Summary
파이로시퀀싱 분석은 이형질 세포 또는 조직에서 미토콘드리아 DNA 단일 뉴클레오티드 다형성의 강력하고 신속한 유전형 분석을 가능하게 합니다.
Abstract
미토콘드리아 게놈(mtDNA)의 돌연변이는 모계 유전 질환과 관련이 있습니다. 그러나 mtDNA 다형성에 대한 관심은 mtDNA 돌연변이 유발에 의해 모델을 생산하는 최근 개발된 능력과 미토콘드리아 유전적 이상과 암, 당뇨병 및 치매와 같은 일반적인 노화 관련 질병 사이의 연관성에 대한 새로운 인식으로 인해 최근 몇 년 동안 증가했습니다. 파이로시퀀싱은 일상적인 유전형 분석을 위해 미토콘드리아 분야에서 널리 사용되는 합성에 의한 시퀀싱 기술입니다. 대규모 병렬 시퀀싱 방법과 비교할 때 상대적인 경제성과 구현 용이성은 미토콘드리아 유전학 분야에서 매우 귀중한 기술이며, 유연성이 증가하여 이질형질의 신속한 정량화를 가능하게 합니다. 이 방법의 실용성에도 불구하고, mtDNA 유전자형 분석의 수단으로서의 구현은 특히 생물학적 또는 기술적 기원의 특정 편향을 피하기 위해 특정 지침을 준수해야합니다. 이 프로토콜은 이형질 측정의 맥락에서 사용하기 위해 파이로시퀀싱 분석을 설계하고 구현하는 데 필요한 단계와 예방 조치를 간략하게 설명합니다.
Introduction
미토콘드리아 게놈은 매트릭스라고 하는 미토콘드리아의 가장 안쪽 구획에 존재하는 작은(16.5kb) 원형 분자(mtDNA)의 형태로 존재하며 미토콘드리아 호흡 사슬의 13개 서브유닛과 미토콘드리아 리보솜1에 의한 제자리 번역에 필요한 tRNA 및 rRNA를 암호화합니다. 이 게놈은 미토콘드리아 기능에 필요한 모든 단백질의 약 1%를 차지하며 나머지는 핵 DNA(nDNA)에 의해 암호화됩니다. 일반적으로 미토콘드리아는 알파-프로테오박테리아 조상과 조상 진핵 세포 사이의 내공생 융합 사건에서 파생된 것으로 가정합니다. 이 가상의 공생이 일어나면 미토콘드리아의 유전 정보는 영겁에 걸쳐 점차적으로 핵으로 전달되었으며, 이는 현대 시아노박테리아2의 게놈과 비교할 때 앞서 언급한 mtDNA의 조밀함을 설명합니다. 이러한 유전자 전달은 mtDNA에서 발견되는 서열과 매우 상동성인 긴 nDNA의 존재에 의해 가장 강력하게 입증됩니다. 이러한 핵 미토콘드리아 서열(NMT)은 유전형 분석 중 오해의 일반적인 원인이며, mtDNA3의 유전형 분석 시 핵 편향을 피하기 위해 특정 예방 조치를 취해야 합니다(그림 1A).
mtDNA의 또 다른 특징은 세포 유형에 따라 복제 수가 달라지며, 세포당 수십에서 수천 개의 카피가 나온다는 것이다 4. 이러한 다중 복제 특성으로 인해 mtDNA는 단일 세포 내에 광범위한 유전자형을 보유할 수 있으며, 이는 염색체의 접합체를 고려할 때 핵 유전자와 관련된 개별 대립 유전자와 달리 대립 유전자의 보다 지속적인 분포를 초래할 수 있습니다. 미토콘드리아 대립유전자의 이러한 이질성은 미토콘드리아 이형질로 지칭되며, 이는 전형적으로 주어진 세포에서 총 mtDNA의 비율로서 주어진 돌연변이의 유병률로 표현된다. 이형질은 세포 전체에 존재하는 고유한 mtDNA 종을 나타내는 동형질과 대조될 수 있습니다.
미토콘드리아 이형질 측정은 병원성 변이체를 보유하는 mtDNA 분자의 비율을 정량화할 때 특히 중요합니다. 이러한 변이체는 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs), 작은 인델(small indel) 또는 대규모 결실(large-scale deletion)의 형태로 나타난다5. 대부분의 인간은 병원성 변이체에 대해 이형질입니다. 그러나, 이들은 어떠한 임상적 표현형도 나타내지 않으며, 이는 종종역치 효과(threshold effect)6로 지칭되는 현상에서 병원성 mtDNA의 더 높은 이형질 수준에서만 나타난다. 병원성과 관련된 값은 병원성 돌연변이의 특성과 병원성 돌연변이가 발생하는 조직에 따라 크게 달라지지만, 일반적으로 이형질이 60% 이상이다7.
