Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen im mitochondrialen Genom durch Pyrosequenzierung

Summary

Pyrosequenzierungsassays ermöglichen die robuste und schnelle Genotypisierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen der mitochondrialen DNA in heteroplasmatischen Zellen oder Geweben.

Abstract

Mutationen im mitochondrialen Genom (mtDNA) werden mit mütterlich vererbten genetischen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Das Interesse an mtDNA-Polymorphismen hat jedoch in den letzten Jahren zugenommen, da in jüngster Zeit die Fähigkeit entwickelt wurde, Modelle durch mtDNA-Mutagenese zu erstellen, und eine neue Erkenntnis des Zusammenhangs zwischen mitochondrialen genetischen Aberrationen und häufigen altersbedingten Krankheiten wie Krebs, Diabetes und Demenz entwickelt wurde. Die Pyrosequenzierung ist eine Sequenzierungstechnik durch Synthese, die im gesamten mitochondrialen Bereich für routinemäßige Genotypisierungsexperimente weit verbreitet ist. Ihre relative Erschwinglichkeit im Vergleich zu massiven parallelen Sequenzierungsmethoden und die einfache Implementierung machen sie zu einer unschätzbaren Technik auf dem Gebiet der mitochondrialen Genetik, die eine schnelle Quantifizierung der Heteroplasmie mit erhöhter Flexibilität ermöglicht. Trotz der Praktikabilität dieser Methode erfordert ihre Implementierung als Mittel zur mtDNA-Genotypisierung die Einhaltung bestimmter Richtlinien, insbesondere um bestimmte Verzerrungen biologischen oder technischen Ursprungs zu vermeiden. Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte und Vorsichtsmaßnahmen bei der Entwicklung und Implementierung von Pyrosequenzierungsassays für die Verwendung im Zusammenhang mit der Heteroplasmiemessung.

Introduction

Das mitochondriale Genom liegt in Form von kleinen (16,5 kb) kreisförmigen Molekülen (mtDNA) vor, die im innersten Kompartiment der Mitochondrien vorhanden sind, die als Matrix bezeichnet werden und für 13 Untereinheiten der mitochondrialen Atmungskette sowie die tRNAs und rRNAs kodieren, die für ihre Translation in situ durch das mitochondriale Ribosom¹ erforderlich sind. Dieses Genom repräsentiert etwa 1% aller Proteine, die für die Funktion der Mitochondrien notwendig sind, der Rest wird von der Kern-DNA (nDNA) kodiert. Es wird allgemein angenommen, dass Mitochondrien aus einem endosymbiotischen Fusionsereignis zwischen einem alpha-proteobakteriellen Vorfahren und einer eukaryotischen Urzelle stammen. Sobald diese hypothetische Symbiose stattgefunden hatte, wurde die genetische Information der Mitochondrien über Äonen hinweg allmählich in den Zellkern übertragen, was die bereits erwähnte Kompaktheit der mtDNA im Vergleich zu den Genomen moderner Cyanobakterien^{erklärt 2}. Ein solcher Transfer von Genen wird am stärksten durch die Existenz langer nDNA-Abschnitte belegt, die in hohem Maße homolog zu den in der mtDNA gefundenen Sequenzen sind. Diese nukleären mitochondrialen Sequenzen (NUMTs) sind eine häufige Quelle für Fehlinterpretationen während der Genotypisierung, und es müssen bestimmte Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um nukleäre Verzerrungen bei der Genotypisierung von mtDNA³ zu vermeiden (Abbildung 1A).

Eine weitere Besonderheit der mtDNA besteht darin, dass ihre Kopienzahl je nach Zelltyp variiert und zwischen Zehntausenden und Tausenden von Kopien pro Zelle liegt⁴. Aufgrund dieser mehrfachen Kopiennatur kann mtDNA eine Vielzahl von Genotypen innerhalb einer einzigen Zelle beherbergen, was zu einer kontinuierlicheren Verteilung der Allele führen kann, im Gegensatz zu den diskreten Allelen, die mit Kerngenen assoziiert sind, wenn man die Zygotie der Chromosomen betrachtet. Diese Heterogenität der mitochondrialen Allele wird als mitochondriale Heteroplasmie bezeichnet, die sich typischerweise in der prozentualen Prävalenz einer bestimmten Mutation im Verhältnis zur gesamten mtDNA in einer bestimmten Zelle ausdrückt. Heteroplasmie kann der Homoplasmie gegenübergestellt werden, die sich auf eine einzigartige Art von mtDNA bezieht, die in einer Zelle vorhanden ist.

Die Messung der mitochondrialen Heteroplasmie ist von besonderem Interesse bei der Quantifizierung des Anteils von mtDNA-Molekülen, die pathogene Varianten beherbergen. Solche Varianten gibt es in Form von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), kleinen Indels oder großflächigen Deletionen⁵. Die meisten Menschen sind heteroplasmatisch für pathogene Varianten; Sie weisen jedoch keine klinischen Phänotypen auf, die sich oft nur bei höheren Heteroplasmie-Konzentrationen pathogener mtDNA manifestieren, was als Schwelleneffekt^{bezeichnet wird 6}. Während die mit der Pathogenität assoziierten Werte stark von der Art der pathogenen Mutation und dem Gewebe, in dem sie auftritt, abhängen, liegen sie typischerweise über 60% Heteroplasmie⁷.

