Summary
पायरोसीक्वेंसिंग परख हेटरप्लाज्मिक कोशिकाओं या ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं की मजबूत और तेजी से जीनोटाइपिंग को सक्षम करती है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम (एमटीडीएनए) में उत्परिवर्तन मातृ विरासत में मिली आनुवंशिक बीमारियों से जुड़ा हुआ है। हालांकि, एमटीडीएनए म्यूटेनेसिस द्वारा मॉडल का उत्पादन करने की हाल ही में विकसित क्षमता और माइटोकॉन्ड्रियल आनुवंशिक विपथन और कैंसर, मधुमेह और मनोभ्रंश जैसी सामान्य उम्र से संबंधित बीमारियों के बीच संबंध की एक नई सराहना के कारण हाल के वर्षों में एमटीडीएनए बहुरूपताओं में रुचि बढ़ी है। पायरोसीक्वेंसिंग एक अनुक्रमण-दर-संश्लेषण तकनीक है जो नियमित जीनोटाइपिंग प्रयोगों के लिए माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र में व्यापक रूप से नियोजित है। बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण विधियों और कार्यान्वयन में आसानी की तुलना में इसकी सापेक्ष सामर्थ्य इसे माइटोकॉन्ड्रियल आनुवंशिकी के क्षेत्र में एक अमूल्य तकनीक बनाती है, जिससे बढ़े हुए लचीलेपन के साथ हेटरोप्लाज्मी की तेजी से मात्रा का ठहराव होता है। इस पद्धति की व्यावहारिकता के बावजूद, एमटीडीएनए जीनोटाइपिंग के साधन के रूप में इसके कार्यान्वयन के लिए कुछ दिशानिर्देशों के अवलोकन की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से जैविक या तकनीकी मूल के कुछ पूर्वाग्रहों से बचने के लिए। यह प्रोटोकॉल हेटरोप्लाज्मी माप के संदर्भ में उपयोग के लिए पाइरोसीक्वेंसिंग परख को डिजाइन और कार्यान्वित करने में आवश्यक कदमों और सावधानियों को रेखांकित करता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम मैट्रिक्स नामक माइटोकॉन्ड्रिया के सबसे भीतरी डिब्बे में मौजूद छोटे (16.5 केबी) परिपत्र अणुओं (एमटीडीएनए) के रूप में मौजूद है और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन श्रृंखला के 13 सबयूनिट्स को एन्कोड करता है, साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम1 द्वारा सीटू में उनके अनुवाद के लिए आवश्यक टीआरएनए और आरआरएनए भी है। यह जीनोम माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के लिए आवश्यक सभी प्रोटीनों के लगभग 1% का प्रतिनिधित्व करता है, जिनमें से शेष परमाणु डीएनए (एनडीएनए) द्वारा एन्कोड किए जाते हैं। यह आमतौर पर माना जाता है कि माइटोकॉन्ड्रिया एक अल्फा-प्रोटियोबैक्टीरियल पूर्वज और एक पैतृक यूकेरियोटिक कोशिका के बीच एक एंडोसिम्बायोटिक संलयन घटना से प्राप्त होते हैं। एक बार जब यह काल्पनिक सहजीवन हुआ, तो माइटोकॉन्ड्रिया की आनुवंशिक जानकारी धीरे-धीरे आयनों पर नाभिक में स्थानांतरित हो गई, जो आधुनिक सायनोबैक्टीरिया2 के जीनोम की तुलना में एमटीडीएनए की उपरोक्त कॉम्पैक्टनेस की व्याख्या करती है। जीन का ऐसा हस्तांतरण एनडीएनए के लंबे हिस्सों के अस्तित्व से सबसे दृढ़ता से प्रमाणित होता है जो एमटीडीएनए में पाए जाने वाले अनुक्रमों के लिए अत्यधिक समरूप हैं। ये परमाणु माइटोकॉन्ड्रियल अनुक्रम (NUMT) जीनोटाइपिंग के दौरान गलत व्याख्या का एक सामान्य स्रोत हैं, और जीनोटाइपिंग एमटीडीएनए3 (चित्रा 1 ए) के दौरान परमाणु पूर्वाग्रहों से बचने के लिए कुछ सावधानियां बरतनी चाहिए।
एमटीडीएनए की एक और विशिष्ट विशेषता यह है कि इसकी प्रतिलिपि संख्या सेल प्रकार के आधार पर भिन्न होती है, प्रति सेल4 में दसियों से हजारों प्रतियों तक की संख्या होती है। इस बहु-प्रतिलिपि प्रकृति के कारण, एमटीडीएनए एक एकल कोशिका के भीतर जीनोटाइप की एक विस्तृत श्रृंखला को परेशान कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप गुणसूत्रों की जाइगोसिटी पर विचार करते समय परमाणु जीन से जुड़े असतत एलील्स के विपरीत एलील्स का अधिक निरंतर वितरण हो सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल एलील्स की इस विषमता को माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी के रूप में जाना जाता है, जिसे आमतौर पर किसी दिए गए सेल में कुल एमटीडीएनए के अनुपात के रूप में किसी दिए गए उत्परिवर्तन के प्रतिशत प्रसार में व्यक्त किया जाता है। हेटरोप्लाज्मी को होमोप्लाज्मी के साथ विपरीत किया जा सकता है, जो एक सेल में मौजूद एमटीडीएनए की एक अनूठी प्रजाति को संदर्भित करता है।
रोगजनक वेरिएंट को परेशान करने वाले एमटीडीएनए अणुओं के अनुपात को निर्धारित करते समय माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी को मापना विशेष रुचि का है। इस तरह के वेरिएंट एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी), छोटे इंडेल, या बड़े पैमाने पर विलोपनके रूप में आते हैं। अधिकांश मनुष्य रोगजनक वेरिएंट के लिए हेटरप्लाज्मिक हैं; हालांकि, वे किसी भी नैदानिक फेनोटाइप का प्रदर्शन नहीं करते हैं, जो अक्सर केवल रोगजनक एमटीडीएनए के उच्च हेटरोप्लाज्मी स्तरों पर प्रकट होते हैं, जिसे थ्रेशोल्ड प्रभाव6 कहा जाता है। जबकि रोगजनकता से जुड़े मूल्य रोगजनक उत्परिवर्तन की प्रकृति और ऊतक पर अत्यधिक निर्भर होते हैं जिसमें यह होता है, वे आम तौर पर 60% हेटरोप्लाज्मी7 से ऊपर होते हैं।