미토콘드리아 유전형 분석이 일반적인 몇 가지 연구 분야가 있습니다. 의료 분야에서, mtDNA 돌연변이에 대한 검사 또는 정량화는 미토콘드리아 질환의 진단 기준이 될 수 있으며, 그 중 다수는 mtDNA 이상을 기원으로 한다5. 인간 병원성 돌연변이에 대한 연구와 더불어, 미토콘드리아 표적 DddA 유래 시토신 염기 편집자(DdCBEs)8 및 아데닌 염기 편집을 위한 TALE 기반 데아미나제(TALED)에 의해 가능해진 미토콘드리아 염기 편집의 최근 출현을 감안할 때, mtDNA에 병원성 SNP를 보유하는 동물 모델의 유병률이 증가할 가능성이 있다9. 이 접근법은 비정상적인 미토콘드리아 유전자형과 그에 따른 기능 장애 사이의 상호 작용을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 또한 이형질 이동(heteroplasmy shifting)으로 알려진 접근 방식을 통해 인간 미토콘드리아 질환의 치료 전략으로 궁극적인 사용을 위해 미토콘드리아 게놈을 리모델링하는 과학적 연구가 진행 중입니다. 이 연구 분야는 주로 돌연변이 특이적 뉴클레아제를 미토콘드리아 기질로 향하게 하는 것과 관련이 있습니다. 그 결과 병원성 mtDNA가 우선적으로 분해되어 표현형10,11,12,13에서 구조됩니다. 미토콘드리아 유전자형의 리모델링과 관련된 모든 실험에는 이형질 이동을 평가하기 위한 강력한 정량적 방법이 필요합니다.
mtDNA의 유전자형을 분석하는 데는 매우 다양한 방법이 사용되며, 이는 돌연변이의 성질에 따라 다릅니다. 차세대 염기서열분석(NGS) 방법은 mtDNA에서 SNP를 정량화할 때 더 정확합니다. 그러나 이러한 방법은 특히 샘플 수가 적은 경우 미토콘드리아 이형질의 일상적인 정량화에 엄청나게 비쌉니다. Sanger 시퀀싱은 또한 SNP의 검출을 허용할 수 있습니다. 그러나 이 접근법은 정량적이지 않으며 종종 낮은 수준의 이형질을 감지하지 못하거나 높은 이형질을 추정할 때 부정확할 수 있습니다. 파이로시퀀싱은 최소한의 준비를 포함하고 모든 mtDNA 샘플에 대한 이형질의 신속한 정량화를 가능하게 하는 분석법으로서 이 두 극단 사이의 적절한 절충안으로 제안됩니다. 이 방법은 법의학 분석(forensic analysis)14,15, 임상 진단(clinical diagnosis)16, 또는 단일 세포(single cell)에서 mtDNA의 유전자형 분석(genotyping of mtDNA)을 포함한 다양한 맥락에서 수많은 연구자들에 의해 미토콘드리아 SNP를 정량화하기 위해 일상적으로 사용되어 왔다17.
이 분석은 mtDNA에서 SNP와 접하는 영역의 첫 번째 PCR 사전 증폭 단계를 포함하며, 이어서 이전에 생성된 앰플리콘의 한 가닥을 사용하는 합성에 의한 시퀀싱 분석이 뒤따릅니다. 예비증폭 단계에서 사용되는 두 개의 프라이머 중 하나는 5' 말단에서 비오티닐화되어야 하며, 이를 통해 파이로시퀀싱 장치는 시퀀싱 반응의 주형으로 사용할 DNA의 단일 가닥을 분리할 수 있습니다. 그런 다음 세 번째 시퀀싱 프라이머를 유지된 비오티닐화 가닥에 어닐링하여 데옥시뉴클레오티드로서의 초기 DNA 합성을 사전 정의된 순서로 반응 챔버에 분배할 수 있습니다. pyrosequencer는 발광 판독을 기반으로 통합된 각 염기의 양을 기록하여 DNA 합성 시 돌연변이 및 야생형 미토콘드리아 대립유전자의 상대적 정량화를 허용합니다(그림 1B). 발광은 루시페라아제 효소에 의해 생성되며, 이는 ATP 설퍼릴라제가 각 뉴클레오티드에 의해 방출되는 피로인산염으로부터 각 통합 이벤트에서 de novo 를 합성하는 ATP의 존재 하에서 빛을 방출합니다. 이 두 가지 반응은 다음과 같이 요약 할 수 있습니다.
1. PPi (뉴클레오티드 혼입으로부터) + APS → ATP + 황산염 (ATP 설퍼릴라제)
2. ATP + 루시페린 + O2 → AMP + PPi + 옥시 루시페린 + CO2 + 빛 (루시페라아제)
두 번째 반응에서 루시페라아제와 교차 반응하는 ATP 없이 파이로시퀀서에 의해 아데닌 염기를 검출하는 것은 어려운 일입니다. 그러나 이것은 DNA 합성을 위해 아데닌 유사체, 즉 dATPαS를 사용하여 해결됩니다. 루시페라아제의 완벽한 기질은 아니지만 파이로시퀀서에 의해 디지털 방식으로 조정되고 0.9의 계수로 설정되는 다른 세 가지 뉴클레오티드에 비해 더 강한 발광을 생성합니다. 이러한 내재적 가변성으로 인해 SNP 위치에서 아데닌 시퀀싱을 피하는 것이 좋습니다(자세한 내용은 논의 참조).
