesordningen, så att sekvenseringsprimern kommer att komplettera den biotinylerade strängen.
OBS: Valet av sekvenseringsprimer är mer flexibelt än förstärkningsprimrarna, och det rekommenderas att ha minst en bas som skiljer 3'-änden av sekvenseringsprimern och den variabla positionen.
2. Förförstärkning PCR-optimering
- Bered DNA-proverna genom att extrahera det totala genomiska DNA:t med en lämplig metod.
OBS: Detta beror till stor del på antalet celler som genotypas och deras ursprung. Om DNA isoleras från enskilda celler med hjälp av en lysbuffert som innehåller proteinas K måste provet denatureras vid 95 °C i 10 minuter för att inte störa polymeraset under den efterföljande PCR-behandlingen. - PCR-inställning och termiska blockinställningar
- Ställ in PCR med ett högkvalitativt polymeras som du väljer. Förbered en Master Mix för fyra reaktioner. Eftersom endast 10 μl PCR-reaktion krävs för en pyrosequencing-körning, förbered 25 μL PCR-reaktioner (för att möjliggöra en teknisk upprepning vid behov). Använd 40 cykler av PCR med cirka 10 ng genomiskt DNA som utgångsmaterial med 1 μM av både framåt- och bakåtprimrarna.
- Ställ in förlängningstiden enligt tillverkarens specifikationer för det använda polymeraset, med hänsyn till längden på de valda föramplifieringsprimrarna.
- Använd en termisk cykler med variabla glödgningstemperaturinställningar. Eftersom glödgningstemperaturen kan variera beroende på primersekvensen, programmerar salthalten i polymerasbufferten och andra faktorer fyra olika glödgningstemperaturer i det termiska cykelprogrammet.
OBS: Det bearbetade exemplet i de representativa resultaten använde följande temperaturer: 55 °C, 60 °C, 65 °C och 70 °C. - Dela Master Mix i fyra 200 μL PCR-rör och ställ in dem så att de körs vid var och en av de fyra valda glödgningstemperaturerna i den termiska cykeln i 40 cykler.
- Visualisering av förförstärkningsband
- Under PCR-körningen, bereda en 2% (w/v) agarosgel i 1x TBE med SYBR Safe eller etidiumbromid som visualiseringsmedel.
OBS: En högre procentuell gel rekommenderas för visualisering eftersom de förstärkta fragmenten vanligtvis är korta, vanligtvis från 100 till 500 baspar. - När PCR i steg 2.2 är klar, blanda 10 μl av reaktionen med en lämplig mängd DNA-laddningsbuffert och kör på 2% agarosgel vid 7 V/cm i cirka 45 minuter.
- Visualisera de resulterande DNA-fragmenten på en UV-transilluminator.
OBS: De termiska cykelförhållandena som valts för förförstärkningssteget bör ge ett enda rent band av förväntad storlek. Lägre glödgningstemperaturer kan ibland resultera i förstärkning utanför målet, vilket kan införa fördomar till den efterföljande pyrosequencingen. - Välj den lägsta glödgningstemperaturen som ger ett rent band av rätt storlek för efterföljande förstärkningar.
- (Valfritt) Punktmarkera ett band av förväntad storlek, rena med hjälp av ett valfritt gelextraktionssats och analysera med Sanger-sekvensering för att bekräfta provets ungefärliga heteroplasmi som referens.
- Under PCR-körningen, bereda en 2% (w/v) agarosgel i 1x TBE med SYBR Safe eller etidiumbromid som visualiseringsmedel.
3. Instrumentinställning och körning
OBS: När PCR-steget i föregående avsnitt har optimerats innebär nästa steg att programmera pyrosequencern med rätt nukleotidsekvens för att analysera för den specifika SNP. Detta innebär att man går in i 10 baser direkt nedströms 3'-änden av sekvenseringsprimern. Detta beskrivs i följande avsnitt.
