Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

גנוטיפ פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בגנום המיטוכונדריאלי על ידי Pyrosequencing

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64361
Automatic Translation
1, 1, 1
1Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus

Summary

מבחני Pyrosequencing מאפשרים גנוטיפ חזק ומהיר של DNA מיטוכונדריאלי, פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בתאים או רקמות הטרופלזמיים.

Abstract

מוטציות בגנום המיטוכונדריאלי (mtDNA) נקשרו למחלות גנטיות תורשתיות אימהיות. עם זאת, העניין בפולימורפיזמים של mtDNA גדל בשנים האחרונות בשל היכולת שפותחה לאחרונה לייצר מודלים על ידי מוטגנזה mtDNA והערכה חדשה של הקשר בין סטיות גנטיות מיטוכונדריאליות ומחלות נפוצות הקשורות לגיל כגון סרטן, סוכרת ודמנציה. Pyrosequencing היא טכניקת ריצוף על ידי סינתזה הנמצאת בשימוש נרחב ברחבי שדה המיטוכונדריה עבור ניסויים גנוטיפיים שגרתיים. מחירה היחסי בהשוואה לשיטות ריצוף מקבילי מאסיביות וקלות היישום הופכים אותה לטכניקה רבת ערך בתחום הגנטיקה של המיטוכונדריה, ומאפשרת כימות מהיר של הטרופלזמה עם גמישות מוגברת. למרות המעשיות של שיטה זו, יישומה כאמצעי לגנוטיפ mtDNA דורש תצפית על הנחיות מסוימות, במיוחד כדי למנוע הטיות מסוימות ממוצא ביולוגי או טכני. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים ואמצעי הזהירות הדרושים בתכנון ויישום מבחני pyrosequencing לשימוש בהקשר של מדידת הטרופלזמה.

Introduction

הגנום המיטוכונדריאלי קיים בצורה של מולקולות מעגליות קטנות (16.5 קילובייט) (mtDNA) הנמצאות בתא הפנימי ביותר של המיטוכונדריה הנקראות מטריצה ומקודדות 13 תת-יחידות של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית, כמו גם את ה-tRNA וה-rRNA הדרושים לתרגומם באתרם על ידי הריבוזום המיטוכונדריאלי1. גנום זה מייצג כ-1% מכלל החלבונים הדרושים לתפקוד המיטוכונדריה, והשאר מקודדים על ידי הדנ"א הגרעיני (nDNA). מקובל להניח כי מיטוכונדריה נגזרים מאירוע איחוי אנדוסימביוטי בין אב קדמון אלפא-פרוטאובקטריאלי לבין תא איקריוטי קדמון. ברגע שסימביוזה היפותטית זו התרחשה, המידע הגנטי של המיטוכונדריה הועבר בהדרגה לגרעין במשך עידנים, מה שמסביר את הקומפקטיות הנ"ל של mtDNA בהשוואה לגנום של ציאנובקטריה מודרנית2. העברה כזו של גנים מתבטאת בצורה החזקה ביותר בקיומם של חלקים ארוכים של nDNA שהם הומולוגיים מאוד לרצפים הנמצאים ב- mtDNA. הרצפים המיטוכונדריאליים הגרעיניים האלה (NUMTs) הם מקור נפוץ לפרשנות שגויה במהלך גנוטיפ, ויש לנקוט אמצעי זהירות מסוימים כדי להימנע מהטיות גרעיניות בעת גנוטיפ mtDNA3 (איור 1A).

תכונה ייחודית נוספת של mtDNA היא שמספר העותקים שלו משתנה בהתאם לסוג התא, ומספור בין עשרות לאלפי עותקים לכל תא4. בשל אופי מרובה עותקים זה, mtDNA יכול להכיל מגוון רחב של גנוטיפים בתוך תא יחיד, מה שיכול לגרום לפיזור רציף יותר של אללים בניגוד לאללים בדידים הקשורים לגנים גרעיניים כאשר לוקחים בחשבון את הזיגוסיות של כרומוזומים. הטרוגניות זו של אללים מיטוכונדריאליים מכונה הטרופלזמה מיטוכונדריאלית, המתבטאת בדרך כלל באחוז השכיחות של מוטציה נתונה כשיעור מסך mtDNA בתא נתון. הטרופלזמה יכולה להיות מנוגדת להומופלזמה, המתייחסת למין ייחודי של mtDNA שנמצא על פני תא.

מדידת הטרופלזמה של המיטוכונדריה מעניינת במיוחד כאשר מכמתים את חלקן של מולקולות mtDNA המכילות וריאנטים פתוגניים. גרסאות כאלה מגיעות בצורה של פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs), אינדל קטן, או מחיקות בקנה מידה גדול5. רוב בני האדם הם הטרופלזמיים עבור וריאנטים פתוגניים; עם זאת, הם אינם מציגים פנוטיפים קליניים, אשר לעתים קרובות מתבטאים רק ברמות הטרופלזמה גבוהות יותר של mtDNA פתוגני בתופעה המכונה אפקט סף6. בעוד הערכים הקשורים פתוגניות תלויים מאוד באופי של מוטציה פתוגנית ואת הרקמה שבה היא מתרחשת, הם בדרך כלל נמצאים מעל 60% הטרופלזמה7.