Es gibt mehrere Forschungsbereiche, in denen die mitochondriale Genotypisierung üblich ist. Im medizinischen Bereich kann die Untersuchung oder Quantifizierung von mtDNA-Mutationen als diagnostisches Kriterium für mitochondriale Erkrankungen dienen, von denen viele auf mtDNA-Aberrationen zurückzuführen sind⁵. Neben der Untersuchung humanpathogener Mutationen wird die Prävalenz von Tiermodellen, die pathogene SNPs in der mtDNA enthalten, wahrscheinlich zunehmen, da in jüngster Zeit die mitochondriale Baseneditierung durch mitochondriale DddA-abgeleitete Cytosin-Baseneditoren (DdCBEs)⁸ und TALE-basierte Deaminasen (TALEDs) für die Adenin-Basen-Editierung ermöglicht wird⁹. Dieser Ansatz wird entscheidend dazu beitragen, das Zusammenspiel zwischen abweichenden mitochondrialen Genotypen und den daraus resultierenden Funktionsstörungen zu verstehen. Es gibt auch laufende wissenschaftliche Forschungen zum Umbau des mitochondrialen Genoms für den endgültigen Einsatz als therapeutische Strategie bei menschlichen mitochondrialen Erkrankungen durch einen Ansatz, der als Heteroplasmieverschiebung bekannt ist. In diesem Forschungsgebiet geht es vor allem darum, mutationsspezifische Nukleasen auf die mitochondriale Matrix zu lenken; Dies führt zu einem bevorzugten Abbau pathogener mtDNA, was zu Rettungen beim Phänotyp^10,11,12,13 führt. Alle Experimente, die den Umbau des mitochondrialen Genotyps beinhalten, erfordern eine robuste quantitative Methode zur Beurteilung von Heteroplasmieverschiebungen.

Für die Genotypisierung der mtDNA wird eine Vielzahl von Methoden verwendet, die je nach Art der Mutation variieren. Next-Generation-Sequencing-Methoden (NGS) sind präziser, wenn es um die Quantifizierung von SNPs in der mtDNA geht. Diese Methoden sind jedoch für die routinemäßige Quantifizierung der mitochondrialen Heteroplasmie nach wie vor unerschwinglich teuer, insbesondere wenn die Anzahl der Proben gering ist. Die Sanger-Sequenzierung kann auch die Erkennung von SNPs ermöglichen. Dieser Ansatz ist jedoch nicht quantitativ und kann bei der Schätzung hoher Heteroplasmien oft nicht erkannt werden oder ungenau sein. Die Pyrosequenzierung als Assay, der nur minimale Vorbereitung erfordert und die schnelle Quantifizierung der Heteroplasmie für jede mtDNA-Probe ermöglicht, wird als geeigneter Kompromiss zwischen diesen beiden Extremen vorgeschlagen. Diese Methode wurde von zahlreichen Forschern routinemäßig zur Quantifizierung mitochondrialer SNPs in verschiedenen Kontexten eingesetzt, darunter forensische Analysen 14,15^, klinische Diagnosen¹⁶ oder die Genotypisierung von mtDNA aus Einzelzellen¹⁷.

Dieser Assay beinhaltet einen ersten PCR-Präamplifikationsschritt einer Region, die den SNP in der mtDNA flankiert, gefolgt von einem Sequenzierungs-by-Synthesis-Assay mit einem Strang des zuvor erzeugten Amplikons. Einer der beiden Primer, die im Voramplifikationsschritt verwendet werden, muss am 5'-Ende biotinyliert werden, wodurch die Pyrosequenziervorrichtung in die Lage versetzt wird, den einzelnen DNA-Strang zu isolieren, der als Vorlage für die Sequenzierungsreaktion verwendet werden soll. Ein dritter Sequenzierprimer wird dann auf den zurückgehaltenen biotinylierten Strang getempert, wodurch die entstehende DNA-Synthese in Form von Desoxynukleotide in einer vordefinierten Reihenfolge in die Reaktionskammer abgegeben werden kann. Der Pyrosequenzer zeichnet die Menge jeder eingebauten Base auf der Grundlage einer Lumineszenzanzeige auf und ermöglicht so die relative Quantifizierung von mutierten und mitochondrialen Allelen des Wildtyps bei der DNA-Synthese (Abbildung 1B). Die Lumineszenz wird durch ein Luciferase-Enzym erzeugt, das in Gegenwart von ATP Licht emittiert, das eine ATP-Sulfurylase bei jedem Einbauereignis de novo aus den von jedem Nukleotid freigesetzten Pyrophosphaten synthetisiert. Diese beiden Reaktionen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1. PP_i (aus Nukleotideinbau) + APS → ATP + Sulfat (ATP-Sulfurylase)

2. ATP + Luciferin +_O2 → AMP + PP_i + Oxyluciferin + CO₂ + Licht (Luciferase)

Der Nachweis von Adeninbasen durch den Pyrosequenzer, ohne dass ATP in der zweiten Reaktion mit der Luciferase kreuzreagiert, ist eine Herausforderung. Dies wird jedoch durch die Verwendung eines Adenin-Analogons für die DNA-Synthese, nämlich dATPαS, gelöst. Obwohl es kein perfektes Substrat für Luciferase ist, erzeugt es im Vergleich zu den drei anderen Nukleotiden eine stärkere Lumineszenz, die vom Pyrosequenzer digital eingestellt und auf den Faktor 0,9 eingestellt wird. Aufgrund dieser inhärenten Variabilität wird empfohlen, die Sequenzierung von Adenin an der SNP-Position zu vermeiden (siehe die Diskussion für weitere Details).

Das folgende Protokoll beschreibt die Methode der Bewertung der mtDNA-Heteroplasmie durch Pyrosequenzierung und beschreibt die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen bei der Entwicklung der Amplifikationsprimer, um biologische oder technische Verzerrungen bei der Genotypisierung von SNPs in mtDNA zu vermeiden. Letzteres umfasst die digitale Vermessung und Auswahl der Primer-Sets, die Optimierung der Präamplifikations-PCR und schließlich die Sequenzierung und Verfeinerung des Assays. Es werden zwei angewandte Beispielassays demonstriert: erstens die Optimierung der häufigsten humanpathogenen Variante m.3243A>G¹⁸ und zweitens die Genotypisierung von embryonalen Fibroblastenzellen (MEF) von Mäusen, die eine Heteroplasmieverschiebung durchlaufen haben, unter Verwendung von Technologien, die im Minczuk-Labor in Cambridge entwickelt wurden 10,11,12,19,20,21,22.