- Konfiguration av analys
- Öppna körprogramvaran som medföljer pyrosequencern och välj Ny analys i det övre vänstra hörnet av gränssnittet.
- Välj analysmallen Allelkvantifiering .
- Ange sekvensen som ska analyseras i motsvarande ruta genom att skriva in nukleotiderna som ska införlivas direkt nedströms sekvenseringsprimern, som ska vara uppströms SNP av intresse. För den variabla positionen, ange de två möjliga baserna åtskilda av ett snedstreck (t.ex. A/T).
- Tryck på Generera dispenseringsorder och låt programvaran automatiskt bestämma en lämplig ordning för nukleotiderna som ska dispenseras i sekvenserings-för-syntes-reaktionen.
- Spara och ange ett namn för analysen.
- Reagensberedning och lagring
- Späd sekvenseringsprimern som beställts till 4 μM i glödgningsbufferten som medföljer i pyrosequencerreagenssatsen.
OBS: Sekvenseringsprimern kan först spädas i vatten till 100 μM som stamlösning och därefter spädas ytterligare i glödgningsbuffert till 4 μM efter behov. - Beredning och hantering av enzymer och substrat
- Vid första unboxing, lös upp det frystorkade enzymet och substratet enligt tillverkarens rekommendationer. Förvaras vid −20 °C när den inte används.
- Vid efterföljande användning, tina injektionsflaskorna med enzym och substrat från −20 °C.
OBS: Alla andra reagens i det medföljande paketet kan förvaras kylda vid 4 °C. Utspädda sekvenseringsprimers kan också förvaras vid 4 °C.
- Placera den erforderliga mängden av varje reagens på is.
- Håll de återstående komponenterna som krävs, nämligen de streptavidinbelagda magnetpärlorna, absorberingsremsorna och pyrosequencingskivorna, vid 4 °C.
- Späd sekvenseringsprimern som beställts till 4 μM i glödgningsbufferten som medföljer i pyrosequencerreagenssatsen.
- Kör körning
OBS: När en analys först utformas måste den kalibreras med PCR-produkter med känd heteroplasmi, vilket säkerställer att analysen exakt kan skilja heteroplasmier. Forskare kan använda blandningar av PCR-produkter med känd heteroplasmi som standarder. Prover kan också verifieras med andra metoder som nämns i inledningen och diskussionen, särskilt NGS.- Späd ut det DNA som ska analyseras till 5 ng/μl. Särskilt i den första körningen, se till att inkludera prover av känd heteroplasmi som referens och / eller vildtypprover.
- Utför en försekvenserings-PCR på 5 μl utspätt DNA i 25 μl-reaktioner med hjälp av de amplifieringsprimrar och parametrar som identifieras i avsnitt 1 och avsnitt 2. Utför tekniska PCR-repliker för varje prov.
OBS: Föramplifierings-PCR kan lagras kortvarigt vid 4 °C eller långsiktigt vid −20 °C innan sekvensering fortsätter. - Kör filinställningar
- Välj Ny körning i det övre vänstra hörnet av pyrosequencerprogramvaran.
- Pyrosequencern kan samtidigt sekvensera 48 separata förförstärkta reaktioner, med en tom kvadrat som representerar en enda sekvenseringsbrunn på en pyrosequencingskiva. Ladda analyserna som konfigurerats i avsnitt 3.1 genom att högerklicka på en fyrkant och välja ladda analys. Vid behov, sekvensera upp till fyra separata analyser med olika sekvenseringsprimers.
- Ställ in primerdispenseringsläget på Automatisk för att automatiskt tilldela en injektionskammare för varje sekvenseringsprimer som används för körningen.
- Ställ in Körläge på Standard om du inte kör fyra olika typer av analyser på en sekvenseringsdisk.
- Se till att antalet analyser i körmallfilen matchar antalet PCR-reaktioner som förstärks.