ישנם מספר תחומי מחקר בהם גנוטיפ מיטוכונדריאלי נפוץ. בתחום הרפואי, בדיקה או כימות של מוטציות mtDNA יכולות לשמש כקריטריון אבחוני למחלות מיטוכונדריאליות, שרבות מהן כוללות סטיות mtDNA כמקורשלהן 5. בנוסף לחקר מוטציות פתוגניות בבני אדם, השכיחות של מודלים של בעלי חיים המכילים SNPs פתוגניים ב- mtDNA צפויה לעלות, בהתחשב בהופעה האחרונה של עריכת בסיס מיטוכונדריאלי המתאפשרת על ידי עורכי בסיס ציטוזין ממוקדים במיטוכונדריה (DdCBEs)8 ו- DEAMINASES מבוססי TALE(TALEDs) לעריכת בסיס אדנין9. גישה זו תסייע בהבנת יחסי הגומלין בין גנוטיפים מיטוכונדריאליים חריגים לבין התפקוד הלקוי הנובע מכך. יש גם מחקר מדעי מתמשך על עיצוב מחדש של הגנום המיטוכונדריאלי לשימוש אולטימטיבי כאסטרטגיה טיפולית במחלות מיטוכונדריאליות אנושיות באמצעות גישה המכונה שינוי הטרופלזמה. תחום מחקר זה כולל בעיקר הכוונת נוקלאזות ספציפיות למוטציות למטריצה המיטוכונדריאלית; התוצאה היא השפלה מועדפת של mtDNA פתוגני, מה שמוביל להצלות בפנוטיפ 10,11,12,13. כל ניסוי הכרוך בעיצוב מחדש של הגנוטיפ המיטוכונדריאלי דורש שיטה כמותית חזקה כדי להעריך שינויים הטרופלזמה.

מגוון רחב של שיטות משמשות לגנוטיפ mtDNA, ואלה משתנות בהתאם לאופי המוטציה. שיטות ריצוף הדור הבא (NGS) מדויקות יותר כשמדובר בכימות SNPs ב- mtDNA; עם זאת, שיטות אלה נשארות יקרות מאוד לכימות שגרתי של הטרופלזמה מיטוכונדריאלית, במיוחד אם מספר הדגימות קטן. ריצוף Sanger יכול גם לאפשר זיהוי של SNPs; עם זאת, גישה זו אינה כמותית ולעתים קרובות אינה מצליחה לזהות רמות נמוכות של הטרופלזמה או יכולה להיות לא מדויקת בעת הערכת הטרופלסמיה גבוהה. Pyrosequencing, כבדיקה הכרוכה בהכנה מינימלית ומאפשרת כימות מהיר של הטרופלזמה עבור כל דגימת mtDNA, מוצעת כפשרה הולמת בין שני הקצוות הללו. שיטה זו שימשה באופן שגרתי לכימות SNPs מיטוכונדריאלי על ידי חוקרים רבים בהקשרים שונים, כולל ניתוח פורנזי 14,15, אבחנה קלינית16, או גנוטיפ של mtDNA מתאים בודדים17.

בדיקה זו כוללת שלב טרום הגברה ראשון של PCR של אזור הצמוד ל- SNP ב- mtDNA, ואחריו בדיקת רצף על ידי סינתזה באמצעות גדיל אחד של האמפליקון שנוצר בעבר. אחד משני הפריימרים המשמשים בשלב טרום ההגברה חייב להיות ביוטינילציה בקצה 5', מה שיאפשר למנגנון הפירוזקוונס לבודד את גדיל הדנ"א היחיד שישמש כתבנית לתגובת הריצוף. לאחר מכן משליכים פריימר ריצוף שלישי על גדיל הביוטינילציה השמור, מה שמאפשר סינתזת דנ"א מתהווה כדאוקסינוקלאוטידים להיות מופצים בסדר מוגדר מראש לתוך תא התגובה. הפירורצ'ר רושם את הכמות של כל בסיס משולב בהתבסס על קריאה זוהרת, מה שמאפשר כימות יחסי של אללים מיטוכונדריאליים מוטנטיים ופראיים על סינתזת דנ"א (איור 1B). הלומינסנציה נוצרת על ידי אנזים לוציפראז, אשר פולט אור בנוכחות ATP כי ATP sulfurylase מסנתז דה נובו בכל אירוע התאגדות מן pyrophosphates שוחרר על ידי כל נוקלאוטיד. ניתן לסכם את שתי התגובות הללו כך:

1. PPi (משילוב נוקלאוטידים) + APS → ATP + סולפט (ATP סולפורילאז)

2. ATP + luciferin + O 2 → AMP + PPi + oxyluciferin + CO2 + אור (luciferase)

איתור בסיסי אדנין על ידי הפירורצ'ר ללא ATP צולב עם לוציפראז בתגובה השנייה הוא אתגר. עם זאת, זה נפתר באמצעות אנלוגי אדנין עבור סינתזת DNA, כלומר dATPαS. למרות שאינו מצע מושלם עבור לוציפראז, הוא מייצר בהירות חזקה יותר בהשוואה לשלושת הנוקלאוטידים האחרים, אשר מכוונן דיגיטלית על ידי הפירורצ'ר ומוגדר לפקטור של 0.9. בשל שונות אינהרנטית זו, מוצע להימנע מריצוף אדנין בעמדת SNP (ראה דיון לפרטים נוספים).