Protocol

Für die Verwendung der humanen 3243A>G-Cybridzellen und der in dieser Studie verwendeten immortalisierten m.5024C>T-MEFs wurde eine Einwilligungserklärung erteilt. Eine ethische Genehmigung war in diesem Fall nicht erforderlich, da die Patientenzellen nicht an der Universität Cambridge entnommen wurden. Die Verwendung menschlicher Fibroblasten kann jedoch eine ethische Genehmigung erfordern. Es wird dringend empfohlen, bei der Vorbereitung der Proben-DNA für die Pyrosequenzierung die Best Practices für die PCR-Einrichtung zu befolgen. Eine häufige Amplifikation mit identischen Primern kann zu einer Amplikonkontamination führen und die anschließende Genotypisierung verzerren, wenn keine strikte Trennung zwischen den Prä-PCR- und Post-PCR-Bereichen eingehalten wird. Die hier vorgestellte Pipeline verwendet spezielle Geräte eines einzigen Herstellers; die Details finden Sie in der Materialtabelle. Das Primer-Design für die PCR kann auf Wunsch manuell durchgeführt werden; Es wird jedoch empfohlen, hierfür vorhandene Software zu verwenden (siehe Materialtabelle).

1. Pyrosequenzierungs-Primer-Design und Assay-Auswahl

1. Primerkandidaten mit Software erhalten
   1. Besorgen Sie sich eine mtDNA-Sequenzdatei für die zu genotypisierende Spezies und bestimmen Sie die Position des SNP. Stellen Sie sicher, dass die verwendete Referenzsequenz die entsprechende Basisnummerierung für die untersuchte Mutation verwendet, damit die Position des SNP leicht identifiziert werden kann.
   2. Kopieren Sie 1.000 Basenpaare stromaufwärts und stromabwärts der SNP-Stelle und fügen Sie die abgeschnittene Sequenz in die Software ein, die für das Design des Pyrosequenzierungsprimers vorgesehen ist (siehe Materialtabelle).
   3. Legen Sie die analysierte SNP-Basis als Ziel des Pyrosequenzierungsassays in der Software fest, indem Sie die polymorphe Basis markieren und mit der rechten Maustaste auf die Zielregion setzen klicken und dann auswählen.
   4. Klicken Sie auf das Wiedergabesymbol in der oberen rechten Ecke der Benutzeroberfläche, um die Primerauswahl zu starten.
   5. Warten Sie, bis die Software nun automatisch Primer-Trios generiert: zwei Primer für die Voramplifikation der Template-DNA und einen dritten Primer für die Sequenzierung durch Synthese in der Pyrosequenziermaschine. Behalten Sie alle Primer-Sets bei, indem Sie mit der rechten Maustaste auf klicken und Alle Primer-Sets kopieren auswählen.
2. Auswahl der optimalen Primer-Sets aus der generierten Liste
   1. Behalten Sie die Primer-Sets mit der höchsten Qualitätsauswertung basierend auf der Softwareausgabe bei, die Primer-Sets in absteigender Reihenfolge basierend auf der Qualitätsauswertung bereitstellt. Wenn möglich, lassen Sie Primer-Sets mit einer Punktzahl unter 80 weg.
   2. Identifizieren und kopieren Sie für die zurückgehaltenen Primersätze das von den Amplifikationsprimern erzeugte Amplikon .
   3. Richten Sie die hergestellten Amplikons mit dem gesamten Genom des zu genotypisierenden Organismus mit NCBI Blast ab, indem Sie das Online-Einreichungsportal unter https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi verwenden. Wählen Sie während der Übermittlung aus den Dropdown-Menüs Folgendes aus:
      1. Datenbank auswählen | Genomische + Transkript-Datenbanken.
      2. Wählen Sie im Dropdown-Menü Mensch oder Maus aus, je nachdem, welcher SNP analysiert wird.
      3. Wählen Sie Optimieren für | Etwas ähnliche Sequenzen (Blastn).
   4. (Optional) Wenn Sie einen anderen Organismus als eine Maus oder einen Menschen genotypisieren, wählen Sie bei der Einreichung Folgendes aus:
      1. Datenbank auswählen | Standard-Datenbank.
      2. Wählen Sie RefSeq Repräsentative Genome im Dropdown-Menü aus
      3. Wählen Sie Optimieren für | Etwas ähnliche Sequenzen (Blastn)
   5. Wenn möglich, lassen Sie alle Amplikons weg, die eine perfekte Homologie zum mtDNA-Amplikon haben, insbesondere wenn die Primerbindungsregionen perfekt homolog sind (siehe die Diskussion).
      HINWEIS: Das BLAST-Ausrichtungswerkzeug gibt jede Sequenz mit beträchtlicher Homologie zu den Amplikonen vor der Verstärkung zurück. Dies ermöglicht die Detektion der in der Einleitung beschriebenen NUMTs, die, wenn sie nicht berücksichtigt werden, eine Verzerrung hervorrufen können, da sie mit der mitochondrialen DNA co-amplifiziert werden.
   6. Bestellen Sie die über diese Pipeline gewonnenen Oligos. Stellen Sie sicher, dass während der Synthesereihenfolge dem richtigen Amplifikationsprimer eine 5'-Biotinmodifikation zugesetzt wird, so dass der Sequenzierungsprimer komplementär zum biotinylierten Strang ist.
      HINWEIS: Die Wahl des Sequenzierungsprimers ist flexibler als bei den Amplifikationsprimern, und es wird empfohlen, mindestens eine Basis zu haben, die das 3'-Ende des Sequenzierprimers von der variablen Position trennt.