다음 프로토콜은 파이로시퀀싱에 의한 mtDNA 이형질 평가 방법을 자세히 설명하고 mtDNA에서 SNP의 유전자형 분석을 수행할 때 생물학적 또는 기술적 편향을 피하기 위해 증폭 프라이머를 설계하는 데 필요한 예방 조치를 간략하게 설명합니다. 후자는 프라이머 세트를 디지털 방식으로 조사 및 선택하고, 사전 증폭 PCR을 최적화하고, 마지막으로 분석을 시퀀싱 및 정제하는 것을 포함합니다. 두 가지 적용된 예시 분석이 입증된다: 첫째, 가장 일반적인 인간 병원성 변이체 m.3243A>G18의 최적화, 둘째, 케임브리지 10,11,12,19,20,21,22에 있는 민추크 실험실에서 개발된 기술을 사용하여 이형질 이동을 겪은 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 세포의 유전자형 분석.
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Protocol
이 연구에 사용된 인간 3243A>G 사이브리드 세포 및 불멸화된 m.5024C>T MEF의 사용에 대해 정보에 입각한 동의가 제공되었습니다. 이 경우 환자 세포가 케임브리지 대학에서 수집되지 않았기 때문에 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다. 그러나 인간 섬유아세포의 사용은 윤리적 승인이 필요할 수 있습니다. 파이로시퀀싱을 위해 샘플 DNA를 준비할 때 PCR 설정에 대한 모범 사례를 따르는 것이 좋습니다. 동일한 프라이머를 사용한 빈번한 증폭은 앰플리콘 오염을 유발할 수 있으며 pre-PCR 영역과 post-PCR 영역 간의 엄격한 분리가 관찰되지 않는 경우 후속 유전형 분석에 편향을 유발할 수 있습니다. 여기에 제시된 파이프 라인은 단독 제조업체의 특정 장비를 사용합니다. 자세한 내용은 재료 표에서 확인할 수 있습니다. PCR을 위한 프라이머 설계는 원하는 경우 수동으로 수행할 수 있습니다. 그러나 이를 위해 기존 소프트웨어를 사용하는 것이 좋습니다( 재료 표 참조).
1. 파이로시퀀싱 프라이머 설계 및 분석 선택
- 소프트웨어로 프라이머 후보 얻기
- 유전자형 분석되는 종에 대한 mtDNA 염기서열 파일을 획득하고, SNP의 위치를 확인한다. 사용된 참조 서열이 SNP의 위치를 쉽게 식별할 수 있도록 연구된 돌연변이에 대해 적절한 염기 번호를 사용하는지 확인합니다.
- SNP 부위의 업스트림 및 다운스트림 1,000개 염기쌍을 복사하고 절단된 서열을 파이로시퀀싱 프라이머 설계를 위한 소프트웨어에 붙여넣습니다( 재료 표 참조).
- 소프트웨어에서 다형성 염기를 강조 표시하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 후 표적 영역 설정을 선택하여 분석된 SNP 염기를 파이로시퀀싱 분석의 표적으로 설정합니다.
- 인터페이스의 오른쪽 상단 모서리에 있는 재생 아이콘을 눌러 프라이머 선택을 시작합니다.
- 이제 소프트웨어가 자동으로 프라이머 트리오를 생성할 때까지 기다립니다: 템플릿 DNA의 사전 증폭을 위한 프라이머 2개와 파이로시퀀싱 기계에서 합성하여 시퀀싱하기 위한 세 번째 프라이머. 를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 copy all primer sets(모든 프라이머 세트 복사)를 선택하여 모든 프라이머 세트를 유지합니다.
- 생성된 목록에서 최적의 프라이머 세트 선택
- 소프트웨어 출력에 따라 품질 점수가 가장 높은 프라이머 세트를 유지하고, 품질 점수에 따라 내림차순으로 프라이머 세트를 제공합니다. 가능하면 점수가 80점 미만인 프라이머 세트를 생략합니다.
- 보유된 프라이머 세트의 경우, 증폭 프라이머 에 의해 생성된 앰플리콘을 식별하고 복사합니다 .
- https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 의 온라인 제출 포털을 사용하여 NCBI Blast를 사용하여 유전자형 분석할 유기체의 전체 게놈과 생성된 앰플리콘을 정렬합니다. 제출 중 드롭다운 메뉴에서 다음을 선택합니다.
- 데이터베이스 선택 | 게놈 + 전사체 데이터베이스.
- 분석된 SNP에 따라 드롭다운 메뉴에서 Human 또는 Mouse 를 선택합니다.
- 최적화 대상 | 다소 유사한 시퀀스 (Blastn).
- (선택 사항) 마우스 또는 인간 이외의 유기체를 유전형 분석하는 경우 제출 시 다음을 선택하십시오.
- 데이터베이스 선택 | 표준 데이터베이스.
- 드롭다운 메뉴에서 RefSeq 대표 게놈 을 선택합니다.
- 최적화 대상 | 다소 유사한 시퀀스 (Blastn)
- 가능하면 mtDNA 앰플리콘과 완벽한 상동성을 갖는 앰플리콘을 생략하고, 특히 프라이머 결합 영역이 완벽하게 상동성인 경우 생략합니다(논의 참조).
참고: BLAST 정렬 도구는 사전 증폭 앰플리콘에 상당한 상동성을 가진 모든 시퀀스를 반환합니다. 이를 통해 도입부에 설명된 NUMT를 검출할 수 있으며, 설명되지 않으면 미토콘드리아 DNA와 함께 증폭될 때 편향을 유발할 수 있습니다. - 이 파이프라인을 통해 얻은 올리고를 주문하십시오. 5' 비오틴 변형이 합성 순서 동안 올바른 증폭 프라이머에 추가되어 시퀀싱 프라이머가 비오티닐화 가닥에 보완되도록 합니다.
참고: 시퀀싱 프라이머의 선택은 증폭 프라이머보다 더 유연하며 시퀀싱 프라이머의 3' 말단과 가변 위치를 분리하는 염기가 하나 이상 있는 것이 좋습니다.
2. Preamplification PCR 최적화
- 적절한 방법을 이용하여 전체 게놈 DNA를 추출하여 DNA 시료를 준비한다.
참고: 이것은 유전자형이 지정되는 세포의 수와 그 기원에 따라 크게 달라집니다. 프로테이나제 K를 함유하는 용해 완충액을 사용하여 단일 세포로부터 DNA를 분리하는 경우, 샘플은 후속 PCR 동안 중합효소를 방해하지 않도록 95°C에서 10분 동안 변성되어야 합니다. - PCR 설정 및 열 차단 설정
- 선택한 고충실도 중합효소로 PCR을 설정합니다. 4가지 반응에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 파이로시퀀싱 실행에는 10 μL의 PCR 반응만 필요하므로 25 μL의 PCR 반응을 준비합니다(필요한 경우 기술적 반복을 허용하기 위해). 약 10ng의 게놈 DNA를 출발 물질로 하여 1μM의 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 40주기의 PCR을 사용합니다.
- 선택한 사전 증폭 프라이머의 길이를 고려하여 사용된 중합효소에 대한 제조업체의 사양에 따라 연장 시간을 설정합니다.
- 다양한 어닐링 온도 설정이 있는 열 순환기를 사용하십시오. 어닐링 온도는 프라이머 서열, 중합효소 완충액의 염 함량 및 기타 요인에 따라 다를 수 있으므로 열 사이클링 프로그램에 4가지 다른 어닐링 온도를 프로그래밍합니다.
참고: 대표적인 결과의 작업 예는 55°C, 60°C, 65°C 및 70°C의 온도를 사용했습니다. - 마스터 믹스를 4개의 200μL PCR 튜브로 분할하고 40주기 동안 열 사이클러에서 선택한 4개의 어닐링 온도 각각에서 실행되도록 설정합니다.
- 프리증폭 대역 시각화
- PCR 실행 중에 SYBR Safe 또는 에티듐 브로마이드를 시각화제로 사용하여 1x TBE에서 2%(w/v) 아가로스 겔을 준비합니다.
참고: 증폭된 단편은 일반적으로 짧고 일반적으로 100에서 500 염기쌍 범위이므로 시각화를 위해 더 높은 비율의 젤을 권장합니다. - 2.2단계의 PCR이 완료된 후 반응물 10μL를 적절한 양의 DNA 로딩 완충액과 혼합하고 2% 아가로스 겔에서 7V/cm에서 약 45분 동안 실행합니다.
- UV transilluminator에서 결과 DNA 단편을 시각화합니다.
알림: 사전을 위해 선택된 열 순환 조건amplification 단계는 예상 크기의 단일 깨끗한 밴드를 생성해야 합니다. 어닐링 온도가 낮으면 때때로 타겟 이탈 증폭이 발생할 수 있으며, 이는 후속 파이로시퀀싱에 편향을 유발할 수 있습니다. - 후속 증폭을 위해 올바른 크기의 깨끗한 밴드를 생성하는 가장 낮은 어닐링 온도를 선택하십시오.
- (선택 사항) 예상 크기의 밴드를 절제하고, 선택한 겔 추출 키트를 사용하여 정제하고, Sanger 시퀀싱으로 분석하여 샘플의 대략적인 이형질을 참조로 확인합니다.
- PCR 실행 중에 SYBR Safe 또는 에티듐 브로마이드를 시각화제로 사용하여 1x TBE에서 2%(w/v) 아가로스 겔을 준비합니다.
3. 기기 설정 및 실행
참고: 이전 섹션의 PCR 단계가 최적화되면 다음 단계는 특정 SNP를 분석하기 위해 올바른 뉴클레오티드 서열로 파이로시퀀서를 프로그래밍하는 것입니다. 여기에는 시퀀싱 프라이머의 3' 말단의 바로 하류에 10개의 염기를 입력하는 것이 포함됩니다. 이 내용은 다음 섹션에 자세히 설명되어 있습니다.
- 분석 구성
- 파이로시퀀서와 함께 제공된 실행 소프트웨어를 열고 인터페이스의 왼쪽 상단 모서리에 있는 New Assay 를 선택합니다.
- 대립유전자 정량화 분석 템플릿을 선택합니다.
- 관심 있는 SNP의 상류에 있어야 하는 염기서열 분석 프라이머의 바로 하류에 통합될 뉴클레오티드를 입력하여 해당 상자에 분석하고자 하는 서열 을 입력한다. 변수 위치의 경우 슬래시로 구분된 두 개의 가능한 밑을 나타냅니다(예: A/T).
- 분주 순서 생성을 누르고 소프트웨어가 시퀀싱에 의한 합성 반응에서 분주할 뉴클레오티드에 적합한 순서를 자동으로 결정하도록 합니다.
- 분석의 이름을 저장하고 제공합니다.
- 시약 준비 및 보관
- pyrosequencer 시약 키트에 제공된 어닐링 버퍼에 4 μM로 주문된 시퀀싱 프라이머를 희석합니다.
참고: 염기서열 분석 프라이머는 먼저 원액으로 물에 100μM로 희석한 다음 필요에 따라 어닐링 버퍼에서 4μM로 추가로 희석할 수 있습니다. - 효소 및 기질 준비 및 취급
- 처음 개봉할 때, 제조업체의 권장 사항에 따라 동결건조된 효소와 기질을 재용해하십시오. 사용하지 않을 때는 -20 °C에서 보관하십시오.
- 후속 사용시, 효소 및 기질 바이알을 -20°C에서 해동한다.
알림: 제공된 키트의 다른 모든 시약은 4°C에서 냉장 보관할 수 있습니다. 희석된 시퀀싱 프라이머는 또한 4°C에서 보관할 수 있습니다.
- 필요한 양의 각 시약을 얼음에 놓습니다.
- 필요한 나머지 구성 요소, 즉 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드, 흡수 스트립 및 파이로시퀀싱 디스크를 4°C에서 보관하십시오.
- pyrosequencer 시약 키트에 제공된 어닐링 버퍼에 4 μM로 주문된 시퀀싱 프라이머를 희석합니다.
- 실행 실행
참고: 분석이 처음 설계될 때 분석이 이형질을 정확하게 구별할 수 있도록 알려진 이형질의 PCR 산물을 사용하여 보정해야 합니다. 연구자들은 알려진 이질형질의 PCR 산물 혼합물을 표준으로 사용할 수 있습니다. 샘플은 소개 및 논의에서 언급 된 다른 방법, 특히 NGS에 의해서도 검증 될 수 있습니다.- 분석할 DNA를 5ng/μL로 희석합니다. 특히 첫 번째 실행에서는 알려진 이종 플라스마 샘플을 참조 및/또는 야생형 샘플로 포함해야 합니다.
- 섹션 1 및 섹션 2에서 확인된 증폭 프라이머 및 파라미터를 사용하여 25μL 반응에서 희석된 DNA 5μL의 사전 시퀀싱 PCR을 수행합니다. 각 샘플에 대해 기술적 PCR 복제를 수행합니다.
참고: 사전amplification PCR은 시퀀싱을 진행하기 전에 4°C에서 단기간 또는 -20°C에서 장기간 보관할 수 있습니다. - 파일 설정 실행
- pyrosequencer 소프트웨어의 왼쪽 상단 모서리에 있는 New Run(새 실행 )을 선택합니다.
- 파이로시퀀서는 48개의 개별 사전 증폭 반응을 동시에 시퀀싱할 수 있으며, 빈 사각형은 파이로시퀀싱 디스크에서 단일 시퀀싱 웰을 나타냅니다. 사각형을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 부하 분석을 선택하여 섹션 3.1에 구성된 분석을 로드합니다. 필요한 경우 서로 다른 염기서열 분석 프라이머를 사용하여 최대 4개의 개별 분석을 시퀀싱합니다.
- 프라이머 분배 모드를 자동으로 설정하여 실행에 사용되는 각 시퀀싱 프라이머에 대해 주입 챔버를 자동으로 할당합니다.
- 하나의 염기서열 분석 디스크에서 4가지 다른 유형의 분석을 실행하지 않는 한 실행 모드를 표준 으로 설정합니다.
- 실행 템플릿 파일의 분석 수가 증폭되는 PCR 반응의 수와 일치하는지 확인합니다.
참고: 48개 이상의 샘플을 실행하는 경우 추가 실행 files를 설정해야 합니다. - 실행 파일을 USB 드라이브에 저장합니다.
- 파이로시퀀서 프라이밍
- 장치의 메인 터치 스크린에 있는 청소 버튼을 누르고 화면의 지시에 따라 모든 인젝터를 고순도 물로 청소 하십시오. 흡수 스트립을 기계에 삽입할 때 끝이 "9시 방향" 위치(중앙 바로 왼쪽)에서 만나는지 확인하십시오.
- 3.3.3단계에서 설정한 실행으로 USB 스틱을 연결하고 3.3.3단계에서 정의한 실행 파일을 로드합니다.
참고: 실행 파일은 USB의 디렉토리 또는 폴더 외부에 저장해야 하며, 그렇지 않으면 기기에서 읽을 수 없습니다. - 장치의 지침에 따라 필요에 따라 시약을 기계의 해당 인젝터에 로드하고 프라이밍합니다.
- 시료 디스크 전처리 및 분석 시작
- 스트렙타비딘으로 코팅된 마그네틱 비드가 실온과 평형을 이루도록 합니다.
참고: 이 비드는 장치가 사전 증폭 PCR 단계에서 비오티닐화된 가닥을 캡처할 수 있도록 합니다. 키트와 별도로 구매해야 합니다. - 3μL의 비드를 3.3.3단계의 실행 파일에 정의된 웰에 로드합니다.
- 시퀀싱할 각 PCR 반응 10μL을 해당 샘플에 로드하고 위아래로 피펫을 사용하여 샘플을 마그네틱 비드와 혼합합니다. 가능하면 거품을 피하십시오.
- 프라이밍된 파이로시퀀서에서 디스크를 기계에 로드할 수 있다는 표시를 찾습니다. 로드된 샘플 플레이트를 디스크 구획의 금속 핀에 맞추기 전에 플레이트 고정 너트의 나사를 풉니다.
- 플레이트가 플레이트 구획에 단단히 고정되면 터치스크린 인터페이스의 시작 버튼을 눌러 시퀀싱 실행을 시작합니다.
- 스트렙타비딘으로 코팅된 마그네틱 비드가 실온과 평형을 이루도록 합니다.
4. 결과 획득
- 실행이 완료되면 컴퓨터에서 USB 드라이브를 제거하고 파이로시퀀서 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 다시 연결합니다. 다음 단계를 진행하는 동안 오늘의 마지막 실행인 경우 프롬프트에 따라 파이로시퀀서 청소를 진행합니다.
- 새로 생성된 실행 파일이 USB 드라이브에 나타날 때까지 기다렸다가 실행 결과 파일을 두 번 클릭합니다. 이것은 뉴클레오티드 혼입 시 각 웰의 루시페라아제 출력을 자동으로 분석하고 섹션 3.1의 분석 구성 중에 정의된 관심 있는 미토콘드리아 대립유전자를 정량화합니다.
- 읽기 품질에 따라 소프트웨어에서 표시하는 다음 색상 점수를 찾습니다. 파란색은 최적 주행을 나타내고, 노란색은 경고가 있는 주행을, 빨간색은 실패한 주행을 나타냅니다. 결과를 저장하려면 상단 창에서 보고서 | 전체 보고서를 사용하여 실행의 각 웰에서 파이로그램 및 결과를 포함하는 .pdf 파일을 생성합니다. 또는 보고서 탭에서 다른 형식으로 결과를 다운로드합니다.
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Representative Results
이 섹션에서는 미토콘드리아 징크 핑거 뉴클레아제(mtZFN)로 처리된 이형질(m.5024C>T) 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 유전형 분석에서 시퀀싱 데이터뿐만 아니라 인간 병원성 mtDNA 돌연변이에 대한 파이로시퀀싱 분석의 최적화 예를 제시합니다. 인간 세포에 대한 분석을 최적화하고 두 가지 다른 분석을 비교하는 것은 가장 정확한 분석을 선택하는 방법을 보여주는 반면, 두 번째 예에서 유전자 변형 MEF 세포를 유전자 분석하는 것은 유전자 치료 개입 후 이형질 이동을 감지하는 응용 사례로 사용됩니다.
인간 m.3243A>G 돌연변이
이 예는 mtDNA-m.3243A>G의 일반적인 병원성 변이체의 유전자형 분석을 보여줍니다. 일반적인 m.3243A>G 돌연변이는 여러 임상 질환, 특히 미토콘드리아 뇌병증 유산산증 및 뇌졸중 유사 에피소드(MELAS), 산모 유전성 난청 및 당뇨병(MIDD), 진행성 외부 안근마비(PEO)의 기초가 됩니다23. 이 분석은 또한 프로토콜의 섹션 3.1.3에 설명된 바와 같이, 혼입될 뉴클레오티드의 서열을 재프로그래밍함으로써 덜 일반적인 m.3243A>T 변이체24 의 유전자형을 분석하는 데 사용될 수 있다.
섹션 1의 프라이머 최적화 가이드라인에 따라, 다음 프라이머 세트가 선택되었으며, 두 가닥 중 하나에 대해 하나씩:
분석 1 :
포워드: 5' - [비오틴] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
역방향: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
시퀀싱: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'
앰플리콘 크기: 215bp
분석 2 :
포워드: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
반전: 5' - [비오틴] GTTGGCCATGGGTATGTTGTT- 3'
시퀀싱: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'
앰플리콘 크기: 182bp
분석을 위한 열 사이클링 조건을 결정하기 위해, 핫 스타트 중합효소( 재료 표 참조)를 사용하는 열 구배 PCR을 먼저 수행하고 섹션 2에 따라 전기영동으로 분석했습니다. 시작 주형으로 약 10ng의 DNA를 증폭하기 위해 40 사이클을 사용했습니다. 프로토콜의 섹션 2.3 하의 단계에 따라, 주어진 어닐링 온도에서 증폭 프로토콜의 특이성을 검증하기 위해 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다(도 2A). 올바른 크기(215bp 또는 182bp)의 성공적인 밴드는 모든 온도에서 관찰될 수 있습니다. 그러나 분석 1에서 더 낮은 어닐링 온도는 off-target 증폭을 초래했습니다. 예비증폭을 위한 적절한 어닐링 온도는 70°C로 설정되었다(도 2A). 두 분석의 정확성을 확인하고 최상의 분석을 선택하기 위해, m.3243A>G의 각각 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% 및 100%의 다양한 비율로 적절한 부피의 순수 PCR 산물을 혼합하여 알려진 m.3243A>G 백분율의 몰 표준물질을 생성하였다(그림 2B, 점선). 표준에 대해 두 가지 분석을 모두 수행할 때 분석 2에서 예상되는 결과와 더 큰 상관관계가 관찰되었습니다(그림 2B). 그런 다음 유전자형 분석에서 m.3243A>G 사이브리드 세포에 대한 두 분석을 모두 사용했으며 특히 동형질 조건 근처에서 분석 1에서 뚜렷한 편향을 관찰했습니다(그림 2C).
쥐 m.5024C>T 돌연변이
이 예는 미토콘드리아 유전자 치료 실험의 예로서 m.5024C>T 돌연변이12 의 수준을 감소시키기 위해 개발된 mtZFN으로 처리된 MEF 세포를 포함하며, 여기서 파이로시퀀싱에 의한 유전자형 분석은 샘플 간의 정량적 비교로서 유용하다. MEF 세포는 마우스 mtDNA(m.5024C>T)25의 위치 5,024에 C>T 돌연변이가 있는 공개된 마우스 모델에서 파생됩니다. 이 실험은 mtZFN을 인코딩하는 플라스미드 및 상이한 형광 리포터로 MEF를 전기천공한 후 24시간 후에 FACS에 의해 플라스미드를 발현하는 세포를 분류하는 것을 포함했습니다. 이어서, 세포를 파이로시퀀싱에 의한 이질형질 비교 전에 2주 동안 회복시켰다.
m.5024C>T 위치를 시퀀싱하기 위해 사용된 프라이머 세트는 다음과 같았다.
포워드: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
역방향: 5' - [비오틴] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
시퀀싱: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'
앰플리콘 크기: 267bp
샘플은 결과의 충실도를 높이기 위해 기술적으로 세 배로 시퀀싱되었습니다. 실험은 또한 생물학적 복제로 수행되어 각 조건에 대해 6개의 개별 값을 생성했습니다(그림 3B). 18개의 파이로그램 중 2개의 데이터를 사용하여 그림 3B를 구성했습니다. 이러한 파이로그램은 그림 3A에 표시됩니다.
그림 1: 세포의 미토콘드리아 서열을 나타내는 회로도와 파이로시퀀싱의 일반적인 기술 개요. (A) 미토콘드리아 DNA 및 핵 미토콘드리아 서열의 개략도. 이 그림은 높은 상동성 서열의 진화적 기원을 나타냅니다. (B) 대략 50% C>G 이형질 값을 묘사하는 최종 예제 시퀀스를 갖는 파이로시퀀싱 분석 파이프라인의 개략도. 주형 DNA는 먼저 선택된 증폭 프라이머에 의해 증폭되며, 그 중 하나는 5' 말단에서 비오티닐화됩니다. 증폭 후, 파이로시퀀서는 파란색으로 표시된 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 염기서열 분석을 위한 주형으로 DNA의 단일 가닥을 유지합니다. 마지막으로, 염기서열분석 프라이머는 미리 정의된 일련의 뉴클레오티드를 합성하여 염기서열분석을 가능하게 하여 개략적으로 표현되는 파이로그램을 생성합니다. 각 염기의 화학량론은 각 혼입 이벤트에서 상대적인 피크 높이를 비교함으로써 쉽게 얻을 수 있다: 동일한 뉴클레오티드가 연속으로 두 번 연속으로 단일 염기에 비해 이중 피크를 생성할 것이다. 분석할 시퀀스의 슬래시는 "C" 또는 "G"일 수 있는 가상의 SNP를 나타냅니다. 파이로그램의 x축에 있는 모의 "G" 베이스의 초기 분배에 주목하며, 이는 일반적으로 파이로시퀀서에 의해 음성 대조군으로 수행됩니다. 약어: mtDNA = 미토콘드리아 DNA; NUMTs = 핵 미토콘드리아 서열. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 인간 m.3242A>G 돌연변이에 대해 설명된 파이로시퀀싱 프라이머 세트의 최적화. (A) m.3242A>G 돌연변이에 대해 선택된 두 세트의 증폭 프라이머를 사용한 PCR 증폭의 아가로스 겔 전기영동(2% w/v). WT는 야생형 대조군 DNA를 나타내는 반면, Het는 분석할 거의 동형질에 가까운 m.3243A>G 샘플입니다. 온도는 40 사이클 PCR 반응에 사용되는 어닐링 온도입니다. (B). 순수 야생형 및 순수 돌연변이체 m3243A>G 생성물의 다양한 비율을 혼합함으로써 수득된 보정을 위한 몰 표준물질을 사용하여 두 프라이머 세트의 성능을 비교하였다. 측정값은 수직 점선으로 표시됩니다. X = Y 선형 함수는 테스트된 두 분석 각각이 이상적인 측정에 얼마나 가까운지를 보여주기 위해 표시됩니다. x축에 있는 세포주의 이름은 이 분석을 사용하여 유전자형이 분석된 다양한 사이브리드 클론의 이름입니다. (C) 두 분석을 모두 사용하여 알려지지 않은 m.3243A>G 이형질의 4개의 사이브리드 클론에 대한 유전형 분석 결과. 시퀀싱은 기술적 삼중으로 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: mtZFN 유전자 편집 기술로 처리된 FACS로 분류된 m.5024C>T MEF의 이종형질 측정. (A) 그림 3B를 생성하는 데 사용된 두 개의 MEF 세포 샘플 PCR 복제물 및 야생형 유전형 분석 대조군의 파이로그램. Y축의 발광 값은 A.U. (B) mtZFN 처리된 세포와 미처리 및 모의 처리된 대조군의 유전형 분석 결과입니다. MEF는 mtZFN을 인코딩하는 플라스미드 및 상이한 형광 리포터로 전기천공된 후 24시간 후에 FACS에 의해 분류되었습니다. 이어서, 세포를 파이로시퀀싱에 의한 이질형질 비교 전에 2주 동안 회복시켰다. 오차 막대는 생물학적 복제본으로 계산되었으며, 각각은 기술적으로 세 번 파이로시퀀싱을 거쳤습니다. 약어: FACS = 형광 활성화 세포 분류; MEFs = 마우스 배아 섬유아세포; mtZFN = 미토콘드리아 징크 핑거 뉴클레아제; A.U. = 임의의 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜의 성공을 위한 중요한 측면은 특히 소량의 출발 물질을 사용할 때 오염을 피하는 것입니다. 가능하면 샘플을 준비할 때 UV 후드와 여과된 피펫 팁을 사용하고 사전 증폭 영역과 사후 증폭 영역을 분리하는 것이 좋습니다. 블랭크 측정 및 알려진 이질형질(예: 야생형 DNA)의 샘플은 기술적 또는 생물학적 편향을 확인하기 위한 벤치마크로 사용하기 위해 항상 포함되어야 합니다.
분석에 내재된 주목할만한 기술적 편향은 아데닌 아날로그 통합에 의해 생성된 증가된 발광 신호입니다. 아데닌이 가변 위치에서 사용될 때, 종종 잔류 형광 피크를 생성한다(예를 들어, 도 2C). 이러한 이유로 가능한 경우 가변 위치에서 아데닌 유사체를 통합하지 않아도 되도록 반대쪽 가닥(티민이 통합될 위치)에서 파이로시퀀싱 분석을 실행하는 것이 좋습니다. 그러나 A>T 또는 T>A 돌연변이의 경우 불가능합니다. 그럼에도 불구하고, 대표적인 결과에서 입증 된 바와 같이, 프라이머의 적절한 선택은 분석을 설계 할 때 더 중요 할 수 있습니다. m.3243A>G 돌연변이에 대한 분석 2, 대표 결과의 첫 번째 섹션에서 T/C 비율을 측정하는 분석 1과 대조적으로 가변 위치에서의 A/G 비율을 기반으로 한 서열. 아데닌 혼입 편향에 취약함에도 불구하고 분석 2는 간단한 선형 회귀 분석에서 볼 수 있듯이 몰 표준물질과의 비교를 기반으로 보다 정확한 결과를 제공합니다(그림 2B).
편향은 주로 NUMT co-amplification3의 결과이다. 큰 미토콘드리아 복제 수는 일반적으로 핵 off-target 서열이 상당한 편향을 도입하는 것을 방지합니다. 그러나, mtDNA의 특정 영역은 많은 NUMTS에 존재하며, 섹션 1의 프로토콜에 표시된 방법을 사용하여 피해야 한다.
앞서 언급한 예방 조치를 취할 때 이 방법은 mtDNA에서 SNP의 유전형 분석을 위한 고도로 모듈화되고 신속하며 비용 효율적인 수단입니다. 그러나, 이 방법은 모든 미토콘드리아 유전형 분석 응용 분야, 특히 디지털 액적 PCR이 권장되는 대규모 결실에 적합하지 않다26. 시퀀서 또는 다른 프라이머/증폭 조건에 의한 시약 분배의 가변성은 작은 편향이 도입될 수 있습니다. 이러한 이유로 유전형 분석 결과의 정확성을 확인하기 위해 일반적으로 기술적 삼중이 권장됩니다. 이 접근법의 또 다른 한계는 mtDNA의 짧고 미리 정의된 범위만 유전자형을 분석할 수 있기 때문에 범위입니다. 파이로시퀀서는 알려지지 않은 염기서열의 수백 개의 염기쌍을 시퀀싱하도록 프로그래밍할 수 있지만, 이는 NGS 접근 방식을 사용하는 것보다 비용 효율성이 떨어집니다. 연구원들은 처음에는 정확한 정량적 답을 산출하는 신속한 유전형 분석 방법으로 파이로시퀀싱을 구현할 수 있었지만 이후 NGS로 선택한 샘플을 분석하여 정밀도와 맥락을 높일 수 있었습니다.
결론적으로, 이 잘 확립된 방법은 미토콘드리아 유전 연구의 필수 요소로 남아 있으며, 환자 진단, 유전자 치료 또는 동물 모델의 유전자형 분석과 같은 현장의 많은 연구 맥락에서 핵심적인 정량적 이형질 측정에 빠르고 간단하게 액세스할 수 있습니다.
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Disclosures
M.M.은 Pretzel Therapeutics, Inc.의 공동 창립자이자 주주이며 과학 자문 위원회의 회원입니다. P.A.N.은 Pretzel Therapeutics, Inc.에 컨설팅 서비스를 제공합니다.
Acknowledgments
이 프로토콜의 예시로 사용된 m.3243A>G 사이브리드 세포를 준비하고 제공한 Silvia Marchet과 Constanza Lamperti(Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milan)에게 감사드립니다. 또한 이 연구 과정에서 유용한 토론을 해주신 미토콘드리아 유전학 그룹(MRC-MBU, 케임브리지 대학교)의 회원들에게도 감사드립니다. 이 작업은 영국 의학 연구 위원회(MC_UU_00015/4 및 MC_UU_00028/3)의 핵심 자금 지원을 받았습니다. P.A.N. 및 P.S.-P. 릴리 재단(The Lily Foundation)과 챔프 재단(The Champ Foundation)이 각각 추가로 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
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