הפרוטוקול הבא מפרט את השיטה של הערכת הטרופלזמה mtDNA על ידי pyrosequencing ומתאר את אמצעי הזהירות הדרושים בתכנון פריימרים הגברה כדי למנוע הטיה ביולוגית או טכנית בעת גנוטיפ SNPs ב mtDNA. האחרון כולל סקירה דיגיטלית ובחירת ערכות פריימר, אופטימיזציה של PCR טרום הגברה, ולבסוף, ריצוף וליטוש הבדיקה. שתי דוגמאות יישומיות מודגמות: ראשית, אופטימיזציה של הגרסה הפתוגנית האנושית הנפוצה ביותר m.3243A>G18, ושנית, גנוטיפ של תאי פיברובלסט עובריים של עכברים (MEF) שעברו הסטת הטרופלזמה באמצעות טכנולוגיות שפותחו במעבדת מינצ'וק בקיימברידג' 10,11,12,19,20,21,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הסכמה מדעת ניתנה לשימוש בתאי הציבריד האנושיים 3243A>G ובתאי M.5024C>T MEFs האימורטליים ששימשו במחקר זה. אישור אתי לא נדרש במקרה זה מכיוון שתאי החולה לא נאספו באוניברסיטת קיימברידג '. עם זאת, השימוש בפיברובלסטים אנושיים עשוי לדרוש אישור אתי. מומלץ מאוד לעקוב אחר שיטות עבודה מומלצות להגדרת PCR בעת הכנת DNA הדגימה עבור pyrosequencing. הגברה תכופה באמצעות פריימרים זהים עלולה להוביל לזיהום אמפליקון ולהציג הטיה לגנוטיפ הבא אם לא נצפתה הפרדה קפדנית בין האזורים שלפני ה-PCR והפוסט-PCR. הצינור המוצג כאן משתמש בציוד ספציפי מיצרן יחיד; את הפרטים ניתן למצוא בטבלת החומרים. עיצוב הפריימר עבור PCR יכול להתבצע באופן ידני אם תרצה בכך; עם זאת, מומלץ להשתמש בתוכנות קיימות למטרה זו (ראה טבלת חומרים).

1. עיצוב פריימר Pyrosequencing ובחירת בדיקה

  1. השגת מועמדים ראשוניים באמצעות תוכנה
    1. השג קובץ רצף mtDNA עבור המינים הגנוטיפיים, וזהה את המיקום של SNP. ודא שרצף הייחוס המשמש משתמש במספור הבסיס המתאים למוטציה שנחקרה, כך שניתן יהיה לזהות בקלות את מיקום ה- SNP.
    2. העתק 1,000 זוגות בסיסים במעלה ובמורד הזרם של אתר SNP, והדבק את הרצף החתוך בתוכנה המיועדת לעיצוב פריימר pyrosequencing (ראה טבלת חומרים).
    3. הגדר את בסיס SNP מנותח כיעד של בדיקת pyrosequencing בתוכנה על ידי הדגשת הבסיס הפולימורפי ולחיצה ימנית על ולאחר מכן בחירת אזור היעד המוגדר.
    4. לחץ על סמל ההפעלה בפינה השמאלית העליונה של הממשק כדי להפעיל בחירת פריימר.
    5. המתן עד שהתוכנה תייצר כעת באופן אוטומטי שלישיות פריימר: שני פריימרים להגברה מוקדמת של DNA התבנית ופריימר שלישי לריצוף על ידי סינתזה במכונת pyrosequencing. שמור על כל ערכות הפריימר על-ידי לחיצה ימנית ובחירה באפשרות העתק את כל ערכות הפריימר.
  2. בחירת ערכות הפריימר האופטימליות מהרשימה שנוצרה
    1. שמור על ערכות הפריימר עם ציון האיכות הגבוה ביותר בהתבסס על פלט התוכנה, המספק ערכות פריימר בסדר יורד בהתבסס על ציון האיכות. במידת האפשר, השמיט ערכות פריימר עם ציון נמוך מ- 80.
    2. עבור ערכות הפריימר השמורות, זהה והעתיק את האמפליקון המיוצר על ידי פריימרי ההגברה.
    3. יישר את האמפליקונים המיוצרים עם כל הגנום של האורגניזם כדי לעבור גנוטיפ באמצעות NCBI Blast באמצעות פורטל ההגשה המקוון https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. מהתפריטים הנפתחים במהלך השליחה, בחר את האפשרויות הבאות:
      1. בחר מסד נתונים | מסדי נתונים גנומיים + תמלילים.
      2. בחר אנושי או עכבר בתפריט הנפתח, בהתאם ל- SNP שניתח.
      3. בחר מטב עבור | רצפים דומים במקצת (Blastn).
    4. (אופציונלי) אם מדובר בגנוטיפ של אורגניזם שאינו עכבר או אדם, בחר את הפרטים הבאים במהלך השליחה:
      1. בחר מסד נתונים | מסד נתונים רגיל.
      2. בחר RefSeq Representative genomes בתפריט הנפתח
      3. בחר מטב עבור | רצפים דומים במקצת (Blastn)
    5. במידת האפשר, השמיט את כל האמפליקונים שיש להם הומולוגיה מושלמת למגבר mtDNA, במיוחד אם אזורי הקישור הראשוניים הומולוגיים לחלוטין (ראה דיון).
      הערה: כלי היישור BLAST יחזיר כל רצף עם הומולוגיה ניכרת למגברי קדם-הגברה. זה מאפשר זיהוי של NUMTs המתוארים במבוא, אשר אם לא נלקח בחשבון, יכול לגרום להטיה כפי שהם מוגברים יחד עם ה- DNA המיטוכונדריאלי.
    6. להזמין את האוליגוס שהושגו באמצעות צינור זה. יש לוודא כי שינוי ביוטין 5' מתווסף לפריימר ההגברה הנכון במהלך סדר הסינתזה, כך שפריימר הריצוף יהיה משלים לגדיל הביוטינילציה.
      הערה: הבחירה בפריימר ריצוף גמישה יותר מפריימר ההגברה, ומומלץ שיהיה לפחות בסיס אחד המפריד בין קצה 3' של פריימר הרצף לבין המיקום המשתנה.