Om du kör fler än 48 exempel måste ytterligare körningsfiler konfigureras. - Spara körfilerna på en USB-enhet.
- Grundning av pyrosequencern
- Tryck på rengöringsknappen på enhetens huvudpekskärm och rengör alla injektorer med vatten med hög renhet enligt instruktionerna på skärmen. När du sätter in absorbatorremsan i maskinen, se till att ändarna möts i läget "klockan 9" (direkt till vänster om mitten).
- Anslut USB-minnet med körningarna som konfigurerades i steg 3.3.3 och ladda körningsfilerna som definierades i steg 3.3.3.
OBS: Körfilerna måste sparas utanför någon katalog eller mapp på USB-enheten, annars kan de inte läsas av maskinen. - Följ instruktionerna på enheten för att ladda och fylla på reagenserna efter behov i motsvarande injektorer på maskinen.
- Förberedelse av provdisk och analysstart
- Låt de streptavidinbelagda magnetiska pärlorna balansera till rumstemperatur.
OBS: Dessa pärlor gör det möjligt för enheten att fånga den biotinylerade strängen från PCR-steget före förstärkning. De måste köpas separat från satsen. - Fyll på 3 μL pärlor i brunnarna som definierats i körfilen från steg 3.3.3.
- Fyll 10 μL av varje PCR-reaktion som ska sekvenseras i motsvarande prov och pipettera upp och ner för att blanda provet med magnetkulorna. Undvik bubblor om möjligt.
- Leta efter indikationen i den grundade pyrosequencern att skivan kan laddas i maskinen. Skruva loss plattans hållmutter innan du riktar in den laddade provplattan mot metallstiftet i skivfacket.
- När plattan är ordentligt fastskruvad i plattfacket, starta sekvenseringskörningen genom att trycka på startknappen på pekskärmsgränssnittet.
- Låt de streptavidinbelagda magnetiska pärlorna balansera till rumstemperatur.
4. Förvärv av resultat
- När körningen är klar tar du bort USB-enheten från maskinen och ansluter den till datorn som kör pyrosequencerprogramvaran. Medan du fortsätter med följande steg, fortsätt med rengöring av pyrosequencern enligt anvisningarna om det är dagens sista körning.
- Vänta tills den nyligen genererade körfilen visas på USB-enheten och dubbelklicka på körningsresultatfilen. Detta analyserar automatiskt luciferasproduktionen från varje brunn vid inkorporering av nukleotid och kvantifierar den mitokondriella allelen av intresse som definierats under analyskonfigurationen i avsnitt 3.1.
- Leta efter följande färgpoäng som visas av programvaran baserat på kvaliteten på läsningarna. Blått indikerar en optimal körning, gul en körning med en varning och röd en misslyckad körning. Om du vill spara resultaten väljer du Rapporter i det övre fönstret | Fullständig rapport för att generera en .pdf fil som innehåller pyrogrammen och resultaten från varje brunn i körningen. Du kan också ladda ner resultaten i andra format under fliken Rapporter .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt presenterar ett exempel på optimering av en pyrosequencing-analys för en human patogen mtDNA-mutation, samt sekvenseringsdata från genotypning av heteroplasmatiska (m.5024C>T) musembryonala fibroblaster (MEF) behandlade med mitokondriella zinkfingernukleaser (mtZFN). Optimering av analysen för mänskliga celler och jämförelse av två olika analyser visar hur man väljer den mest exakta, medan genotypning av genetiskt modifierade MEF-celler i det andra exemplet fungerar som ett tillämpat exempel på att upptäcka heteroplasmiskift efter genterapiintervention.
Mänsklig m.3243A>G-mutation
Detta exempel illustrerar genotypningen av en vanlig patogen variant av mtDNA-m.3243A>G. Den vanliga m.3243A>G-mutationen ligger till grund för flera kliniska sjukdomar, särskilt mitokondriell encefalopati laktacidos och strokeliknande episoder (MELAS), maternellt ärftlig dövhet och diabetes (MIDD) och progressiv extern oftalmoplegi (PEO)23. Denna analys kan också användas för att genotypa den mindre vanliga m.3243A>T-varianten24 genom att omprogrammera sekvensen av nukleotider som ska införlivas, enligt beskrivningen i avsnitt 3.1.3 i protokollet.
I enlighet med riktlinjerna för primeroptimering i avsnitt 1 valdes följande primeruppsättningar, en för vardera strängen:
Analys 1:
Framåt: 5' - [Biotin] AAATAAGGCCTACTTCAAAGCG - 3'
Omvänd: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Sekvensering: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'
Amplicon storlek: 215 bp
Analys 2:
Framåt: 5' - AAATAAGGCCTACTTCAAAGCG - 3'
Omvänd: 5' - [Biotin] GTTGGCCATGGGTGTGTTGTT- 3'
Sekvensering: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'
Amplicon storlek: 182 bp
För att bestämma de termiska cykelförhållandena för analysen utfördes och analyserades först en termisk gradient PCR med användning av ett Hot Start-polymeras (se materialtabellen) genom elektrofores, enligt avsnitt 2. Fyrtio cykler användes för att förstärka cirka 10 ng DNA som startmall. I enlighet med stegen i avsnitt 2.3 i protokollet utfördes en agarosgelelektrofores för att verifiera amplifieringsprotokollets specificitet vid en given glödgningstemperatur (figur 2A). Framgångsrika band av rätt storlek (antingen 215 bp eller 182 bp) kunde observeras vid alla temperaturer; De lägre glödgningstemperaturerna i analys 1 resulterade dock i förstärkning utanför målet. Den korrekta glödgningstemperaturen för föramplifiering fastställdes till 70 °C (figur 2A). För att fastställa noggrannheten hos båda analyserna och välja den bästa, genererades molära standarder med känd m.3243A>G-procent genom att blanda lämpliga volymer ren PCR-produkt i olika förhållanden: 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% respektive 100% av m.3243A>G (figur 2B, prickad linje). När vi utförde båda analyserna på standarderna observerade vi en större korrelation med det förväntade resultatet i analys 2 (figur 2B). Vi använde sedan båda analyserna på m.3243A>G cybridceller i ett genotypningsexperiment och observerade en uttalad bias i analys 1, särskilt nära homoplasmatiska förhållanden (figur 2C).
Murin m.5024C>T mutation
Detta exempel involverar MEF-celler behandlade med mtZFNs utvecklade för att minska nivån av m.5024C>T-mutationen12 som ett exempel på ett mitokondriellt genterapiexperiment där genotypning genom pyrosequencing är användbar som en kvantitativ jämförelse mellan prover. MEF-cellerna härrör från en publicerad musmodell som innehåller en C>T-mutation vid position 5,024 i musens mtDNA (m.5024C>T)25. Experimentet involverade elektroporering av MEF med plasmider som kodar för mtZFN och olika fluorescerande reportrar och därefter sorterar cellerna som uttrycker plasmiderna med FACS efter 24 timmar. Cellerna fick sedan återhämta sig i 2 veckor före heteroplasmisk jämförelse genom pyrosequencing.
Primersatsen som användes för sekvensering av m.5024C>T-positionen var följande:
Framåt: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Omvänd: 5' - [Biotin] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
Sekvensering: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'
Amplicon storlek: 267 bp
Proverna sekvenserades i tekniskt triplikat för att öka resultatens trohet. Experimentet utfördes också i biologiska duplikat, vilket gav sex separata värden för vart och ett av villkoren (figur 3B). Data från 2 av de 18 pyrogrammen användes för att konstruera figur 3B; Dessa pyrogram visas i figur 3A.
Figur 1: Scheman som representerar mitokondriella sekvenser i en cell och den allmänna tekniska konturen av pyrosequencing. (A) Schematisk representation av mitokondriellt DNA och nukleära mitokondriella sekvenser. Figuren representerar det evolutionära ursprunget till höghomologisekvenser. (B) Schematisk representation av pyrosquencinganalysrörledningen med en slutlig exempelsekvens som visar ett ungefärligt heteroplasmivärde på 50 % C>G. Mall-DNA förstärks först av utvalda amplifieringsprimrar, varav en är biotinylerad på 5'-änden. Efter amplifiering behåller pyrosequencern en enda DNA-sträng som mall för sekvensering med streptavidinbelagda magnetiska pärlor, som visas i blått. Slutligen möjliggör en sekvenseringsprimer sekvensering genom syntes av en fördefinierad serie nukleotider, vilket genererar ett pyrogram som är schematiskt representerat. Stökiometrierna för varje bas erhålls enkelt genom att jämföra de relativa topphöjderna vid varje inkorporeringshändelse: samma nukleotid två gånger i rad kommer att generera en dubbel topp jämfört med en enda bas. Snedstrecket i sekvensen som ska analyseras betecknar den hypotetiska SNP, som kan vara "C" eller "G". Observera den första dispenseringen av en mock "G" -bas på pyrogrammets x-axel, som vanligtvis utförs av pyrosequencern som en negativ kontroll. Förkortningar: mtDNA = mitokondriellt DNA; NUMT = nukleära mitokondriella sekvenser. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Optimering av pyrosequencing-primersetet som illustreras på den humana m.3242A>G-mutationen. (A) Agarosgelelektrofores (2% vikt/volym) av en PCR-amplifiering med användning av amplifieringsprimrar från båda uppsättningarna valda för m.3242A>G-mutationen. WT betecknar kontroll-DNA av vildtyp, medan Het är det nästan homoplasmatiska m.3243A>G-provet som ska analyseras. Temperaturerna är glödgningstemperaturen som används i en 40-cykels PCR-reaktion. (B). En jämförelse av prestanda för båda primersatserna med användning av molära standarder för kalibrering, vilka erhölls genom blandning av olika förhållanden mellan ren vildtyp och ren mutant m3243A>G-produkt. De uppmätta värdena betecknas med de vertikala prickade linjerna. En X = Y linjär funktion visas för att illustrera hur nära var och en av de två testade analyserna är en idealisk mätning. Namnen på cellinjerna på x-axeln är namnen på de olika cybridklonerna som genotypades med hjälp av denna analys. (C) Genotypningsresultat på fyra cybridkloner av okänd m.3243A>G heteroplasmi med båda testerna. Sekvenseringen utfördes i tekniskt tre exemplar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Heteroplasmimätning på FACS-sorterade m.5024C>T MEF behandlade med mtZFN-genredigeringsteknik. (A) Pyrogram från två MEF-cellprov PCR-replikat som används för att generera figur 3B samt genotypkontrollen av vildtyp. Luminiscensvärdena på Y-axeln är i A.U. (B) Genotypningsresultat för mtZFN-behandlade celler tillsammans med obehandlade och mock-behandlade kontroller. MEF: erna elektroporerades med plasmider som kodade för mtZFN och olika fluorescerande reportrar och sorterades därefter efter FACS efter 24 timmar. Cellerna fick sedan återhämta sig i 2 veckor före heteroplasmisk jämförelse genom pyrosequencing. Felstaplarna beräknades med biologiska dubbletter, som var och en genomgick pyrosequencing i teknisk triplicering. Förkortningar: FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; MEF = embryonala fibroblaster hos möss, mtZFN = mitokondriellt zinkfingernukleas; A.U. = godtyckliga enheter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritisk aspekt för protokollets framgång är att undvika kontaminering, särskilt vid användning av små mängder utgångsmaterial. Det rekommenderas att använda en UV-huv och filtrerade pipettspetsar när proverna förbereds när det är möjligt, samt att hålla förförstärknings- och efterförstärkningsområdena åtskilda. Blankmätningar och prover av känd heteroplasmi (t.ex. vildtyps-DNA) bör alltid inkluderas för att användas som riktmärken för att kontrollera teknisk eller biologisk partiskhet.
En anmärkningsvärd teknisk bias som är inneboende i analysen är den ökade luminescerande signalen som produceras av adeninanalog inkorporering. När adenin används i en variabel position ger den ofta en kvarvarande fluorescerande topp (t.ex. figur 2C). Det är av denna anledning som det rekommenderas att köra pyrosequencing-analyser på motsatt sträng (där en tymin kommer att införlivas), när det är möjligt för att undvika att behöva införliva adeninanalogen vid den variabla positionen. Men när det gäller A>T- eller T>A-mutationer är detta omöjligt. Icke desto mindre, vilket framgår av de representativa resultaten, kan ett lämpligt val av primers vara av större betydelse vid utformningen av en analys. Analys 2 för m.3243A>G-mutationen, i den första delen av de representativa resultaten, sekvenser baserade på A/G-förhållandet vid den variabla positionen i motsats till analys 1, som mäter T/C-förhållandet. Trots att den är mottaglig för adeninkorporeringsbias ger analys 2 mer exakta resultat baserat på jämförelsen med molarstandarderna, vilket visas av en enkel linjär regressionsanalys (figur 2B).
Fördomar är främst resultatet av NUMT-samförstärkning3. Det stora antalet mitokondriella kopior förhindrar vanligtvis nukleära off-target-sekvenser från att införa någon signifikant bias; Vissa regioner av mtDNA förekommer dock i många NUMT och bör undvikas med de metoder som anges i protokollet i avsnitt 1.
När man vidtar ovannämnda försiktighetsåtgärder är denna metod ett mycket modulärt, snabbt och kostnadseffektivt sätt att genotypa SNP i mtDNA. Metoden är dock inte lämplig för alla mitokondriella genotypningsapplikationer, särskilt storskaliga deletioner för vilka digital dropp-PCR rekommenderas26. Variationer i dosering av reagens av sekvenseraren eller olika primers / amplifieringsförhållanden kan leda till att små förspänningar införs. Det är av denna anledning som tekniska triplikater vanligtvis rekommenderas för att bekräfta riktigheten av genotypresultaten. En annan begränsning av tillvägagångssättet är omfattningen, eftersom endast korta, fördefinierade intervall av mtDNA kan genotypas. Medan pyrosequencers kan programmeras för att sekvensera hundratals baspar av okänd sekvens, blir detta snabbt mindre kostnadseffektivt än att använda en NGS-metod. Forskare kunde initialt implementera pyrosequencing som en snabb genotypningsmetod som ger ett exakt kvantitativt svar men kunde därefter analysera utvalda prover av NGS för ytterligare precision och sammanhang.
Sammanfattningsvis är denna väletablerade metod fortfarande en häftklammer i mitokondriell genetisk forskning, vilket ger snabb och enkel tillgång till kvantitativa heteroplasmimätningar som är viktiga i många forskningssammanhang inom området, såsom patientdiagnos, genterapi eller genotypning av djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.M. är medgrundare, aktieägare och medlem i den vetenskapliga rådgivande nämnden för Pretzel Therapeutics, Inc. P.S.-P. och P.A.N. tillhandahåller konsulttjänster för Pretzel Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Vi vill tacka Silvia Marchet och Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milano) för att ha förberett och tillhandahållit m.3243A>G cybridceller som används som illustrativa exempel för detta protokoll. Vi vill också erkänna medlemmarna i Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) för användbar diskussion under denna forskning. Detta arbete stöddes av kärnfinansiering från Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 och MC_UU_00028/3). P.A.N. och P.S.-P. stöds dessutom av The Lily Foundation respektive The Champ Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G.
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M.
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