2. PCR-Optimierung vor der Amplifikation

1. Bereiten Sie die DNA-Proben vor, indem Sie die gesamte genomische DNA mit einer geeigneten Methode extrahieren.
   HINWEIS: Dies hängt weitgehend von der Anzahl der zu genotypisierenden Zellen und ihrer Herkunft ab. Bei der Isolierung von DNA aus Einzelzellen mit einem proteinasehaltigen Lysepuffer muss die Probe bei 95 °C für 10 min denaturiert werden, um die Polymerase bei der anschließenden PCR nicht zu stören.
2. PCR-Setup und Thermoblock-Einstellungen
   1. Richten Sie die PCR mit einer High-Fidelity-Polymerase Ihrer Wahl ein. Bereiten Sie eine Mastermischung für vier Reaktionen vor. Da für einen Pyrosequenzierungslauf nur 10 μl PCR-Reaktion benötigt werden, bereiten Sie 25 μl PCR-Reaktionen vor (um ggf. eine technische Wiederholung zu ermöglichen). Verwenden Sie 40 PCR-Zyklen mit ca. 10 ng genomischer DNA als Ausgangsmaterial mit 1 μM sowohl des Vorwärts- als auch des Rückwärtsprimers.
   2. Stellen Sie die Verlängerungszeit gemäß den Herstellerangaben für die verwendete Polymerase unter Berücksichtigung der Länge der gewählten Preamplifikationsprimer ein.
   3. Verwenden Sie einen Thermocycler mit variablen Glühtemperatureinstellungen. Da die Glühtemperatur in Abhängigkeit von der Primersequenz, dem Salzgehalt des Polymerase-Puffers und anderen Faktoren unterschiedlich sein kann, sollten Sie vier verschiedene Glühtemperaturen in das Thermal Cycling Programm einprogrammieren.
      HINWEIS: Im Beispiel der repräsentativen Ergebnisse wurden die folgenden Temperaturen verwendet: 55 °C, 60 °C, 65 °C und 70 °C.
   4. Teilen Sie den Master Mix in vier 200-μl-PCR-Röhrchen auf und stellen Sie sie so ein, dass sie 40 Zyklen lang bei jeder der vier ausgewählten Glühtemperaturen im Thermocycler laufen.
3. Visualisierung von Vorverstärkungsbändern
   1. Während des PCR-Laufs wird ein 2%iges (w/v) Agarosegel in 1x FSME mit SYBR Safe oder Ethidiumbromid als Visualisierungsmittel hergestellt.
      HINWEIS: Für die Visualisierung wird ein höherprozentiges Gel empfohlen, da die amplifizierten Fragmente in der Regel kurz sind und typischerweise zwischen 100 und 500 Basenpaare liegen.
   2. Nachdem die PCR in Schritt 2.2 abgeschlossen ist, mischen Sie 10 μl der Reaktion mit einer geeigneten Menge DNA-Ladepuffer und lassen Sie das 2%ige Agarosegel bei 7 V/cm etwa 45 Minuten lang laufen.
   3. Visualisieren Sie die resultierenden DNA-Fragmente auf einem UV-Transilluminator.
      Anmerkungen: Die für den Vorverstärkungsschritt ausgewählten Temperaturwechselbedingungen sollten ein einzelnes sauberes Band der erwarteten Größe erzeugen. Niedrigere Annealing-Temperaturen können gelegentlich zu einer Off-Target-Amplifikation führen, was zu Verzerrungen bei der nachfolgenden Pyrosequenzierung führen kann.
   4. Wählen Sie die niedrigste Glühtemperatur, die ein sauberes Band der richtigen Größe für nachfolgende Verstärkungen erzeugt.
   5. (Optional) Schneiden Sie eine Bande der erwarteten Größe heraus, reinigen Sie sie mit einem Gelextraktionskit Ihrer Wahl und analysieren Sie sie durch Sanger-Sequenzierung, um die ungefähre Heteroplasmie der Probe als Referenz zu bestätigen.

3. Einrichten und Ausführen des Geräts

HINWEIS: Sobald der PCR-Schritt im vorherigen Abschnitt optimiert ist, besteht der nächste Schritt darin, den Pyrosequenzer mit der richtigen Nukleotidsequenz zu programmieren, um auf den spezifischen SNP zu analysieren. Dabei werden 10 Basen direkt stromabwärts des 3'-Endes des Sequenzierprimers eingegeben. Dies wird im folgenden Abschnitt detailliert beschrieben.

1. Assay-Konfiguration
   1. Öffnen Sie die mit dem Pyrosequenzer gelieferte Laufsoftware und wählen Sie Neuer Assay in der oberen linken Ecke der Benutzeroberfläche.
   2. Wählen Sie die Assay-Vorlage für die Allelquantifizierung aus.
   3. Geben Sie die zu analysierende Sequenz in das entsprechende Feld ein, indem Sie die Nukleotide eingeben, die direkt stromabwärts des Sequenzierungsprimers eingebaut werden sollen, der sich stromaufwärts des interessierenden SNP befinden sollte. Bezeichnen Sie für die variable Position die beiden möglichen Basen, die durch einen Schrägstrich getrennt sind (z. B. A/T).
   4. Klicken Sie auf Dispensationsreihenfolge generieren und lassen Sie die Software automatisch eine geeignete Reihenfolge für die Nukleotide bestimmen, die in der Sequenzierungsreaktion durch Synthese abgegeben werden sollen.
   5. Speichern Sie den Assay und geben Sie einen Namen ein.
2. Reagenzienvorbereitung und -lagerung
   1. Verdünnen Sie den bestellten Sequenzierungsprimer auf 4 μM im Glühpuffer, der im Pyrosequenzer-Reagenzienkit enthalten ist.
      HINWEIS: Der Sequenzierprimer kann zunächst in Wasser auf 100 μM als Stammlösung verdünnt und anschließend bei Bedarf in Glühpuffer auf 4 μM weiter verdünnt werden.
   2. Enzym- und Substratvorbereitung und -handhabung
      1. Lösen Sie beim ersten Auspacken das gefriergetrocknete Enzym und das Substrat gemäß den Empfehlungen des Herstellers wieder auf. Bei Nichtgebrauch bei −20 °C lagern.
      2. Bei späterer Verwendung die Enzym- und Substratfläschchen bei −20 °C auftauen.
         Anmerkungen: Alle anderen Reagenzien im mitgelieferten Kit können bei 4 °C gekühlt aufbewahrt werden. Verdünnte Sequenzierprimer können auch bei 4 °C aufbewahrt werden.
   3. Geben Sie die erforderliche Menge jedes Reagenzes auf Eis.
   4. Bewahren Sie die restlichen erforderlichen Komponenten, nämlich die Streptavidin-beschichteten Magnetperlen, Absorberstreifen und Pyrosequenzierscheiben, bei 4 °C auf.
3. Ausführung ausführen
   HINWEIS: Wenn ein Assay zum ersten Mal entworfen wird, muss er mit PCR-Produkten bekannter Heteroplasmie kalibriert werden, um sicherzustellen, dass der Assay Heteroplasmen genau unterscheiden kann. Standardmäßig können Forscher Mischungen von PCR-Produkten bekannter Heteroplasmie verwenden. Die Proben können auch mit anderen Methoden verifiziert werden, die in der Einleitung und in der Diskussion erwähnt werden, insbesondere mit NGS.
   1. Verdünnen Sie die zu analysierende DNA auf 5 ng/μL. Achten Sie insbesondere im ersten Durchlauf darauf, Proben bekannter Heteroplasmie als Referenz und/oder Wildtyp-Proben einzubeziehen.
   2. Führen Sie eine Präsequenzierungs-PCR von 5 μl verdünnter DNA in 25-μl-Reaktionen unter Verwendung der in Abschnitt 1 und Abschnitt 2 identifizierten Amplifikationsprimer und -parameter durch. Führen Sie für jede Probe technische PCR-Wiederholungen durch.
      HINWEIS: Die Präamplifikations-PCR kann kurzfristig bei 4 °C oder langfristig bei −20 °C gelagert werden, bevor mit der Sequenzierung fortgefahren wird.
   3. Ausführen des Datei-Setups
      1. Wählen Sie " Neuer Lauf" in der oberen linken Ecke der Pyrosequencer-Software.
      2. Der Pyrosequenzer kann gleichzeitig 48 separate vorverstärkte Reaktionen sequenzieren, wobei ein leeres Quadrat eine einzelne Sequenzierungsvertiefung auf einer Pyrosequenzierungsscheibe darstellt. Laden Sie die in Abschnitt 3.1 konfigurierten Assays, indem Sie mit der rechten Maustaste auf ein Quadrat klicken und Assay laden auswählen. Sequenzieren Sie bei Bedarf bis zu vier separate Assays mit unterschiedlichen Sequenzierungsprimern.
      3. Stellen Sie den Primer-Dosiermodus auf Automatisch ein, um jedem für den Lauf verwendeten Sequenzierprimer automatisch eine Injektionskammer zuzuweisen.
      4. Legen Sie den Ausführungsmodus auf Standard fest, es sei denn, es werden vier verschiedene Arten von Assays auf einer Sequenzierungsplatte ausgeführt.
      5. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Assays in der Laufvorlagendatei mit der Anzahl der zu amplifizierenden PCR-Reaktionen übereinstimmt.
         HINWEIS: Wenn Sie mehr als 48 Samples ausführen, müssen zusätzliche Ausführungsdateien eingerichtet werden.
      6. Speichern Sie die Ausführungsdateien auf einem USB-Laufwerk.
   4. Vorbereiten des Pyrosequenzers
      1. Drücken Sie die Reinigungstaste auf dem Haupttouchscreen des Geräts und reinigen Sie alle Einspritzdüsen mit hochreinem Wasser gemäß den Anweisungen auf dem Bildschirm. Achten Sie beim Einsetzen des Absorberstreifens in die Maschine darauf, dass sich die Enden in der Position "9 Uhr" (direkt links von der Mitte) treffen.
      2. Stecken Sie den USB-Stick mit den in Schritt 3.3.3 eingerichteten Läufen ein und laden Sie die in Schritt 3.3.3 definierten Ausführungsdateien.
         HINWEIS: Die ausgeführten Dateien müssen außerhalb eines Verzeichnisses oder Ordners auf dem USB-Stick gespeichert werden, da sie sonst vom Gerät nicht gelesen werden können.
      3. Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Gerät, um die Reagenzien nach Bedarf in die entsprechenden Injektoren des Geräts zu laden und vorzubereiten.
   5. Probenvorbereitung und Assay-Start
      1. Lassen Sie die Streptavidin-beschichteten Magnetperlen auf Raumtemperatur ausgleichen.
         HINWEIS: Diese Kügelchen ermöglichen es dem Gerät, den biotinylierten Strang aus dem PCR-Schritt vor der Amplifikation zu erfassen. Sie müssen separat aus dem Kit erworben werden.
      2. Laden Sie 3 μl Perlen in die Vertiefungen, die in der Ausführungsdatei aus Schritt 3.3.3 definiert sind.
      3. Laden Sie 10 μl jeder zu sequenzierenden PCR-Reaktion in die entsprechende Probe und pipettieren Sie auf und ab, um die Probe mit den magnetischen Beads zu mischen. Vermeiden Sie, wenn möglich, Blasen.
      4. Achten Sie auf die Anzeige im vorbereiteten Pyrosequenzer, dass die Scheibe in die Maschine eingelegt werden kann. Schrauben Sie die Haltemutter der Platte ab, bevor Sie die geladene Probenplatte mit dem Metallstift im Scheibenfach ausrichten.
      5. Sobald die Platte fest in das Plattenfach eingeschraubt ist, starten Sie den Sequenzierlauf, indem Sie die Starttaste auf der Touchscreen-Oberfläche drücken.

4. Ergebnisakquise

1. Sobald der Lauf abgeschlossen ist, entfernen Sie das USB-Laufwerk aus dem Gerät und schließen Sie es wieder an den Computer an, auf dem die Pyrosequenzer-Software ausgeführt wird. Fahren Sie mit den folgenden Schritten fort und reinigen Sie den Pyrosequenzer gemäß den Anweisungen, wenn es sich um den letzten Durchlauf des Tages handelt.
2. Warten Sie, bis die neu generierte Ausführungsdatei auf dem USB-Laufwerk angezeigt wird, und doppelklicken Sie auf die Ausführungsergebnisdatei. Dadurch wird automatisch der Luciferase-Output jedes Wells beim Einbau des Nukleotids analysiert und das mitochondriale Allel von Interesse quantifiziert, das während der Assay-Konfiguration in Abschnitt 3.1 definiert wurde.
3. Achten Sie auf die folgenden Farbwerte, die von der Software basierend auf der Qualität der Lesevorgänge angezeigt werden. Blau steht für eine optimale Ausführung, Gelb für eine Ausführung mit einer Warnung und Rot für eine fehlgeschlagene Ausführung. Um die Ergebnisse zu speichern, wählen Sie im oberen Fenster Berichte | Vollständiger Bericht , um eine .pdf Datei zu erstellen, die die Pyrogramme und Ergebnisse aus jedem Bohrloch des Laufs enthält. Alternativ können Sie die Ergebnisse auch in anderen Formaten auf der Registerkarte Berichte herunterladen.

Representative Results

In diesem Abschnitt werden ein Beispiel für die Optimierung eines Pyrosequenzierungsassays für eine humanpathogene mtDNA-Mutation sowie Sequenzierungsdaten aus der Genotypisierung von heteroplasmatischen (m.5024C>T) embryonalen Fibroblasten (MEFs) der Maus vorgestellt, die mit mitochondrialen Zinkfingernukleasen (mtZFNs) behandelt wurden. Die Optimierung des Assays für menschliche Zellen und der Vergleich zweier verschiedener Assays zeigt, wie der genaueste ausgewählt werden kann, während die Genotypisierung genetisch veränderter MEF-Zellen im zweiten Beispiel als angewandtes Beispiel für die Erkennung von Heteroplasmieverschiebungen nach gentherapeutischen Eingriffen dient.

Humane m.3243A>G-Mutation
Dieses Beispiel veranschaulicht die Genotypisierung einer häufigen pathogenen Variante von mtDNA-m.3243A>G. Die häufige m.3243A>G-Mutation liegt mehreren klinischen Erkrankungen zugrunde, insbesondere der mitochondrialen Enzephalopathie, der Laktatazidose und schlaganfallähnlichen Episoden (MELAS), der mütterlich vererbten Taubheit und Diabetes (MIDD) und der progressiven externen Ophthalmoplegie (PEO)²³. Dieser Assay kann auch zur Genotypisierung der selteneren m.3243A>T-Variante²⁴ verwendet werden, indem die Sequenz der einzubauenden Nukleotide umprogrammiert wird, wie in Abschnitt 3.1.3 des Protokolls beschrieben.

In Anlehnung an die Richtlinien zur Primeroptimierung in Abschnitt 1 wurden die folgenden Primer-Sets ausgewählt, eines für jeden Strang:

Assay 1:

Stürmer: 5' - [Biotin] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Rückwärts: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Sequenzierung: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'

Amplikongröße: 215 bp

Assay 2:

Stürmer: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Rückwärts: 5' - [Biotin] GTTGGCCATGGGTATGTTGTT- 3'
Sequenzierung: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'

Amplikongröße: 182 bp

Um die thermischen Zyklusbedingungen für den Assay zu bestimmen, wurde zunächst eine thermische Gradienten-PCR unter Verwendung einer Hot-Start-Polymerase (siehe Materialtabelle) durchgeführt und gemäß Abschnitt 2 durch Elektrophorese analysiert. Vierzig Zyklen wurden verwendet, um etwa 10 ng DNA als Ausgangsvorlage zu amplifizieren. Im Anschluss an die Schritte unter Abschnitt 2.3 des Protokolls wurde eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, um die Spezifität des Amplifikationsprotokolls bei einer bestimmten Annealing-Temperatur zu überprüfen (Abbildung 2A). Erfolgreiche Banden der richtigen Größe (entweder 215 bp oder 182 bp) konnten bei allen Temperaturen beobachtet werden; Die niedrigeren Glühtemperaturen in Assay 1 führten jedoch zu einer Off-Target-Amplifikation. Die richtige Glühtemperatur für die Vorverstärkung wurde auf 70 °C festgelegt (Abbildung 2A). Um die Genauigkeit beider Assays zu ermitteln und den besten auszuwählen, wurden molare Standards mit bekanntem m.3243A>G-Prozentsatz erzeugt, indem geeignete Mengen eines reinen PCR-Produkts in verschiedenen Verhältnissen gemischt wurden: 0 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, 90 % bzw. 100 % m.3243A>G (Abbildung 2B, gestrichelte Linie). Bei der Durchführung beider Assays an den Standards beobachteten wir eine größere Korrelation mit dem erwarteten Ergebnis in Assay 2 (Abbildung 2B). Anschließend verwendeten wir beide Assays an m.3243A>G-Cybridzellen in einem Genotypisierungsexperiment und beobachteten eine ausgeprägte Verzerrung in Assay 1, insbesondere in der Nähe homoplasmatischer Bedingungen (Abbildung 2C).

murine m.5024C>T-Mutation
In diesem Beispiel handelt es sich um MEF-Zellen, die mit mtZFNs behandelt wurden, die entwickelt wurden, um das Niveau der m.5024C>T-Mutation¹² zu senken, als Beispiel für ein mitochondriales Gentherapieexperiment, bei dem die Genotypisierung durch Pyrosequenzierung als quantitativer Vergleich zwischen Proben nützlich ist. Die MEF-Zellen stammen aus einem veröffentlichten Mausmodell, das eine C>T-Mutation an Position 5.024 in der mtDNA der Maus (m.5024C>T)²⁵ aufweist. Das Experiment bestand darin, die MEFs mit Plasmiden, die für mtZFNs und verschiedene fluoreszierende Reporter kodieren, zu elektroporieren und anschließend die Zellen, die die Plasmide exprimierten, nach 24 h durch FACS zu sortieren. Die Zellen wurden dann 2 Wochen lang vor dem Heteroplasmievergleich durch Pyrosequenzierung erholt.

Der Primersatz, der für die Sequenzierung der m.5024C>T-Position verwendet wurde, lautete wie folgt:

Stürmer: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Rückseite: 5' - [Biotin] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
Sequenzierung: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'

Amplikongröße: 267 bp

Die Proben wurden in technischer dreifacher Ausführung sequenziert, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu erhöhen. Das Experiment wurde auch in biologischer Duplikate durchgeführt, so dass für jede der Bedingungen sechs separate Werte ermittelt wurden (Abbildung 3B). Die Daten von 2 der 18 Pyrogramme wurden verwendet, um Abbildung 3B zu konstruieren; Diese Pyrogramme sind in Abbildung 3A dargestellt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der mitochondrialen Sequenzen in einer Zelle und der allgemeine technische Umriss der Pyrosequenzierung. (A) Schematische Darstellung der mitochondrialen DNA und der mitochondrialen Kernsequenzen. Die Abbildung stellt den evolutionären Ursprung von Sequenzen mit hoher Homologie dar. (B) Schematische Darstellung der Pyrosequenzierungs-Assay-Pipeline mit einer abschließenden Beispielsequenz, die einen Heteroplasmiewert von ca. 50 % C>G darstellt. Die Template-DNA wird zunächst durch ausgewählte Amplifikationsprimer amplifiziert, von denen einer am 5'-Ende biotinyliert ist. Nach der Amplifikation behält der Pyrosequenzer einen einzelnen DNA-Strang als Vorlage für die Sequenzierung mit Streptavidin-beschichteten Magnetkügelchen, die blau dargestellt sind. Schließlich ermöglicht ein Sequenzierungsprimer die Sequenzierung durch Synthese einer vordefinierten Reihe von Nukleotiden, wodurch ein Pyrogramm erzeugt wird, das schematisch dargestellt wird. Die Stöchiometrien jeder Base lassen sich leicht erhalten, indem man die relativen Peakhöhen bei jedem Inkorporationsereignis vergleicht: Das gleiche Nukleotid erzeugt zweimal hintereinander einen doppelten Peak im Vergleich zu einer einzelnen Base. Der Schrägstrich in der zu analysierenden Sequenz bezeichnet den hypothetischen SNP, der "C" oder "G" sein könnte. Beachten Sie die anfängliche Abgabe einer simulierten "G"-Basis auf der x-Achse des Pyrogramms, die typischerweise vom Pyrosequenzer als Negativkontrolle durchgeführt wird. Abkürzungen: mtDNA = mitochondriale DNA; NUMTs = nukleäre mitochondriale Sequenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Optimierung des Pyrosequenzierungs-Primer-Sets am Beispiel der humanen m.3242A>G-Mutation. (A) Agarose-Gelelektrophorese (2 % w/v) einer PCR-Amplifikation unter Verwendung der Amplifikationsprimer aus beiden Sets, die für die m.3242A>G-Mutation ausgewählt wurden. WT bezeichnet Wildtyp-Kontroll-DNA, während Het die nahezu homoplasmatische m.3243A>G-Probe ist, die analysiert werden soll. Bei den Temperaturen handelt es sich um die Glühtemperatur, die in einer 40-Zyklen-PCR-Reaktion verwendet wird. (B). Ein Vergleich der Leistung beider Primer-Sets unter Verwendung molarer Standards für die Kalibrierung, die durch Mischen verschiedener Verhältnisse von reinem Wildtyp- und reinem mutiertem m3243A>G-Produkt erhalten wurden. Die Messwerte sind durch die senkrechten gestrichelten Linien gekennzeichnet. Eine lineare Funktion X = Y wird angezeigt, um zu veranschaulichen, wie nah jeder der beiden getesteten Assays an einer idealen Messung liegt. Die Namen der Zelllinien auf der x-Achse sind die Namen der verschiedenen Cybrid-Klone, die mit diesem Assay genotypisiert wurden. (C) Genotypisierungsergebnisse an vier Cybrid-Klonen unbekannter m.3243A>G-Heteroplasmie unter Verwendung beider Assays. Die Sequenzierung erfolgte in technischer Ausfertigung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Heteroplasmiemessung an FACS-sortierten m.5024C>T-MEFs, die mit der mtZFN-Geneditierungstechnologie behandelt wurden. (A) Pyrogramme von zwei MEF-Zellproben-PCR-Replikaten, die zur Erstellung von Abbildung 3B verwendet wurden, sowie die Wildtyp-Genotypisierungskontrolle. Die Lumineszenzwerte auf der Y-Achse sind in A.U. (B) Genotypisierungsergebnisse von mtZFN-behandelten Zellen zusammen mit unbehandelten und simulierten Kontrollen angegeben. Die MEFs wurden mit Plasmiden, die für mtZFNs und verschiedene fluoreszierende Reporter kodieren, elektroporiert und anschließend nach 24 h nach FACS sortiert. Die Zellen wurden dann 2 Wochen lang vor dem Heteroplasmievergleich durch Pyrosequenzierung erholt. Die Fehlerbalken wurden mit biologischen Duplikaten berechnet, die jeweils in technischer dreifacher Ausführung pyrosequenziert wurden. Abkürzungen: FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung; MEFs = embryonale Fibroblasten der Maus; mtZFN = mitochondriale Zinkfingernuklease; A.U. = beliebige Einheiten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Ein kritischer Aspekt für den Erfolg des Protokolls ist die Vermeidung von Kontaminationen, insbesondere bei der Verwendung geringer Mengen an Ausgangsmaterial. Es wird empfohlen, bei der Vorbereitung der Proben nach Möglichkeit eine UV-Haube und gefilterte Pipettenspitzen zu verwenden sowie die Bereiche vor und nach der Verstärkung getrennt zu halten. Blindproben und Proben bekannter Heteroplasmie (z. B. Wildtyp-DNA) sollten immer als Benchmarks verwendet werden, um technische oder biologische Verzerrungen zu überprüfen.

Eine bemerkenswerte technische Verzerrung, die dem Assay inhärent ist, ist das verstärkte Lumineszenzsignal, das durch den Einbau des Adeninanalogs erzeugt wird. Wenn Adenin an einer variablen Position verwendet wird, erzeugt es oft einen verbleibenden Fluoreszenzpeak (z. B. Abbildung 2C). Aus diesem Grund wird empfohlen, Pyrosequenzierungstests auf dem gegenüberliegenden Strang (wo ein Thymin eingebaut wird) durchzuführen, wenn möglich, um zu vermeiden, dass das Adenin-Analogon an der variablen Position eingebaut werden muss. Bei A>T- oder T>A-Mutationen ist dies jedoch nicht möglich. Nichtsdestotrotz kann, wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen, eine geeignete Wahl der Primer von größerer Bedeutung bei der Entwicklung eines Assays sein. Assay 2 für die m.3243A>G-Mutation im ersten Abschnitt der repräsentativen Ergebnisse, Sequenzen basierend auf dem A/G-Verhältnis an der variablen Position im Gegensatz zu Assay 1, der das T/C-Verhältnis misst. Obwohl Assay 2 anfällig für den Adenin-Einbau-Bias ist, liefert er genauere Ergebnisse auf der Grundlage des Vergleichs mit den molaren Standards, wie eine einfache lineare Regressionsanalyse zeigt (Abbildung 2B).

Verzerrungen sind in erster Linie das Ergebnis der NUMT-Co-Amplifikation³. Die große mitochondriale Kopienzahl verhindert in der Regel, dass nukleäre Off-Target-Sequenzen zu einer signifikanten Verzerrung führen. Bestimmte Regionen der mtDNA sind jedoch in vielen NUMTS vorhanden und sollten mit den im Protokoll unter Abschnitt 1 angegebenen Methoden vermieden werden.

Unter Berücksichtigung der oben genannten Vorsichtsmaßnahmen ist diese Methode ein hochmodulares, schnelles und kostengünstiges Mittel zur Genotypisierung von SNPs in der mtDNA. Die Methode eignet sich jedoch nicht für alle Anwendungen der mitochondrialen Genotypisierung, insbesondere für großflächige Deletionen, für die die digitale Tröpfchen-PCR empfohlen wird²⁶. Variabilität bei der Abgabe von Reagenzien durch den Sequenzierer oder unterschiedliche Primer-/Amplifikationsbedingungen können dazu führen, dass kleine Verzerrungen eingeführt werden. Aus diesem Grund werden in der Regel technische Triplikate empfohlen, um die Richtigkeit der Genotypisierungsergebnisse zu bestätigen. Eine weitere Einschränkung des Ansatzes ist der Umfang, da nur kurze, vordefinierte Spannen der mtDNA genotypisiert werden können. Während Pyrosequenzer so programmiert werden können, dass sie Hunderte von Basenpaaren unbekannter Sequenz sequenzieren, wird dies schnell weniger kostengünstig als die Verwendung eines NGS-Ansatzes. Die Forscher könnten zunächst die Pyrosequenzierung als schnelle Genotypisierungsmethode implementieren, die eine präzise quantitative Antwort liefert, aber anschließend ausgewählte Proben von NGS auf weitere Präzision und Kontext analysieren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese etablierte Methode nach wie vor ein fester Bestandteil der mitochondrialen Genforschung ist und einen schnellen und einfachen Zugang zu quantitativen Heteroplasmiemessungen bietet, die in vielen Forschungskontexten auf diesem Gebiet von entscheidender Bedeutung sind, wie z. B. bei der Patientendiagnose, der Gentherapie oder der Genotypisierung von Tiermodellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD Hot Start DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	71086
PyroMark Assay Design 2.0	QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips	QIAGEN	974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48)	QIAGEN	974022
Pyromark Q48 Autoprep	QIAGEN	9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set	QIAGEN	9024321
Pyromark Q48 Disks	QIAGEN	974901
Pyromark Q48 Magnetic beads	QIAGEN	974203
PyroMark Q48 Software License (1)	QIAGEN	9024325