2. אופטימיזציה של PCR לפני הגברה

  1. הכינו את דגימות הדנ"א על ידי חילוץ הדנ"א הגנומי הכולל בשיטה מתאימה.
    הערה: הדבר תלוי במידה רבה במספר התאים שעוברים גנוטיפ ובמקורם. אם מבודדים DNA מתאים בודדים באמצעות חיץ ליזה המכיל פרוטאינאז K, הדגימה חייבת להיות deproductd ב 95 ° C במשך 10 דקות כדי לא לשבש את פולימראז במהלך PCR הבאים.
  2. הגדרת PCR והגדרות חסימה תרמית
    1. הגדר את ה- PCR עם פולימראז באיכות גבוהה לבחירה. הכינו מאסטר מיקס לארבע תגובות. מכיוון שרק 10 μL של תגובת PCR נדרשים לריצת pyrosequencing, הכינו 25 μL של תגובות PCR (כדי לאפשר חזרה טכנית במידת הצורך). השתמש 40 מחזורים של PCR עם כ 10 ng של DNA גנומי כחומר המוצא עם 1 מיקרומטר של פריימרים קדימה ואחורה.
    2. הגדר את זמן ההארכה בהתאם למפרט היצרן עבור הפולימראז בו נעשה שימוש, תוך התחשבות באורך פריימרים קדם-הגברה שנבחרו.
    3. השתמש במחזור תרמי עם הגדרות טמפרטורת חישול משתנות. מכיוון שטמפרטורת החישול יכולה להשתנות בהתאם לרצף הפריימר, תכולת המלח של חיץ הפולימראז, וגורמים אחרים, מתכנתים ארבע טמפרטורות חישול שונות לתוכנית המחזור התרמי.
      הערה: הדוגמה העובדת בתוצאות המייצגות השתמשה בטמפרטורות הבאות: 55 °C, 60 °C, 65 °C (70 °F) ו- 70 °C (70 °C).
    4. פצלו את Master Mix לארבעה צינורות PCR של 200 μL, והגדירו אותם לפעול בכל אחת מארבע טמפרטורות החישול שנבחרו במחזור התרמי במשך 40 מחזורים.
  3. תצוגה חזותית של רצועת קדם-הגברה
    1. במהלך ריצת PCR, הכינו ג'ל אגרוז 2% (w/v) ב-1x TBE עם SYBR Safe או אתידיום ברומיד כחומר ויזואלי.
      הערה: אחוז גבוה יותר של ג'ל מומלץ להדמיה מכיוון שהשברים המוגברים הם בדרך כלל קצרים, בדרך כלל בטווח של 100 עד 500 זוגות בסיסים.
    2. לאחר השלמת ה-PCR בשלב 2.2, יש לערבב 10 μL של התגובה עם כמות מתאימה של מאגר טעינת DNA, ולהפעיל על ג'ל אגרוז 2% ב-7 וולט/ס"מ למשך כ-45 דקות.
    3. דמיינו את מקטעי הדנ"א המתקבלים על טרנסילטור UV.
      הערה: תנאי המחזור התרמי שנבחרו לשלב ההגברה אמורים לייצר רצועה נקייה אחת בגודל הצפוי. טמפרטורות חישול נמוכות יותר יכולות לעיתים לגרום להגברה מחוץ למטרה, מה שעלול לגרום להטיות לריצוף הפירוז שלאחר מכן.
    4. בחר את טמפרטורת החישול הנמוכה ביותר המפיקה פס נקי בגודל הנכון עבור הגברות הבאות.
    5. (אופציונלי) הבלו רצועה בגודל הצפוי, לטהר באמצעות ערכת מיצוי ג'ל לפי בחירה, ולנתח על ידי ריצוף Sanger כדי לאשר את ההטרופלזמה המשוערת של הדגימה כהפניה.

3. הגדרת מכשירים והפעלתם

הערה: לאחר ששלב ה-PCR בסעיף הקודם ממוטב, השלב הבא כולל תכנות הפירורצ'ר עם רצף הנוקלאוטידים הנכון לניתוח עבור SNP ספציפי. זה כרוך בהזנת 10 בסיסים ישירות במורד הזרם של קצה 3' של פריימר הרצף. זה מפורט בסעיף הבא.