कई शोध क्षेत्र हैं जिनमें माइटोकॉन्ड्रियल जीनोटाइपिंग आम है। चिकित्सा क्षेत्र में, एमटीडीएनए उत्परिवर्तन के लिए परीक्षण या मात्रा माइटोकॉन्ड्रियल रोगों के लिए नैदानिक मानदंड के रूप में काम कर सकती है, जिनमें से कई में एमटीडीएनए विपथन उनके मूलके रूप में हैं। मानव रोगजनक उत्परिवर्तन के अध्ययन के अलावा, एमटीडीएनए में रोगजनक एसएनपी को आश्रय देने वाले पशु मॉडल की व्यापकता बढ़ने की संभावना है, हाल ही में माइटोकॉन्ड्रियल रूप से लक्षित डीडीडीए-व्युत्पन्न साइटोसिन बेस एडिटर्स (डीडीसीबीई) 8 और टीएएल-आधारित डेमिनेज (टीएएलईडी) द्वारा सक्षम माइटोकॉन्ड्रियल बेस एडिटिंग के आगमन को देखते हुए।. यह दृष्टिकोण असामान्य माइटोकॉन्ड्रियल जीनोटाइप और परिणामस्वरूप शिथिलता के बीच परस्पर क्रिया को समझने में सहायक होगा। हेटेरोप्लाज्मी शिफ्टिंग के रूप में जाना जाने वाला दृष्टिकोण के माध्यम से मानव माइटोकॉन्ड्रियल रोगों में चिकित्सीय रणनीति के रूप में अंतिम उपयोग के लिए माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम को फिर से तैयार करने में वैज्ञानिक अनुसंधान भी चल रहा है। अनुसंधान के इस क्षेत्र में मुख्य रूप से माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में उत्परिवर्तन-विशिष्ट न्यूक्लियस को निर्देशित करना शामिल है; इसके परिणामस्वरूप रोगजनक एमटीडीएनए का अधिमान्य क्षरण होता है, जिससे फेनोटाइप10,11,12,13 में बचाव होता है। माइटोकॉन्ड्रियल जीनोटाइप के रीमॉडेलिंग से जुड़े किसी भी प्रयोग को हेटरोप्लाज्मी शिफ्ट का आकलन करने के लिए एक मजबूत मात्रात्मक विधि की आवश्यकता होती है।
एमटीडीएनए को जीनोटाइप करने के लिए विभिन्न प्रकार के तरीकों का उपयोग किया जाता है, और ये उत्परिवर्तन की प्रकृति के अनुसार भिन्न होते हैं। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) विधियां अधिक सटीक हैं जब एमटीडीएनए में एसएनपी की मात्रा निर्धारित करने की बात आती है; हालांकि, माइटोकॉन्ड्रियल हेटरोप्लाज्मी के नियमित परिमाणीकरण के लिए ये विधियां निषेधात्मक रूप से महंगी रहती हैं, खासकर अगर नमूनों की संख्या छोटी है। सेंगर अनुक्रमण एसएनपी का पता लगाने के लिए भी अनुमति दे सकता है; हालांकि, यह दृष्टिकोण मात्रात्मक नहीं है और अक्सर हेटरोप्लाज्मी के निम्न स्तर का पता लगाने में विफल रहता है या उच्च हेटरोप्लाज्मी का अनुमान लगाते समय गलत हो सकता है। पाइरोसीक्वेंसिंग, एक परख के रूप में जिसमें न्यूनतम तैयारी शामिल है और किसी भी एमटीडीएनए नमूने के लिए हेटरोप्लाज्मी की तेजी से मात्रा का ठहराव करने में सक्षम बनाता है, इन दो चरम सीमाओं के बीच एक उपयुक्त समझौता के रूप में प्रस्तावित है। इस विधि का उपयोग विभिन्न संदर्भों में कई शोधकर्ताओं द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल एसएनपी को निर्धारित करने के लिए नियमित रूप से किया गया है, जिसमें फोरेंसिक विश्लेषण 14,15, नैदानिक निदान16, या एकल कोशिकाओं17 से एमटीडीएनए की जीनोटाइपिंग शामिल है।
इस परख में एमटीडीएनए में एसएनपी के किनारे एक क्षेत्र का पहला पीसीआर प्रीएम्प्लिफिकेशन चरण शामिल है, जिसके बाद पहले से उत्पन्न एम्प्लिकॉन के एक स्ट्रैंड का उपयोग करके अनुक्रमण-दर-संश्लेषण परख होती है। प्रीएम्प्लिफिकेशन चरण में उपयोग किए जाने वाले दो प्राइमरों में से एक को 5 'अंत पर बायोटिनीलेटेड किया जाना चाहिए, जो पाइरोसीक्वेंसिंग तंत्र को अनुक्रमण प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने के लिए डीएनए के एकल स्ट्रैंड को अलग करने में सक्षम करेगा। एक तीसरे अनुक्रमण प्राइमर को तब बरकरार बायोटिनीलेटेड स्ट्रैंड पर लगाया जाता है, जो प्रतिक्रिया कक्ष में पूर्वनिर्धारित क्रम में डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड्स के रूप में नवजात डीएनए संश्लेषण की अनुमति देता है। पाइरोसीक्वेंसर एक ल्यूमिनेसेंट रीडआउट के आधार पर शामिल प्रत्येक आधार की मात्रा को रिकॉर्ड करता है, जिससे डीएनए संश्लेषण पर उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के माइटोकॉन्ड्रियल एलील्स की सापेक्ष मात्रा का ठहराव होता है (चित्रा 1 बी)। ल्यूमिनेसेंस एक ल्यूसिफेरस एंजाइम द्वारा उत्पन्न होता है, जो एटीपी की उपस्थिति में प्रकाश का उत्सर्जन करता है कि एक एटीपी सल्फ्यूरिलेस प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड द्वारा जारी पाइरोफॉस्फेट से प्रत्येक निगमन घटना में डी नोवो को संश्लेषित करता है। इन दो प्रतिक्रियाओं को संक्षेप में निम्नानुसार किया जा सकता है:
1. पीपीआई (न्यूक्लियोटाइड निगमन से) + एपीएस → एटीपी + सल्फेट (एटीपी सल्फ्यूरिलेज)
2. एटीपी + लूसिफेरिन + ओ 2 → एएमपी + पीपीआई + ऑक्सीलुसिफेरिन + सीओ2 + प्रकाश (ल्यूसिफेरस)
दूसरी प्रतिक्रिया में ल्यूसिफेरस के साथ एटीपी क्रॉस-रिएक्शन के बिना पाइरोसीक्वेंसर द्वारा एडेनिन बेस का पता लगाना एक चुनौती है। हालांकि, यह डीएनए संश्लेषण के लिए एक एडेनिन एनालॉग का उपयोग करके हल किया जाता है, अर्थात् डीएटीपीएस। ल्यूसिफेरस के लिए एक आदर्श सब्सट्रेट नहीं होने के बावजूद, यह तीन अन्य न्यूक्लियोटाइड ्स की तुलना में एक मजबूत ल्यूमिनेसेंस पैदा करता है, जिसे पाइरोसीक्वेंसर द्वारा डिजिटल रूप से समायोजित किया जाता है और 0.9 के कारक पर सेट किया जाता है। इस अंतर्निहित परिवर्तनशीलता के कारण, एसएनपी स्थिति में अनुक्रमण एडेनिन से बचने का सुझाव दिया जाता है (अधिक विवरण के लिए चर्चा देखें)।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल पाइरोसीक्वेंसिंग द्वारा एमटीडीएनए हेटरोप्लाज्मी मूल्यांकन की विधि का विवरण देता है और एमटीडीएनए में एसएनपी को जीनोटाइपिंग करते समय जैविक या तकनीकी पूर्वाग्रह से बचने के लिए प्रवर्धन प्राइमरों को डिजाइन करने में आवश्यक सावधानियों की रूपरेखा तैयार करता है। उत्तरार्द्ध में प्राइमर सेट ों का डिजिटल रूप से सर्वेक्षण और चयन करना, पूर्वप्रवर्धन पीसीआर को अनुकूलित करना और अंत में, परख को अनुक्रमित और परिष्कृत करना शामिल है। दो लागू उदाहरण परख ों का प्रदर्शन किया जाता है: पहला, सबसे आम मानव रोगजनक संस्करण m.3243A>G 18 का अनुकूलन, और दूसरा, माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (MEF) कोशिकाओं की जीनोटाइपिंग जो कैम्ब्रिज 10,11,12,19,20,21,22 में मिन्ज़ुक प्रयोगशाला में विकसित प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके हेटरोप्लाज्मी स्थानांतरण से गुजरी हैं।
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Protocol
इस अध्ययन में उपयोग किए गए मानव 3243 ए>जी साइब्रिड कोशिकाओं और अमर एम.5024सी>टी एमईएफ के उपयोग के लिए सूचित सहमति प्रदान की गई थी। इस उदाहरण में नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता नहीं थी क्योंकि कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय में रोगी कोशिकाओं को एकत्र नहीं किया गया था। मानव फाइब्रोब्लास्ट के उपयोग को, हालांकि, नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है। पायरोसीक्वेंसिंग के लिए नमूना डीएनए तैयार करते समय पीसीआर सेटअप के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का पालन करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। समान प्राइमरों का उपयोग करके लगातार प्रवर्धन से एम्पलीकॉन संदूषण हो सकता है और यदि प्री-पीसीआर और पोस्ट-पीसीआर क्षेत्रों के बीच सख्त अलगाव नहीं देखा जाता है तो बाद की जीनोटाइपिंग में पूर्वाग्रह पेश किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत पाइपलाइन एकमात्र निर्माता से विशिष्ट उपकरण का उपयोग करती है; विवरण सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है। पीसीआर के लिए प्राइमर डिज़ाइन मैन्युअल रूप से किया जा सकता है यदि वांछित हो; हालाँकि, इस उद्देश्य के लिए मौजूदा सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है ( सामग्री की तालिका देखें)।
1. पाइरोसीक्वेंसिंग प्राइमर डिजाइन और परख चयन।
- सॉफ्टवेयर के साथ प्राइमर उम्मीदवारों को प्राप्त करना
- जीनोटाइप होने वाली प्रजातियों के लिए एक एमटीडीएनए अनुक्रम फ़ाइल प्राप्त करें, और एसएनपी की स्थिति की पहचान करें। सुनिश्चित करें कि उपयोग किया गया संदर्भ अनुक्रम अध्ययन किए गए उत्परिवर्तन के लिए उपयुक्त आधार नंबरिंग को नियोजित करता है ताकि एसएनपी की स्थिति को आसानी से पहचाना जा सके।
- एसएनपी साइट के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम 1,000 बेस जोड़े कॉपी करें, और कटे हुए अनुक्रम को पायरोसीक्वेंसिंग प्राइमर डिज़ाइन के लिए डिज़ाइन किए गए सॉफ़्टवेयर में पेस्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- पॉलीमॉर्फिक बेस को हाइलाइट करके और राइट-क्लिक करके और फिर सेट लक्ष्य क्षेत्र का चयन करके सॉफ्टवेयर में पायरोसीक्वेंसिंग परख के लक्ष्य के रूप में विश्लेषण किए गए एसएनपी बेस को सेट करें।
- प्राइमर चयन लॉन्च करने के लिए इंटरफ़ेस के ऊपरी दाएं कोने में प्ले आइकन दबाएं।
- सॉफ्टवेयर के अब स्वचालित रूप से प्राइमर तिकड़ी उत्पन्न करने की प्रतीक्षा करें: टेम्पलेट डीएनए के पूर्वप्रवर्धन के लिए दो प्राइमर और पाइरोसीक्वेंसिंग मशीन में संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण के लिए एक तीसरा प्राइमर। सभी प्राइमर सेटों पर राइट-क्लिक करके और कॉपी करके सभी प्राइमर सेट को बनाए रखें।
- जेनरेट की गई सूची से इष्टतम प्राइमर सेट का चयन करना
- सॉफ्टवेयर आउटपुट के आधार पर उच्चतम गुणवत्ता स्कोर के साथ प्राइमर सेट बनाए रखें, जो गुणवत्ता स्कोर के आधार पर अवरोही क्रम में प्राइमर सेट प्रदान करता है। यदि संभव हो, तो 80 से नीचे के स्कोर वाले प्राइमर सेट को छोड़ दें।
- बरकरार प्राइमर सेट के लिए, प्रवर्धन प्राइमरों द्वारा उत्पादित एम्प्लिकॉन को पहचानें और कॉपी करें।
- https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi पर ऑनलाइन सबमिशन पोर्टल का उपयोग करके एनसीबीआई ब्लास्ट का उपयोग करके जीव के पूरे जीनोम के साथ उत्पादित एम्प्लिकॉन को संरेखित करें। सबमिशन के दौरान ड्रॉपडाउन मेनू से, निम्न का चयन करें:
- डेटाबेस का चयन करें | जीनोमिक + ट्रांसक्रिप्ट डेटाबेस।
- विश्लेषण किए गए एसएनपी के आधार पर, ड्रॉपडाउन मेनू में मानव या माउस का चयन करें।
- के लिए ऑप्टिमाइज़ का चयन करें | कुछ समान अनुक्रम (ब्लास्टन)।
- (वैकल्पिक) यदि माउस या मानव के अलावा किसी अन्य जीव की जीनोटाइपिंग है, तो सबमिशन के दौरान निम्नलिखित का चयन करें:
- डेटाबेस का चयन करें | मानक डेटाबेस.
- ड्रॉपडाउन मेनू में रेफसेक प्रतिनिधि जीनोम का चयन करें
- के लिए ऑप्टिमाइज़ का चयन करें | कुछ हद तक समान अनुक्रम (ब्लास्टन)
- जब संभव हो, एमटीडीएनए एम्प्लिकॉन के लिए सही होमोलॉजी वाले किसी भी एम्प्लिकॉन को छोड़ दें, खासकर यदि प्राइमर बाइंडिंग क्षेत्र पूरी तरह से समरूप हैं (चर्चा देखें)।
नोट: ब्लास्ट संरेखण उपकरण पूर्व-प्रवर्धन एम्प्लिकॉन को काफी होमोलॉजी के साथ किसी भी अनुक्रम को वापस कर देगा। यह परिचय में वर्णित एनयूएमटी का पता लगाने की अनुमति देता है, जो यदि हिसाब नहीं दिया जाता है, तो पूर्वाग्रह को प्रेरित कर सकता है क्योंकि वे माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के साथ सह-प्रवर्धित होते हैं। - इस पाइपलाइन के माध्यम से प्राप्त ओलिगोस को ऑर्डर करें। सुनिश्चित करें कि संश्लेषण क्रम के दौरान सही प्रवर्धन प्राइमर में 5 'बायोटिन संशोधन जोड़ा जाता है, जैसे कि अनुक्रमण प्राइमर बायोटिनीलेटेड स्ट्रैंड का पूरक होगा।
नोट: अनुक्रमण प्राइमर का विकल्प प्रवर्धन प्राइमरों की तुलना में अधिक लचीला है, और अनुक्रमण प्राइमर के 3 'अंत और चर स्थिति को अलग करने वाले कम से कम एक आधार की सिफारिश की जाती है।
2. प्रीएम्प्लिफिकेशन पीसीआर ऑप्टिमाइज़ेशन।
- एक उपयुक्त विधि का उपयोग करके कुल जीनोमिक डीएनए निकालकर डीएनए नमूने तैयार करें।
नोट: यह काफी हद तक जीनोटाइप होने वाली कोशिकाओं की संख्या और उनकी उत्पत्ति पर निर्भर करेगा। यदि प्रोटीनके युक्त लाइसिस बफर का उपयोग करके एकल कोशिकाओं से डीएनए को अलग किया जाता है, तो नमूने को 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृत किया जाना चाहिए ताकि बाद के पीसीआर के दौरान पोलीमरेज़ को बाधित न किया जा सके। - पीसीआर सेटअप और थर्मल ब्लॉक सेटिंग्स
- पसंद के उच्च-निष्ठा पोलीमरेज़ के साथ पीसीआर सेट करें। चार प्रतिक्रियाओं के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। चूंकि पायरोसीक्वेंसिंग रन के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया के केवल 10 μL की आवश्यकता होती है, पीसीआर प्रतिक्रियाओं के 25 μL तैयार करें (यदि आवश्यक हो तो तकनीकी पुनरावृत्ति की अनुमति देने के लिए)। आगे और रिवर्स प्राइमरों दोनों के 1 μM के साथ शुरुआती सामग्री के रूप में जीनोमिक डीएनए के लगभग 10 ng के साथ पीसीआर के 40 चक्रों का उपयोग करें।
- चुने हुए प्रीएम्प्लिफिकेशन प्राइमरों की लंबाई को ध्यान में रखते हुए, उपयोग किए गए पोलीमरेज़ के लिए निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार विस्तार समय निर्धारित करें।
- परिवर्तनीय एनीलिंग तापमान सेटिंग्स के साथ थर्मल साइकलर का उपयोग करें। चूंकि प्राइमर अनुक्रम के आधार पर एनीलिंग तापमान भिन्न हो सकता है, पोलीमरेज़ बफर की नमक सामग्री, और अन्य कारक, थर्मल साइक्लिंग कार्यक्रम में चार अलग-अलग एनीलिंग तापमान प्रोग्राम करते हैं।
नोट: प्रतिनिधि परिणामों में काम किए गए उदाहरण ने निम्नलिखित तापमान का उपयोग किया: 55 डिग्री सेल्सियस, 60 डिग्री सेल्सियस, 65 डिग्री सेल्सियस और 70 डिग्री सेल्सियस। - मास्टर मिक्स को चार 200 μL PCR ट्यूबों में विभाजित करें, और उन्हें 40 चक्रों के लिए थर्मल साइकलर में चार चयनित एनीलिंग तापमानों में से प्रत्येक पर चलाने के लिए सेट करें।
- प्रीएम्प्लिफिकेशन बैंड विज़ुअलाइज़ेशन।
- पीसीआर रन के दौरान, एक विज़ुअलाइज़िंग एजेंट के रूप में एसवाईबीआर सेफ या एथिडियम ब्रोमाइड के साथ 1x टीबीई में 2% (डब्ल्यू / वी) एगारोस जेल तैयार करें।
नोट: विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक उच्च प्रतिशत जेल की सिफारिश की जाती है क्योंकि प्रवर्धित टुकड़े आमतौर पर छोटे होते हैं, आमतौर पर 100 से 500 बेस जोड़े तक होते हैं। - चरण 2.2 में पीसीआर पूरा होने के बाद, डीएनए लोडिंग बफर की उचित मात्रा के साथ प्रतिक्रिया के 10 μL मिलाएं, और लगभग 45 मिनट के लिए 7 V / cm पर 2% Agarose जेल पर चलाएं।
- एक यूवी ट्रांसइलुमिनेटर पर परिणामी डीएनए टुकड़ों की कल्पना करें।
नोट: प्रीएम्प्लिफिकेशन चरण के लिए चुनी गई थर्मल साइक्लिंग स्थितियों को अपेक्षित आकार के एकल स्वच्छ बैंड का उत्पादन करना चाहिए। कम एनीलिंग तापमान के परिणामस्वरूप कभी-कभी ऑफ-टारगेट प्रवर्धन हो सकता है, जो बाद के पाइरोसीक्वेंसिंग में पूर्वाग्रह पेश कर सकता है। - सबसे कम एनीलिंग तापमान का चयन करें जो बाद के प्रवर्धन के लिए सही आकार का एक साफ बैंड पैदा करता है।
- (वैकल्पिक) अपेक्षित आकार के एक बैंड का उत्पाद शुल्क, पसंद की जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके शुद्ध करें, और संदर्भ के रूप में नमूने के अनुमानित हेटरोप्लाज्मी की पुष्टि करने के लिए सेंगर अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण करें।
- पीसीआर रन के दौरान, एक विज़ुअलाइज़िंग एजेंट के रूप में एसवाईबीआर सेफ या एथिडियम ब्रोमाइड के साथ 1x टीबीई में 2% (डब्ल्यू / वी) एगारोस जेल तैयार करें।
3. उपकरण सेटअप और चलाएं
नोट: एक बार पिछले अनुभाग में पीसीआर चरण अनुकूलित हो जाने के बाद, अगले चरण में विशिष्ट एसएनपी के लिए विश्लेषण करने के लिए सही न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के साथ पाइरोसीक्वेंसर प्रोग्रामिंग शामिल है। इसमें अनुक्रमण प्राइमर के 3 'अंत के सीधे नीचे की ओर 10 ठिकानों में प्रवेश करना शामिल है। यह निम्नलिखित अनुभाग में विस्तृत है।
- परख विन्यास
- पायरोसीक्वेंसर के साथ प्रदान किए गए रन सॉफ़्टवेयर को खोलें, और इंटरफ़ेस के ऊपरी-बाएं कोने में नई परख का चयन करें।
- एलील परिमाणीकरण परख टेम्पलेट का चयन करें।
- अनुक्रमण प्राइमर के सीधे डाउनस्ट्रीम में शामिल किए जाने वाले न्यूक्लियोटाइड में टाइप करके संबंधित बॉक्स में विश्लेषण किए जाने वाले अनुक्रम को इनपुट करें, जो रुचि के एसएनपी के अपस्ट्रीम होना चाहिए। चर स्थिति के लिए, एक स्लैश (जैसे, ए / टी) द्वारा अलग किए गए दो संभावित आधारों को निरूपित करें।
- जनरेट वितरण आदेश दबाएं, और सॉफ्टवेयर को स्वचालित रूप से अनुक्रमण-दर-संश्लेषण प्रतिक्रिया में न्यूक्लियोटाइड ्स के वितरण के लिए एक उपयुक्त क्रम निर्धारित करने दें।
- सहेजें और परख के लिए एक नाम प्रदान करें।
- अभिकर्मक तैयारी और भंडारण
- पाइरोसीक्वेंसर अभिकर्मक किट में प्रदान किए गए एनीलिंग बफर में अनुक्रमण प्राइमर को 4 μM तक पतला करें।
नोट: अनुक्रमण प्राइमर को पहले स्टॉक समाधान के रूप में 100 μM तक पानी में पतला किया जा सकता है और बाद में आवश्यकतानुसार एनीलिंग बफर में 4 μM में पतला किया जा सकता है। - एंजाइम और सब्सट्रेट तैयारी और हैंडलिंग
- पहली बार अनबॉक्सिंग करते समय, निर्माता की सिफारिशों के अनुसार लियोफिलाइज्ड एंजाइम और सब्सट्रेट को फिर से घोलें। उपयोग में नहीं होने पर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- बाद के उपयोग पर, एंजाइम और सब्सट्रेट शीशियों को -20 डिग्री सेल्सियस से पिघलाएं।
नोट: प्रदान की गई किट में अन्य सभी अभिकर्मकों को 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रशीतित रखा जा सकता है। पतला अनुक्रमण प्राइमरों को 4 डिग्री सेल्सियस पर भी रखा जा सकता है।
- प्रत्येक अभिकर्मक की आवश्यक मात्रा को बर्फ पर रखें।
- आवश्यक शेष घटकों, अर्थात् स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोती, अवशोषक स्ट्रिप्स और पाइरोसीक्वेंसिंग डिस्क को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
- पाइरोसीक्वेंसर अभिकर्मक किट में प्रदान किए गए एनीलिंग बफर में अनुक्रमण प्राइमर को 4 μM तक पतला करें।
- निष्पादन चलाएँ
नोट: जब एक परख को पहली बार डिज़ाइन किया जाता है, तो इसे ज्ञात हेटरोप्लाज्मी के पीसीआर उत्पादों का उपयोग करके कैलिब्रेट किया जाना चाहिए, जो यह सुनिश्चित करता है कि परख हेटरोप्लाज्मियों को सटीक रूप से अलग कर सकती है। शोधकर्ता मानकों के रूप में ज्ञात हेटरोप्लाज्मी के पीसीआर उत्पादों के मिश्रण का उपयोग कर सकते हैं। नमूने परिचय और चर्चा में उल्लिखित अन्य तरीकों से भी सत्यापित किए जा सकते हैं, विशेष रूप से एनजीएस।- विशेष रूप से पहले समय में, संदर्भ और / या जंगली प्रकार के नमूनों के रूप में ज्ञात हेटरोप्लाज्मी के नमूने शामिल करना सुनिश्चित करें।
- खंड 1 और खंड 2 में पहचाने गए प्रवर्धन प्राइमरों और मापदंडों का उपयोग करके 25 μL प्रतिक्रियाओं में पतला डीएनए के 5 μL का पूर्वअनुक्रमण पीसीआर करें। प्रत्येक नमूने के लिए तकनीकी पीसीआर प्रतिकृति करें।
नोट: अनुक्रमण के लिए आगे बढ़ने से पहले प्रीएम्प्लिफिकेशन पीसीआर को 4 डिग्री सेल्सियस पर अल्पकालिक या -20 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक रूप से संग्रहीत किया जा सकता है। - फ़ाइल सेटअप चलाएँ
- पायरोसीक्वेंसर सॉफ़्टवेयर के ऊपरी-बाएँ कोने में नया रन चुनें।
- पाइरोसीक्वेंसर एक साथ 48 अलग-अलग प्रवर्धित प्रतिक्रियाओं को अनुक्रमित कर सकता है, जिसमें एक खाली वर्ग एक पायरोसीक्वेंसिंग डिस्क पर एक एकल अनुक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है। एक वर्ग पर राइट-क्लिक करके और लोड परख का चयन करके अनुभाग 3.1 में कॉन्फ़िगर किए गए परख को लोड करें। यदि आवश्यक हो, तो विभिन्न अनुक्रमण प्राइमरों के साथ चार अलग-अलग परखों को अनुक्रमित करें।
- रन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक अनुक्रमण प्राइमर के लिए स्वचालित रूप से एक इंजेक्शन कक्ष असाइन करने के लिए प्राइमर वितरण मोड को स्वचालित पर सेट करें।
- जब तक एक अनुक्रमण डिस्क पर चार अलग-अलग प्रकार के परख नहीं चल रहे हों, तब तक रन मोड को मानक पर सेट करें।
- सुनिश्चित करें कि रन टेम्प्लेट फ़ाइल पर परख की संख्या पीसीआर प्रतिक्रियाओं की संख्या से मेल खाती है।
नोट: यदि 48 से अधिक नमूने चल रहे हैं, तो अतिरिक्त रन फ़ाइलों को सेट करने की आवश्यकता होगी। - चलाएँ फ़ाइलें USB ड्राइव पर सहेजें.
- पाइरोसीक्वेंसर को भड़काना
- डिवाइस की मुख्य टच स्क्रीन पर सफाई बटन दबाएं , और स्क्रीन पर दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए सभी इंजेक्टर को उच्च शुद्धता वाले पानी से साफ करें। मशीन में अवशोषक पट्टी डालते समय, सुनिश्चित करें कि छोर "9 बजे" स्थिति (सीधे केंद्र के बाईं ओर) में मिलते हैं।
- चरण 3.3.3 में सेट किए गए रन के साथ यूएसबी स्टिक में प्लग करें, और चरण 3.3.3 में परिभाषित रन फ़ाइलों को लोड करें।
नोट:: रन फ़ाइलें USB पर किसी निर्देशिका या फ़ोल्डर के बाहर सहेजी जानी चाहिए या उन्हें मशीन द्वारा पढ़ा नहीं जा सकता है। - मशीन पर संबंधित इंजेक्टर में आवश्यक अभिकर्मकों को लोड करने और प्राइम करने के लिए डिवाइस पर दिए गए निर्देशों का पालन करें।
- नमूना डिस्क तैयारी और परख लॉन्च
- स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों को कमरे के तापमान के बराबर करने की अनुमति दें।
नोट: ये मोती डिवाइस को प्रीएम्प्लिफिकेशन पीसीआर चरण से बायोटिनीलेटेड स्ट्रैंड को पकड़ने में सक्षम बनाएंगे। उन्हें किट से अलग से खरीदने की जरूरत है। - चरण 3.3.3 से रन फ़ाइल में परिभाषित कुओं में मोतियों के 3 μL लोड करें।
- संबंधित नमूने में अनुक्रमित करने के लिए प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के 10 μL लोड करें, और चुंबकीय मोतियों के साथ नमूने को मिलाने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। यदि संभव हो तो बुलबुले से बचें।
- प्राइमेड पाइरोसीक्वेंसर में संकेत देखें कि डिस्क को मशीन में लोड किया जा सकता है। डिस्क डिब्बे में धातु पिन के साथ लोड किए गए नमूना प्लेट को संरेखित करने से पहले प्लेट होल्डिंग नट को अनस्क्रू करें।
- एक बार प्लेट को प्लेट डिब्बे में मजबूती से पेंच करने के बाद, टचस्क्रीन इंटरफ़ेस पर स्टार्ट बटन दबाकर अनुक्रमण रन लॉन्च करें।
- स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों को कमरे के तापमान के बराबर करने की अनुमति दें।
4. परिणाम अधिग्रहण
- एक बार रन पूरा हो जाने के बाद, मशीन से यूएसबी ड्राइव को हटा दें, और इसे पायरोसीक्वेंसर सॉफ़्टवेयर चलाने वाले कंप्यूटर में वापस प्लग करें। निम्नलिखित चरणों के साथ आगे बढ़ते समय, संकेतों का पालन करते हुए पायरोसीक्वेंसर को साफ करने के साथ आगे बढ़ें यदि यह दिन का अंतिम रन है।
- USB ड्राइव पर नई जेनरेट की गई रन फ़ाइल के प्रकट होने की प्रतीक्षा करें, और रन परिणाम फ़ाइल पर डबल-क्लिक करें। यह स्वचालित रूप से न्यूक्लियोटाइड निगमन पर प्रत्येक कुएं के ल्यूसिफेरस आउटपुट का विश्लेषण करता है और धारा 3.1 में परख विन्यास के दौरान परिभाषित ब्याज के माइटोकॉन्ड्रियल एलील को निर्धारित करता है।
- पढ़ने की गुणवत्ता के आधार पर सॉफ्टवेयर द्वारा दिखाए गए निम्नलिखित रंग स्कोर देखें। नीला एक इष्टतम रन को इंगित करता है, चेतावनी के साथ एक रन पीला करता है, और लाल एक असफल रन को इंगित करता है। परिणामों को सहेजने के लिए, शीर्ष विंडो में रिपोर्ट का चयन करें | पायरोग्राम युक्त एक .pdf फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए पूर्ण रिपोर्ट और रन के प्रत्येक कुएं से परिणाम। वैकल्पिक रूप से, रिपोर्ट टैब के अंतर्गत अन्य स्वरूपों में परिणाम डाउनलोड करें.
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Representative Results
यह खंड मानव रोगजनक एमटीडीएनए उत्परिवर्तन के लिए पाइरोसीक्वेंसिंग परख का एक उदाहरण अनुकूलन प्रस्तुत करता है, साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल जिंक फिंगर न्यूक्लियस (एमटीजेडएफएन) के साथ इलाज किए गए हेटेरोप्लाज्मिक (एम.5024 सी >टी) माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ) की जीनोटाइपिंग से अनुक्रमण डेटा प्रस्तुत करता है। मानव कोशिकाओं के लिए परख का अनुकूलन करना और दो अलग-अलग परखों की तुलना करना दर्शाता है कि सबसे सटीक का चयन कैसे किया जाए, जबकि दूसरे उदाहरण में जीनोटाइपिंग आनुवंशिक रूप से संशोधित एमईएफ कोशिकाओं को जीन थेरेपी हस्तक्षेप के बाद हेटरोप्लाज्मी शिफ्ट का पता लगाने के एक लागू उदाहरण के रूप में कार्य करता है।
मानव m.3243A>G उत्परिवर्तन
यह उदाहरण एमटीडीएनए-एम.3243ए>जी के एक सामान्य रोगजनक संस्करण की जीनोटाइपिंग को दर्शाता है। आम एम.3243ए>जी उत्परिवर्तन कई नैदानिक बीमारियों को रेखांकित करता है, विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल एन्सेफैलोपैथी लैक्टिक एसिडोसिस और स्ट्रोक जैसे एपिसोड (एमईएलएएस), मातृ विरासत में मिला बहरापन और मधुमेह (एमआईडीडी), और प्रगतिशील बाहरी नेत्र रोग (पीईओ)23। प्रोटोकॉल के खंड 3.1.3 में वर्णित न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम को पुन: प्रोग्राम करके इस परख का उपयोग कम सामान्य एम.3243ए>टी वेरिएंट24 को जीनोटाइप करने के लिए भी किया जा सकता है।
अनुभाग 1 में प्राइमर अनुकूलन दिशानिर्देशों के बाद, निम्नलिखित प्राइमर सेट का चयन किया गया था, जो किसी भी स्ट्रैंड के लिए एक था:
परख 1:
आगे: 5 ' - [बायोटिन] एएएटीएजीजीसीसीसीटीसीएसीएएएजीसीजी - 3 '
रिवर्स: 5 ' - TGCGATTAGAATGGGTACAGAG - 3 '
अनुक्रमण: 5 ' - जीटीटीटीटीएटीएटीजीसीजीएटीसीसी- 3 '
एम्प्लिकॉन आकार: 215 बीपी
परख 2:
आगे: 5 ' - AAATAAGCCTACTTCACACACACAGCG - 3'
रिवर्स: 5 ' - [बायोटिन] जीटीटीजीसीसीएटीजीजीटीटी
अनुक्रमण: 5 ' -GGGTTTTTTAAGATGG- 3'
एम्प्लिकॉन आकार: 182 बीपी
परख के लिए थर्मल साइक्लिंग स्थितियों को निर्धारित करने के लिए, हॉट स्टार्ट पोलीमरेज़ ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एक थर्मल ग्रेडिएंट पीसीआर को पहली बार किया गया था और खंड 2 के बाद वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया गया था। शुरुआती टेम्पलेट के रूप में लगभग 10 एनजी डीएनए को बढ़ाने के लिए चालीस चक्रों का उपयोग किया गया था। प्रोटोकॉल में धारा 2.3 के तहत चरणों के बाद, दिए गए एनीलिंग तापमान (चित्रा 2 ए) पर प्रवर्धन प्रोटोकॉल की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए एक एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन किया गया था। सही आकार (या तो 215 बीपी या 182 बीपी) के सफल बैंड सभी तापमानों पर देखे जा सकते हैं; हालांकि, परख 1 में कम एनीलिंग तापमान के परिणामस्वरूप ऑफ-टारगेट प्रवर्धन हुआ। प्रवर्धन के लिए उचित एनीलिंग तापमान 70 डिग्री सेल्सियस (चित्रा 2 ए) स्थापित किया गया था। दोनों परखों की सटीकता का पता लगाने और सबसे अच्छा चुनने के लिए, ज्ञात m.3243A>G प्रतिशत के दाढ़ मानकों को विभिन्न अनुपातों में शुद्ध पीसीआर उत्पाद की उपयुक्त मात्रा को मिलाकर उत्पन्न किया गया था: क्रमशः 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90%, और 100% m.3243A>G (चित्रा 2B, डॉटेड लाइन)। मानकों पर दोनों परख करते समय, हमने परख 2 (चित्रा 2 बी) में अपेक्षित परिणाम के साथ अधिक सहसंबंध देखा। फिर हमने एक जीनोटाइपिंग प्रयोग में एम.3243ए>जी साइब्रिड कोशिकाओं पर दोनों परखों का उपयोग किया और परख 1 में एक स्पष्ट पूर्वाग्रह देखा, विशेष रूप से होमोप्लाज्मिक स्थितियों के पास (चित्रा 2 सी)।
म्यूरिन एम.5024सी>टी उत्परिवर्तन
इस उदाहरण में माइटोकॉन्ड्रियल जीन थेरेपी प्रयोग के एक उदाहरण के रूप में एम.5024सी>टी म्यूटेशन12 के स्तर को कम करने के लिए विकसित एमटीजेडएफएन के साथ इलाज किए गए एमईएफ कोशिकाओं को शामिल किया गया है, जहां पाइरोसीक्वेंसिंग द्वारा जीनोटाइपिंग नमूनों के बीच मात्रात्मक तुलना के रूप में उपयोगी है। एमईएफ कोशिकाएं एक प्रकाशित माउस मॉडल से ली गई हैं जो माउस एमटीडीएनए (एम.5024 सी>टी)25 में 5,024 स्थान पर सी>टी उत्परिवर्तन को आश्रय देती हैं। प्रयोग में एमटीजेडएफएन और विभिन्न फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड के साथ एमईएफ को इलेक्ट्रोपोरेट करना और बाद में 24 घंटे के बाद एफएसीएस द्वारा प्लास्मिड को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को छांटना शामिल था। पाइरोसीक्वेंसिंग द्वारा हेटरोप्लाज्मी तुलना से पहले कोशिकाओं को 2 सप्ताह तक ठीक होने की अनुमति दी गई थी।
m.5024C>T स्थिति को अनुक्रमित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला प्राइमर सेट निम्नानुसार था:
आगे: 5 ' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAG - 3 '
उल्टा: 5 ' - [बायोटिन] जीसीएएएटीसीजीजीएजीटीजीटीएजीए - 3 '
अनुक्रमण: 5 ' - CAAGTTTAACTCTCTGATAG - 3 '
एम्प्लिकॉन आकार: 267 बीपी
परिणामों की निष्ठा बढ़ाने के लिए नमूनों को तकनीकी तीन प्रतियों में अनुक्रमित किया गया था। प्रयोग जैविक डुप्लिकेट में भी किया गया था, इस प्रकार प्रत्येक स्थिति के लिए छह अलग-अलग मान उत्पन्न हुए (चित्रा 3 बी)। चित्रा 3 बी के निर्माण के लिए 18 पाइरोग्राम में से 2 के डेटा का उपयोग किया गया था; ये पाइरोग्राम चित्र 3 ए में प्रदर्शित होते हैं।
चित्रा 1: एक सेल में माइटोकॉन्ड्रियल अनुक्रमों का प्रतिनिधित्व करने वाले योजनाबद्ध और पाइरोसीक्वेंसिंग की सामान्य तकनीकी रूपरेखा । (ए) माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए और परमाणु माइटोकॉन्ड्रियल अनुक्रमों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। आंकड़ा उच्च होमोलॉजी अनुक्रमों के विकासवादी मूल का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) पाइरोसीक्वेंसिंग परख पाइपलाइन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व एक अंतिम उदाहरण अनुक्रम के साथ अनुमानित 50% सी > जी हेटेरोप्लाज्मी मूल्य को दर्शाता है। टेम्प्लेट डीएनए को पहले चयनित प्रवर्धन प्राइमरों द्वारा प्रवर्धित किया जाता है, जिनमें से एक 5 'अंत पर बायोटिनीलेटेड होता है। प्रवर्धन के बाद, पाइरोसीक्वेंसर नीले रंग में दिखाए गए स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके अनुक्रमण के लिए टेम्पलेट के रूप में डीएनए के एक एकल स्ट्रैंड को बरकरार रखता है। अंत में, एक अनुक्रमण प्राइमर न्यूक्लियोटाइड की पूर्वनिर्धारित श्रृंखला के संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण की अनुमति देता है, जिससे एक पायरोग्राम उत्पन्न होता है जिसे योजनाबद्ध रूप से दर्शाया जाता है। प्रत्येक आधार के स्टोइकोमेट्री को प्रत्येक निगमन घटना में सापेक्ष शिखर ऊंचाइयों की तुलना करके आसानी से प्राप्त किया जाता है: एक ही न्यूक्लियोटाइड एक एकल आधार की तुलना में दो बार एक डबल पीक उत्पन्न करेगा। विश्लेषण किए जाने वाले अनुक्रम में स्लैश काल्पनिक एसएनपी को दर्शाता है, जो "सी" या "जी" हो सकता है। पायरोग्राम के एक्स-अक्ष पर एक नकली "जी" आधार के प्रारंभिक वितरण पर ध्यान दें, जो आमतौर पर पायरोसीक्वेंसर द्वारा नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता है। संक्षेप: एमटीडीएनए = माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए; NUMT = परमाणु माइटोकॉन्ड्रियल अनुक्रम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: मानव m.3242A>G उत्परिवर्तन पर सचित्र पायरोसीक्वेंसिंग प्राइमर सेट का अनुकूलन। (ए) एम.3242ए>जी म्यूटेशन के लिए चुने गए दोनों सेटों से प्रवर्धन प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धन का अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (2% डब्ल्यू / वी)। डब्ल्यूटी जंगली-प्रकार के नियंत्रण डीएनए को दर्शाता है, जबकि हेट विश्लेषण किए जाने वाले लगभग होमोप्लाज्मिक एम .3243 ए>जी नमूना है। तापमान 40 चक्र पीसीआर प्रतिक्रिया में उपयोग किया जाने वाला एनीलिंग तापमान है। अंशांकन के लिए दाढ़ मानकों का उपयोग करके दोनों प्राइमर सेटों के प्रदर्शन की तुलना, जो शुद्ध जंगली-प्रकार और शुद्ध उत्परिवर्ती एम 3243 ए > जी उत्पाद के विभिन्न अनुपातों को मिलाकर प्राप्त किए गए थे। मापा मान ऊर्ध्वाधर बिंदीदार रेखाओं द्वारा निरूपित किए जाते हैं। एक एक्स = वाई रैखिक फ़ंक्शन यह बताने के लिए प्रदर्शित किया जाता है कि दो परीक्षण किए गए परखों में से प्रत्येक एक आदर्श माप के कितना करीब है। एक्स-अक्ष पर सेल लाइनों के नाम विभिन्न साइब्रिड क्लोनों के नाम हैं जिन्हें इस परख का उपयोग करके जीनोटाइप किया गया था। (सी) जीनोटाइपिंग दोनों परखों का उपयोग करके अज्ञात एम.3243 ए>जी हेटेरोप्लाज्मी के चार साइब्रिड क्लोनों पर परिणाम देता है। अनुक्रमण तकनीकी तीन प्रतियों में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: एमटीजेडएफएन जीन संपादन तकनीक के साथ इलाज किए गए एफएसीएस-सॉर्टेड एम.5024सी>टी एमईएफ पर हेटेरोप्लाज्मी माप। (ए) दो एमईएफ सेल नमूना पीसीआर प्रतिकृति से पाइरोग्राम का उपयोग चित्रा 3 बी के साथ-साथ जंगली-प्रकार जीनोटाइपिंग नियंत्रण उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। वाई-अक्ष पर ल्यूमिनेसेंस मान एयू (बी) एमटीजेडएफएन-उपचारित कोशिकाओं के जीनोटाइपिंग परिणामों के साथ-साथ अनुपचारित और नकली-उपचारित नियंत्रणों में हैं। एमईएफ को प्लास्मिड एन्कोडिंग एमटीजेडएफएन और अन्य फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों के साथ इलेक्ट्रोपोरेट किया गया था और बाद में 24 घंटे के बाद एफएसीएस द्वारा क्रमबद्ध किया गया था। पाइरोसीक्वेंसिंग द्वारा हेटरोप्लाज्मी तुलना से पहले कोशिकाओं को 2 सप्ताह तक ठीक होने की अनुमति दी गई थी। त्रुटि सलाखों की गणना जैविक डुप्लिकेट के साथ की गई थी, जिनमें से प्रत्येक को तकनीकी तीन प्रतियों में पायरोसीक्वेंसिंग से गुजरना पड़ा। संक्षेप: एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; एमईएफ = माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट; mtZFN = माइटोकॉन्ड्रियल जिंक फिंगर न्यूक्लियस; एयू = मनमानी इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू संदूषण से बचना है, खासकर जब शुरुआती सामग्री की कम मात्रा का उपयोग किया जाता है। जहां भी संभव हो नमूने तैयार करते समय यूवी हुड और फ़िल्टर किए गए पिपेट युक्तियों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, साथ ही साथ पूर्वप्रवर्धन और पोस्ट-प्रवर्धन क्षेत्रों को अलग रखने के लिए। रिक्त माप और ज्ञात हेटरोप्लाज्मी (जैसे जंगली-प्रकार डीएनए) के नमूने हमेशा तकनीकी या जैविक पूर्वाग्रह की जांच के लिए बेंचमार्क के रूप में उपयोग किए जाने के लिए शामिल किए जाने चाहिए।
परख में निहित एक उल्लेखनीय तकनीकी पूर्वाग्रह एडेनिन एनालॉग निगमन द्वारा उत्पादित बढ़े हुए ल्यूमिनेसेंट सिग्नल है। जब एडेनिन का उपयोग एक चर स्थिति में किया जाता है, तो यह अक्सर अवशिष्ट फ्लोरोसेंट पीक (जैसे, चित्रा 2 सी) का उत्पादन करता है। यह इस कारण से है कि चर स्थिति में एडेनिन एनालॉग को शामिल करने से बचने के लिए विपरीत स्ट्रैंड (जहां एक थाइमिन शामिल किया जाएगा) पर पायरोसीक्वेंसिंग परख चलाने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, ए>टी या टी>ए म्यूटेशन के मामले में, यह असंभव है। फिर भी, जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में स्पष्ट है, परख डिजाइन करते समय प्राइमरों का एक उपयुक्त विकल्प अधिक महत्वपूर्ण हो सकता है। एम.3243ए>जी उत्परिवर्तन के लिए परख 2, प्रतिनिधि परिणामों के पहले खंड में, परख 1 के विपरीत चर स्थिति में ए / जी अनुपात पर आधारित अनुक्रम, जो टी / सी अनुपात को मापता है। एडेनिन निगमन पूर्वाग्रह के लिए अतिसंवेदनशील होने के बावजूद, परख 2 दाढ़ मानकों के साथ तुलना के आधार पर अधिक सटीक परिणाम प्रदान करता है, जैसा कि एक सरल रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण (चित्रा 2 बी) द्वारा दिखाया गया है।
पूर्वाग्रह मुख्य रूप से NUMT सह-प्रवर्धन3 का परिणाम हैं। बड़ी माइटोकॉन्ड्रियल कॉपी संख्या आमतौर पर परमाणु ऑफ-टारगेट अनुक्रमों को किसी भी महत्वपूर्ण पूर्वाग्रह को पेश करने से रोकती है; हालांकि, एमटीडीएनए के कुछ क्षेत्र कई NUMTS में मौजूद हैं और धारा 1 के तहत प्रोटोकॉल में निरूपित विधियों का उपयोग करके टाला जाना चाहिए।
उपरोक्त सावधानी बरतते समय, यह विधि एमटीडीएनए में जीनोटाइपिंग एसएनपी का एक अत्यधिक मॉड्यूलर, तेज और लागत प्रभावी साधन है। हालांकि, विधि सभी माइटोकॉन्ड्रियल जीनोटाइपिंग अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल नहीं है, विशेष रूप से, बड़े पैमाने पर विलोपन जिसके लिए डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर कीसिफारिश की जाती है। अनुक्रमक या विभिन्न प्राइमरों / प्रवर्धन स्थितियों द्वारा अभिकर्मकों के वितरण में परिवर्तनशीलता छोटे पूर्वाग्रहों को पेश कर सकती है। यह इस कारण से है कि जीनोटाइपिंग परिणामों की सत्यता की पुष्टि करने के लिए आमतौर पर तकनीकी तीन प्रतियों की सिफारिश की जाती है। दृष्टिकोण की एक और सीमा गुंजाइश है, क्योंकि एमटीडीएनए के केवल छोटे, पूर्वनिर्धारित स्पैन को जीनोटाइप किया जा सकता है। जबकि पायरोसीक्वेंसर्स को अज्ञात अनुक्रम के सैकड़ों आधार जोड़े को अनुक्रमित करने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है, यह एनजीएस दृष्टिकोण का उपयोग करने की तुलना में जल्दी से कम लागत प्रभावी हो जाता है। शोधकर्ता शुरू में पाइरोसीक्वेंसिंग को एक तेजी से जीनोटाइपिंग विधि के रूप में लागू कर सकते हैं जो एक सटीक मात्रात्मक उत्तर देता है लेकिन बाद में एनजीएस द्वारा चुने गए नमूनों का विश्लेषण कर सकता है।
निष्कर्ष में, यह अच्छी तरह से स्थापित विधि माइटोकॉन्ड्रियल आनुवंशिक अनुसंधान में एक प्रधान बनी हुई है, जो मात्रात्मक हेटरोप्लाज्मी माप के लिए तेजी से और सरल पहुंच प्रदान करती है जो क्षेत्र में कई शोध संदर्भों में महत्वपूर्ण हैं, जैसे कि रोगी निदान, जीन थेरेपी, या पशु मॉडल की जीनोटाइपिंग।
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Disclosures
एमएम एक सह-संस्थापक, शेयरधारक और प्रेट्ज़ेल थेरेप्यूटिक्स, इंक. पीएस-पी के वैज्ञानिक सलाहकार बोर्ड के सदस्य हैं। और पीएएन प्रेट्ज़ेल थेरेप्यूटिक्स, इंक के लिए परामर्श सेवाएं प्रदान करते हैं।
Acknowledgments
हम इस प्रोटोकॉल के लिए उदाहरण के रूप में उपयोग किए जाने वाले एम.3243ए>जी साइब्रिड कोशिकाओं को तैयार करने और प्रदान करने के लिए सिल्विया मार्चेट और कॉन्स्टैंज़ा लैम्पर्टी (इस्टिटो न्यूरोलॉजिको "कार्लो बेस्टा", फोंडाज़ियोन आईआरसीसीएस, मिलान) को स्वीकार करना चाहते हैं। हम इस शोध के दौरान उपयोगी चर्चा के लिए माइटोकॉन्ड्रियल जेनेटिक्स ग्रुप (एमआरसी-एमबीयू, कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय) के सदस्यों को भी स्वीकार करना चाहते हैं। इस काम को मेडिकल रिसर्च काउंसिल यूके (MC_UU_00015/4 और MC_UU_00028/3) से कोर फंडिंग द्वारा समर्थित किया गया था। पी.ए.एन. और पी.एस.-पी. क्रमशः लिली फाउंडेशन और द चैम्प फाउंडेशन द्वारा भी समर्थित हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
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