  1. תצורת Assay
    1. פתח את תוכנת ההפעלה שסופקה עם pyrosequencer, ובחר New Assay בפינה השמאלית העליונה של הממשק.
    2. בחר את תבנית בדיקת הכימות של Allele .
    3. הזן את הרצף שיש לנתח בתיבה המתאימה על ידי הקלדת הנוקלאוטידים שישולבו ישירות במורד הזרם של פריימר הרצף, אשר אמור להיות במעלה הזרם של SNP של עניין. עבור מיקום המשתנה, ציין את שני הבסיסים האפשריים המופרדים באמצעות קו נטוי (לדוגמה, A/T).
    4. לחץ על צור סדר ניפוק, ותן לתוכנה לקבוע באופן אוטומטי סדר מתאים לחלוקת הנוקלאוטידים בתגובת הרצף על ידי סינתזה.
    5. שמור וספק שם עבור הבדיקה.
  2. הכנת מגיבים ואחסון
    1. יש לדלל את פריימר הריצוף שהוזמן ל-4 מיקרומטר במאגר החישול המסופק בערכת מגיב פירורצף.
      הערה: תחילה ניתן לדלל את פריימר הריצוף במים עד 100 מיקרומטר כתמיסת ציר ולאחר מכן לדלל עוד יותר בחיץ חיץ ל-4 מיקרומטר לפי הצורך.
    2. הכנת אנזימים וסובסטרטים וטיפול בהם
      1. בעת פתיחת האריזה הראשונה, יש להמיס מחדש את האנזים והמצע הליופיליים בהתאם להמלצות היצרן. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C כאשר אינו בשימוש.
      2. בשימוש לאחר מכן, הפשירו את בקבוקוני האנזים והמצע מ-20°C.
        הערה: כל שאר הריאגנטים בערכה המסופקת יכולים להישמר בקירור בטמפרטורה של 4°C. פריימרים לריצוף מדולל יכולים להישמר גם בטמפרטורה של 4°C.
    3. מניחים את הכמות הנדרשת של כל מגיב על קרח.
    4. שמור את שאר הרכיבים הדרושים, כלומר חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין, רצועות בולמים, ודיסקים pyrosequencing, ב 4 ° C.
  3. הפעל ביצוע
    הערה: כאשר בדיקה מתוכננת לראשונה, יש לכייל אותה באמצעות מוצרי PCR של הטרופלזמה ידועה, מה שמבטיח שהבדיקה יכולה להבחין במדויק בין הטרופלסמים. חוקרים יכולים להשתמש בתערובות של מוצרי PCR של הטרופלזמה ידועה כסטנדרטים. ניתן לאמת דגימות גם בשיטות אחרות שהוזכרו במבוא ובדיון, בעיקר NGS.
    1. דללו את הדנ"א לניתוח ל-5 ננוגרם/מיקרוליטר. במיוחד בסיבוב הראשון, הקפידו לכלול דגימות של הטרופלזמה ידועה כדגימות ייחוס ו/או דגימות מסוג פרא.
    2. בצע ריצוף PCR של 5 μL של DNA מדולל בתגובות 25 μL באמצעות פריימרים הגברה ופרמטרים שזוהו בסעיף 1 ובסעיף 2. בצע שכפול PCR טכני עבור כל דגימה.
      הערה: ניתן לאחסן את ה-PCR לפני הגברה לטווח קצר ב-4°C או לטווח ארוך ב-20°C לפני שממשיכים לרצף.
    3. הפעל את הגדרת הקובץ
      1. בחר הפעלה חדשה בפינה השמאלית העליונה של תוכנת pyrosequencer.
      2. הפירורצנר יכול לרצף בו זמנית 48 תגובות מוגברות נפרדות, כאשר ריבוע ריק מייצג היטב רצף יחיד על דיסק pyrosequencing. טען את הבדיקות שהוגדרו בסעיף 3.1 על ידי לחיצה ימנית על ריבוע ובחירה במבחן טעינה. במידת הצורך, רצף עד ארבע בדיקות נפרדות עם פריימרים שונים לריצוף.
      3. הגדר את מצב חלוקת הפריימר לאוטומטי כדי להקצות אוטומטית תא הזרקה לכל פריימר רצף המשמש לריצה.
      4. הגדר את מצב הפעלה לרגיל , אלא אם כן אתה מפעיל ארבעה סוגים שונים של בדיקות בדיסק רצף אחד.
      5. ודא שמספר הבדיקות בקובץ תבנית ההפעלה תואם למספר תגובות ה- PCR המוגברות.
        הערה: אם אתה מפעיל יותר מ- 48 דוגמאות, יהיה צורך להגדיר קבצי הפעלה נוספים.
      6. שמור את קבצי ההפעלה בכונן USB.
    4. הקדמת הפירורצ'ר
      1. לחץ על לחצן הניקוי במסך המגע הראשי של המכשיר, ונקה את כל המזרקים במים בעלי טוהר גבוה בהתאם להוראות שעל המסך. בעת הכנסת פס הבולם למכונה, ודא שהקצוות נפגשים במצב "השעה 9" (ישירות משמאל למרכז).
      2. חבר את התקן ה- USB עם הפעלות שהוגדרו בשלב 3.3.3, וטען את קבצי ההפעלה שהוגדרו בשלב 3.3.3.
        הערה: יש לשמור את קבצי ההפעלה מחוץ לכל ספריה או תיקיה ב- USB, אחרת המחשב אינו יכול לקרוא אותם.
      3. בצע את ההוראות שעל המכשיר כדי לטעון ולהפעיל את הריאגנטים כנדרש לתוך המזרקים המתאימים במכשיר.
    5. הכנת דיסק לדוגמה והשקת בדיקה
      1. אפשרו לחרוזים המגנטיים המצופים בסטרפטווידין להתאזן לטמפרטורת החדר.
        הערה: חרוזים אלה יאפשרו למכשיר ללכוד את גדיל הביוטינילציה משלב ה-PCR שלפני ההגברה. יש לרכוש אותם בנפרד מהערכה.
      2. טען 3 μL של חרוזים לתוך הבארות שהוגדרו בקובץ ההפעלה משלב 3.3.3.
      3. טען 10 μL של כל תגובת PCR כדי להיות רצף לתוך הדגימה המתאימה, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את הדגימה עם חרוזים מגנטיים. הימנעו מבועות במידת האפשר.
      4. חפש את האינדיקציה בפירורצף הראשוני שניתן לטעון את הדיסק למכונה. פתחו את הברגת הצלחת המחזיקה את האגוז לפני יישור צלחת הדגימה הטעונה עם פין המתכת בתא הדיסק.
      5. לאחר הברגת הצלחת בחוזקה לתא הצלחת, הפעל את ריצת הרצף על ידי לחיצה על לחצן ההפעלה בממשק מסך המגע.

4. רכישת תוצאות

  1. לאחר השלמת ההפעלה, הסר את כונן ה- USB מהמכשיר וחבר אותו בחזרה למחשב שבו פועלת תוכנת הפירורצף. תוך כדי ביצוע השלבים הבאים, המשך בניקוי הפירורצ'ר בהתאם להנחיות אם זו הריצה הסופית של היום.
  2. המתן עד שקובץ ההפעלה החדש שנוצר יופיע בכונן ה- USB ולחץ פעמיים על קובץ תוצאת ההפעלה. זה מנתח באופן אוטומטי את פלט הלוציפראז של כל באר עם שילוב הנוקלאוטידים ומכמת את האלל המיטוכונדריאלי של העניין שהוגדר במהלך תצורת הבדיקה בסעיף 3.1.
  3. חפש את ציוני הצבעים הבאים המוצגים על-ידי התוכנה בהתבסס על איכות הקריאות. כחול מציין ריצה אופטימלית, צהוב ריצה עם אזהרה, ואדום ריצה כושלת. כדי לשמור את התוצאות, בחר דוחות בחלון העליון | דו"ח מלא ליצירת קובץ .pdf המכיל את הפירוגרמות והתוצאות מכל באר של הריצה. לחלופין, הורד את התוצאות בפורמטים אחרים תחת הכרטיסיה דוחות .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חלק זה מציג דוגמה לאופטימיזציה של בדיקת pyrosequencing עבור מוטציה פתוגנית mtDNA אנושית, כמו גם נתוני ריצוף מהגנוטיפ של פיברובלסטים עובריים הטרופלזמיים (m.5024C>T) של עכברים (MEFs) המטופלים בנוקלאזות אצבע אבץ מיטוכונדריאליות (mtZFN). אופטימיזציה של הבדיקה עבור תאים אנושיים והשוואת שתי בדיקות שונות מדגימה כיצד לבחור את המדויק ביותר, בעוד שגנוטיפ של תאי MEF מהונדסים גנטית בדוגמה השנייה משמש דוגמה יישומית לזיהוי שינויים בהטרופלזמה לאחר התערבות בטיפול גנטי.

מוטציה אנושית m.3243A>G
דוגמה זו מדגימה את הגנוטיפ של גרסה פתוגנית נפוצה של mtDNA-m.3243A>G. המוטציה הנפוצה m.3243A>G עומדת בבסיס מספר מחלות קליניות, בעיקר אנצפלופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית ואפיזודות דמויות שבץ (MELAS), חירשות תורשתית אימהית וסוכרת (MIDD), ואופטלמופלגיה חיצונית מתקדמת (PEO)23. בדיקה זו יכולה לשמש גם לגנוטיפ של גרסה24 m.3243A>T פחות נפוצה על ידי תכנות מחדש של רצף הנוקלאוטידים שישולבו, כמתואר בסעיף 3.1.3 של הפרוטוקול.

בהתאם להנחיות למיטוב פריימר בסעיף 1, נבחרו ערכות הפריימר הבאות, אחת לכל גדיל:

מבחן 1:

פורוורד: 5' - [ביוטין] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
הפוך: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
רצף: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'

גודל אמפליקון: 215 bp

מבחן 2:

פורוורד: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
הפוך: 5' - [ביוטין] GTTGGCCATGGGTGTTGTT- 3'
רצף: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'

גודל אמפליקון: 182 bp

כדי לקבוע את תנאי המחזור התרמי עבור הבדיקה, PCR שיפוע תרמי באמצעות פולימראז התחלה חמה (ראה טבלת החומרים) בוצע ונותח תחילה על ידי אלקטרופורזה, לאחר סעיף 2. ארבעים מחזורים שימשו להגברה של כ-10 ננוגרם של דנ"א כתבנית התחלתית. בעקבות השלבים לפי סעיף 2.3 בפרוטוקול, בוצעה אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז כדי לאמת את הספציפיות של פרוטוקול ההגברה בטמפרטורת חישול נתונה (איור 2A). ניתן היה לצפות בלהקות מוצלחות בגדלים הנכונים (215 bp או 182 bp) בכל הטמפרטורות; עם זאת, טמפרטורות החישול הנמוכות יותר בבדיקה 1 הביאו להגברה מחוץ למטרה. טמפרטורת החישול המתאימה לקדם-הגברה נקבעה כ-70 מעלות צלזיוס (איור 2A). כדי לוודא את הדיוק של שתי הבדיקות ולבחור את הטוב ביותר, התקנים המולריים של אחוז m.3243A>G ידועים נוצרו על ידי ערבוב נפחים מתאימים של מוצר PCR טהור ביחסים שונים: 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% ו- 100% של m.3243A>G, בהתאמה (איור 2B, קו מקווקו). כאשר ביצענו את שתי הבדיקות על הסטנדרטים, ראינו מתאם גבוה יותר עם התוצאה הצפויה בבדיקה 2 (איור 2B). לאחר מכן השתמשנו בשתי הבדיקות על תאי ציבריד m.3243A>G בניסוי גנוטיפ, וצפינו בהטיה בולטת בבדיקה 1, במיוחד ליד תנאים הומופלסמיים (איור 2C).

מוטציה Murine m.5024C>T
דוגמה זו כוללת תאי MEF שטופלו ב- mtZFN שפותחו כדי להפחית את רמת המוטציה m.5024C>T12 כדוגמה לניסוי ריפוי גנטי מיטוכונדריאלי שבו גנוטיפ על ידי ריצוף פירוזי שימושי כהשוואה כמותית בין דגימות. תאי MEF נגזרים ממודל עכבר שפורסם המכיל מוטציית C>T במיקום 5,024 ב- mtDNA של העכבר (m.5024C>T)25. הניסוי כלל אלקטרופורציה של MEFs עם פלסמידים המקודדים mtZFN וכתבים פלואורסצנטיים שונים, ולאחר מכן מיון התאים המבטאים את הפלסמידים על ידי FACS לאחר 24 שעות. התאים הורשו להתאושש במשך שבועיים לפני השוואת הטרופלזמה על ידי pyrosequencing.

ערכת הפריימר ששימשה לריצוף מיקום m.5024C>T הייתה כדלקמן:

פורוורד: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
הפוך: 5' - [ביוטין] GCAAATTCGAAGGTAGAGAAA - 3'
רצף: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'

גודל אמפליקון: 267 bp

הדגימות רוצפו בשלשה טכנית כדי להגביר את נאמנות התוצאות. הניסוי בוצע גם בכפילות ביולוגית, וכך הפיק שישה ערכים נפרדים לכל אחד מהתנאים (איור 3B). הנתונים מ-2 מתוך 18 הפירוגרמות שימשו לבניית איור 3B; הפירוגרמות האלה מוצגות באיור 3A.

Figure 1
איור 1: סכמות המייצגות רצפים מיטוכונדריאליים בתא וקווי המתאר הטכניים הכלליים של ריצוף פירוז . (A) ייצוג סכמטי של הדנ"א המיטוכונדריאלי והרצפים המיטוכונדריאליים הגרעיניים. האיור מייצג את המקור האבולוציוני של רצפי הומולוגיה גבוהה. (B) ייצוג סכמטי של צינור בדיקת pyrosequencing עם רצף דוגמה סופי המתאר ערך הטרופלזמה C>G בקירוב של 50%. הדנ"א של התבנית מוגבר תחילה על ידי פריימרים נבחרים להגברה, שאחד מהם הוא ביוטינילציה בקצה ה-5 אינץ'. לאחר ההגברה, הפירורצף שומר על גדיל יחיד של DNA כתבנית לריצוף באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטווידין, המוצגים בכחול. לבסוף, פריימר ריצוף מאפשר ריצוף על ידי סינתזה של סדרה מוגדרת מראש של נוקלאוטידים, יצירת פירוגרמה המיוצגת באופן סכמטי. הסטויכיומטריה של כל בסיס מתקבלת בקלות על ידי השוואת גובה השיא היחסי בכל אירוע התאגדות: אותו נוקלאוטיד פעמיים ברציפות ייצור שיא כפול בהשוואה לבסיס יחיד. הקו הנטוי ברצף שיש לנתח מציין את SNP היפותטי, אשר יכול להיות "C" או "G". שימו לב לחלוקה הראשונית של בסיס "G" מדומה על ציר ה-x של הפירוגרמה, המבוצעת בדרך כלל על ידי הפירורצף כבקרה שלילית. קיצורים: mtDNA = DNA מיטוכונדריאלי; NUMTs = רצפים מיטוכונדריאליים גרעיניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אופטימיזציה של ערכת הפריימר pyrosequencing כפי שהיא מודגמת על מוטציית m.3242A>G אנושית. (A) אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (2% w/v) של הגברה PCR באמצעות פריימרים להגברה משתי הקבוצות שנבחרו עבור מוטציית m.3242A>G. WT מציין DNA בקרה מסוג פרא, ואילו Het הוא דגימת m.3243A>G כמעט הומופלסמית שיש לנתח. הטמפרטורות הן טמפרטורת החישול המשמשת בתגובת PCR של 40 מחזורים. (B). השוואה של הביצועים של שתי ערכות הפריימר באמצעות תקנים מולאריים לכיול, שהתקבלו על ידי ערבוב יחסים שונים של מוצר מוטנטי טהור מסוג בר ומוטנטי טהור m3243A>G. הערכים הנמדדים מסומנים בקווים האנכיים המקווקוים. פונקציה ליניארית X = Y מוצגת כדי להמחיש עד כמה כל אחת משתי הבדיקות שנבדקו קרובה למדידה אידיאלית. שמות קווי התאים על ציר ה-x הם שמותיהם של שיבוטים שונים של ציברידים שעברו גנוטיפ באמצעות בדיקה זו. (C) תוצאות גנוטיפ על ארבעה שיבוטים ציברידים של הטרופלזמה לא ידועה m.3243A>G באמצעות שתי הבדיקות. הרצף בוצע בשלשה טכנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מדידת הטרופלזמה ב-MEFs m.5024C>T ממוינים ב-FAS שטופלו בטכנולוגיית עריכת גנים mtZFN. (A) פירוגרמות משני שכפול PCR של דגימות תאי MEF ששימשו ליצירת איור 3B, כמו גם בקרת גנוטיפ מסוג פרא. ערכי ההארה על ציר Y הם A.U. (B) תוצאות גנוטיפ של תאים שטופלו ב- mtZFN יחד עם בקרות לא מטופלות ומטופלות מדומה. ה-MEFs חושמלו בפלסמידים המקודדים mtZFN וכתבים פלואורסצנטיים שונים ולאחר מכן מוינו על ידי FACS לאחר 24 שעות. התאים הורשו להתאושש במשך שבועיים לפני השוואת הטרופלזמה על ידי pyrosequencing. פסי השגיאה חושבו באמצעות כפילויות ביולוגיות, שכל אחת מהן עברה ריצוף פירוס בשלשה טכנית. קיצורים: FACS = מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות; MEFs = פיברובלסטים עובריים של עכברים; mtZFN = נוקלאז אצבע אבץ מיטוכונדריאלי; A.U. = יחידות שרירותיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היבט קריטי להצלחת הפרוטוקול הוא הימנעות מזיהום, במיוחד בעת שימוש בכמויות נמוכות של חומר מוצא. מומלץ להשתמש בקולט אדים UV וקצוות פיפטה מסוננים בעת הכנת הדגימות במידת האפשר, כמו גם לשמור על הפרדה בין אזורי טרום הגברה ופוסט-הגברה. מדידות ריקות ודגימות של הטרופלזמה ידועה (כגון דנ"א מסוג פרא) צריכות תמיד להיכלל כדי שישמשו כאמות מידה לבדיקת הטיות טכניות או ביולוגיות.

הטיה טכנית ראויה לציון הטבועה בבדיקה היא האות הזוהר המוגבר המיוצר על ידי שילוב אנלוגי אדנין. כאשר משתמשים באדנין במיקום משתנה, לעתים קרובות הוא מייצר שיא פלואורסצנטי שיורי (לדוגמה, איור 2C). מסיבה זו מומלץ להריץ בדיקות pyrosequencing על גדיל נגדי (שבו תימין ישולב), כאשר ניתן למנוע את הצורך לשלב את אנלוגי אדנין במיקום משתנה. עם זאת, במקרה של מוטציות A>T או T>A, זה בלתי אפשרי. עם זאת, כפי שניתן לראות בתוצאות המייצגות, בחירה נכונה של פריימרים יכולה להיות בעלת חשיבות רבה יותר בעת תכנון בדיקה. בדיקה 2 עבור מוטציית m.3243A>G, בחלק הראשון של התוצאות המייצגות, רצפים המבוססים על יחס A/G במיקום המשתנה בניגוד למבחן 1, המודד את יחס T/C. למרות היותו רגיש להטיית שילוב אדנין, בדיקה 2 מספקת תוצאות מדויקות יותר בהתבסס על ההשוואה עם התקנים המולריים, כפי שמוצג על-ידי ניתוח רגרסיה ליניארית פשוטה (איור 2B).

הטיות הן בעיקר תוצאה של הגברה משותפת של NUMT3. מספר העתק המיטוכונדריה הגדול מונע בדרך כלל מרצפים גרעיניים מחוץ למטרה להציג הטיה משמעותית; עם זאת, אזורים מסוימים של mtDNA קיימים ב- NUMTS רבים ויש להימנע מהם באמצעות השיטות המסומנות בפרוטוקול תחת סעיף 1.

כאשר נוקטים באמצעי הזהירות הנ"ל, שיטה זו היא אמצעי מודולרי, מהיר וחסכוני ביותר לגנוטיפ SNPs ב- mtDNA. עם זאת, השיטה אינה מתאימה לכל יישומי הגנוטיפ המיטוכונדריאלי, ובמיוחד למחיקות בקנה מידה גדול שעבורן מומלץ PCR טיפתי דיגיטלי26. שונות בחלוקת ריאגנטים על ידי הרצף או תנאי פריימרים/הגברה שונים יכולה להוביל להטיות קטנות. מסיבה זו מומלץ בדרך כלל טריפליקטים טכניים כדי לאשר את אמיתות תוצאות הגנוטיפ. מגבלה נוספת של הגישה היא ההיקף, שכן רק טווחים קצרים ומוגדרים מראש של mtDNA ניתנים לגנוטיפ. בעוד שניתן לתכנת פירורצפים לרצף מאות זוגות בסיסים של רצף לא ידוע, זה הופך במהירות לפחות חסכוני מאשר שימוש בגישת NGS. חוקרים יכלו בתחילה ליישם את ריצוף הפירוז כשיטת גנוטיפ מהירה המניבה תשובה כמותית מדויקת, אך לאחר מכן יכלו לנתח דגימות נבחרות על ידי NGS לדיוק נוסף ולהקשר.

לסיכום, שיטה מבוססת זו נותרה מרכיב מרכזי במחקר הגנטי של המיטוכונדריה, ומספקת גישה מהירה ופשוטה למדידות הטרופלזמה כמותיות שהן המפתח בהקשרים מחקריים רבים בתחום, כגון אבחון חולים, ריפוי גנטי או גנוטיפ של מודלים של בעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מ.מ. הוא מייסד שותף, בעל מניות וחבר במועצה המדעית המייעצת של Pretzel Therapeutics, Inc. P.S.-P. ו- P.A.N. מספקים שירותי ייעוץ עבור Pretzel Therapeutics, Inc. .

Acknowledgments

ברצוננו להודות לסילביה מרקט וקונסטנזה למפרטי (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milan) על ההכנה והאספקה של תאי הציבריד m.3243A>G המשמשים כדוגמאות להמחשה עבור פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לחברי הקבוצה לגנטיקה מיטוכונדריאלית (MRC-MBU, אוניברסיטת קיימברידג') על דיון שימושי במהלך מחקר זה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ליבה של המועצה למחקר רפואי בבריטניה (MC_UU_00015/4 ו- MC_UU_00028/3). פ.א.נ. ופ.ס.-פ. נתמכים בנוסף על ידי קרן לילי וקרן צ'אמפ, בהתאמה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD Hot Start DNA Polymerase Sigma-Aldrich 71086
PyroMark Assay Design 2.0 QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips  QIAGEN 974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) QIAGEN 974022
Pyromark Q48 Autoprep  QIAGEN 9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set QIAGEN 9024321
Pyromark Q48 Disks QIAGEN 974901
Pyromark Q48 Magnetic beads  QIAGEN 974203
PyroMark Q48 Software License (1) QIAGEN 9024325

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
  2. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
  3. Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
  4. Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
  5. Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
  6. Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
  7. Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
  8. Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
  9. Cho, S. -I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
  10. Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
  11. Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
  12. Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
  13. Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
  14. Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
  15. Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
  16. Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
  17. Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
  18. El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
  19. Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
  20. Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
  21. Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
  22. Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
  23. Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
  24. Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
  25. Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
  26. Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).

Tags

פסילה גיליון 192
גנוטיפ פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים בגנום המיטוכונדריאלי על ידי Pyrosequencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nash, P. A., Silva-Pinheiro, P.,… More

Nash, P. A., Silva-Pinheiro, P., Minczuk, M. A. Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing. J. Vis. Exp. (192), e64361, doi:10.3791/64361 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter