Summary
I saggi di pirosequenziamento consentono la genotipizzazione robusta e rapida dei polimorfismi a singolo nucleotide del DNA mitocondriale in cellule o tessuti eteroplasmatici.
Abstract
Le mutazioni nel genoma mitocondriale (mtDNA) sono state associate a malattie genetiche ereditarie materne. Tuttavia, l'interesse per i polimorfismi del mtDNA è aumentato negli ultimi anni a causa della capacità recentemente sviluppata di produrre modelli mediante mutagenesi del mtDNA e di un nuovo apprezzamento dell'associazione tra aberrazioni genetiche mitocondriali e malattie comuni legate all'età come cancro, diabete e demenza. Il pirosequenziamento è una tecnica di sequenziamento per sintesi ampiamente impiegata in tutto il campo mitocondriale per esperimenti di genotipizzazione di routine. La sua relativa convenienza rispetto ai metodi di sequenziamento parallelo massiccio e la facilità di implementazione ne fanno una tecnica inestimabile nel campo della genetica mitocondriale, consentendo la rapida quantificazione dell'eteroplasmia con maggiore flessibilità. Nonostante la praticità di questo metodo, la sua implementazione come mezzo di genotipizzazione del mtDNA richiede l'osservanza di alcune linee guida, in particolare per evitare determinati pregiudizi di origine biologica o tecnica. Questo protocollo delinea i passaggi e le precauzioni necessarie nella progettazione e nell'implementazione di saggi di pirosequenziamento da utilizzare nel contesto della misurazione dell'eteroplasmia.
Introduction
Il genoma mitocondriale esiste sotto forma di piccole (16,5 kb) molecole circolari (mtDNA) presenti nel compartimento più interno dei mitocondri chiamato matrice e codifica 13 subunità della catena respiratoria mitocondriale, nonché i tRNA e gli rRNA necessari per la loro traduzione in situ dal ribosoma mitocondriale1. Questo genoma rappresenta circa l'1% di tutte le proteine necessarie per la funzione mitocondriale, il resto delle quali sono codificate dal DNA nucleare (nDNA). Si presume comunemente che i mitocondri derivino da un evento di fusione endosimbiotica tra un antenato alfa-proteobatterico e una cellula eucariotica ancestrale. Una volta avvenuta questa ipotetica simbiosi, l'informazione genetica dei mitocondri è stata gradualmente trasferita al nucleo nel corso di eoni, il che spiega la suddetta compattezza del mtDNA rispetto ai genomi dei moderni cianobatteri2. Tale trasferimento di geni è fortemente evidenziato dall'esistenza di lunghi tratti di nDNA che sono altamente omologhi alle sequenze trovate nel mtDNA. Queste sequenze mitocondriali nucleari (NUMT) sono una fonte comune di interpretazione errata durante la genotipizzazione e devono essere prese alcune precauzioni per evitare distorsioni nucleari durante la genotipizzazione del mtDNA3 (Figura 1A).
Un'altra caratteristica distintiva del mtDNA è che il suo numero di copie varia a seconda del tipo di cellula, numerando ovunque da decine a migliaia di copie per cellula4. A causa di questa natura multi-copia, il mtDNA può ospitare una vasta gamma di genotipi all'interno di una singola cellula, il che può comportare una distribuzione più continua degli alleli in contrasto con gli alleli discreti associati ai geni nucleari quando si considera la zigosità dei cromosomi. Questa eterogeneità degli alleli mitocondriali è indicata come eteroplasmia mitocondriale, che è tipicamente espressa nella prevalenza percentuale di una data mutazione in proporzione al mtDNA totale in una data cellula. L'eteroplasmia può essere contrastata con l'omoplasia, che si riferisce a una specie unica di mtDNA presente in una cellula.
La misurazione dell'eteroplasmia mitocondriale è di particolare interesse quando si quantifica la proporzione di molecole di mtDNA che ospitano varianti patogene. Tali varianti si presentano sotto forma di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), piccoli indel, o delezioni su larga scala5. La maggior parte degli esseri umani sono eteroplasmatici per le varianti patogene; tuttavia, non presentano alcun fenotipo clinico, che spesso si manifesta solo a livelli più elevati di eteroplasmia di mtDNA patogeno in un fenomeno indicato come effetto soglia6. Mentre i valori associati alla patogenicità dipendono fortemente dalla natura della mutazione patogena e dal tessuto in cui si verifica, in genere si trovano al di sopra del 60% di eteroplasmia7.
Ci sono diverse aree di ricerca in cui la genotipizzazione mitocondriale è comune. In campo medico, il test o la quantificazione delle mutazioni del mtDNA può servire come criterio diagnostico per le malattie mitocondriali, molte delle quali hanno aberrazioni del mtDNA come origine5. Oltre allo studio delle mutazioni patogene umane, è probabile che aumenti la prevalenza di modelli animali che ospitano SNP patogeni nel mtDNA, dato il recente avvento dell'editing della base mitocondriale abilitato dagli editor di base citosina derivati da DddA mitocondriali (DdCBE)8 e dalle deaminasi a base di TALE (TALEDs) per l'editing della base adenina9. Questo approccio sarà strumentale per comprendere l'interazione tra genotipi mitocondriali aberranti e le disfunzioni risultanti. C'è anche una ricerca scientifica in corso sul rimodellamento del genoma mitocondriale per l'uso finale come strategia terapeutica nelle malattie mitocondriali umane attraverso un approccio noto come spostamento dell'eteroplasmia. Questo campo di ricerca riguarda principalmente l'indirizzamento di nucleasi specifiche per mutazione alla matrice mitocondriale; ciò si traduce nella degradazione preferenziale del mtDNA patogeno, portando a salvataggi nel fenotipo10,11,12,13. Qualsiasi esperimento che coinvolga il rimodellamento del genotipo mitocondriale richiede un robusto metodo quantitativo per valutare i cambiamenti dell'eteroplasmia.
Un'ampia varietà di metodi sono usati per genotipizzare il mtDNA, e questi variano a seconda della natura della mutazione. I metodi di sequenziamento di nuova generazione (NGS) sono più precisi quando si tratta di quantificare gli SNP nel mtDNA; Tuttavia, questi metodi rimangono proibitivamente costosi per la quantificazione di routine dell'eteroplasmia mitocondriale, in particolare se il numero di campioni è piccolo. Il sequenziamento con metodo Sanger può anche consentire il rilevamento di SNP; Tuttavia, questo approccio non è quantitativo e spesso non riesce a rilevare bassi livelli di eteroplasmia o può essere impreciso quando si stimano eteroplasmie elevate. Il pirosequenziamento, come saggio che comporta una preparazione minima e consente la rapida quantificazione dell'eteroplasmia per qualsiasi campione di mtDNA, si propone come un compromesso appropriato tra questi due estremi. Questo metodo è stato utilizzato di routine per quantificare SNP mitocondriali da numerosi ricercatori in vari contesti, tra cui l'analisi forense 14,15, la diagnosi clinica16 o la genotipizzazione del mtDNA da singole cellule17.
Questo test prevede una prima fase di preamplificazione della PCR di una regione che fiancheggia l'SNP nel mtDNA, seguita da un test di sequenziamento per sintesi utilizzando un filamento dell'amplicone precedentemente generato. Uno dei due primer utilizzati nella fase di preamplificazione deve essere biotinilato all'estremità 5', il che consentirà all'apparato di pirosequenziamento di isolare il singolo filamento di DNA da utilizzare come modello per la reazione di sequenziamento. Un terzo primer di sequenziamento viene quindi ricotto sul filamento biotinilato trattenuto, che consente di distribuire la sintesi del DNA nascente come desossinucleotidi in un ordine predefinito nella camera di reazione. Il pirosequenziatore registra la quantità di ciascuna base incorporata sulla base di una lettura luminescente, consentendo la quantificazione relativa degli alleli mitocondriali mutanti e wild-type sulla sintesi del DNA (Figura 1B). La luminescenza è generata da un enzima luciferasi, che emette luce in presenza di ATP che una ATP solforilasi sintetizza de novo ad ogni evento di incorporazione dai pirofosfati rilasciati da ciascun nucleotide. Queste due reazioni possono essere riassunte come segue:
1. PPi (dall'incorporazione nucleotidica) + APS → ATP + solfato (ATP sulfurilasi)
2. ATP + luciferina + O 2 → AMP + PPi + ossiluciferina + CO2 + luce (luciferasi)
Rilevare le basi di adenina dal pirosequenziatore senza che l'ATP reagisca in modo incrociato con la luciferasi nella seconda reazione è una sfida. Tuttavia, questo è risolto utilizzando un analogo dell'adenina per la sintesi del DNA, vale a dire dATPαS. Nonostante non sia un substrato perfetto per la luciferasi, produce una luminescenza più forte rispetto agli altri tre nucleotidi, che viene regolata digitalmente dal pirosequenziatore e impostata su un fattore di 0,9. A causa di questa variabilità intrinseca, si suggerisce di evitare il sequenziamento dell'adenina nella posizione SNP (vedere la discussione per ulteriori dettagli).
Il seguente protocollo descrive in dettaglio il metodo di valutazione dell'eteroplasmia del mtDNA mediante pirosequenziamento e delinea le precauzioni necessarie nella progettazione dei primer di amplificazione per evitare pregiudizi biologici o tecnici durante la genotipizzazione degli SNP nel mtDNA. Quest'ultimo comporta il rilevamento digitale e la selezione dei set di primer, l'ottimizzazione della PCR di preamplificazione e, infine, il sequenziamento e il perfezionamento del test. Vengono dimostrati due saggi di esempio applicati: in primo luogo, l'ottimizzazione della più comune variante patogena umana m.3243A>G18 e, in secondo luogo, la genotipizzazione di cellule di fibroblasti embrionali di topo (MEF) che hanno subito lo spostamento dell'eteroplasmia utilizzando tecnologie sviluppate presso il laboratorio Minczuk di Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.
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Protocol
È stato fornito il consenso informato per l'uso delle cellule cibridi umane 3243A>G e dei MEF m.5024C>T immortalizzati utilizzati in questo studio. L'approvazione etica non era richiesta in questo caso poiché le cellule del paziente non sono state raccolte presso l'Università di Cambridge. L'uso di fibroblasti umani può, tuttavia, richiedere l'approvazione etica. Si raccomanda vivamente di seguire le migliori pratiche per la configurazione della PCR durante la preparazione del DNA campione per il pirosequenziamento. L'amplificazione frequente con primer identici può portare alla contaminazione da ampliconi e introdurre distorsioni alla successiva genotipizzazione se non si osserva una rigorosa separazione tra le aree pre-PCR e post-PCR. La pipeline qui presentata utilizza attrezzature specifiche di un unico produttore; i dettagli possono essere trovati nella Tabella dei materiali. Il design del primer per la PCR può essere eseguito manualmente se lo si desidera; tuttavia, si consiglia di utilizzare il software esistente per questo scopo (vedere la tabella dei materiali).
1. Progettazione del primer pirosequenziale e selezione del saggio
- Ottenere candidati di base con il software
- Ottenere un file di sequenza del mtDNA per la specie da genotipare e identificare la posizione dell'SNP. Assicurarsi che la sequenza di riferimento utilizzata utilizzi la numerazione di base appropriata per la mutazione studiata in modo che la posizione dell'SNP possa essere facilmente identificata.
- Copiare 1.000 coppie di basi a monte e a valle del sito SNP e incollare la sequenza troncata nel software destinato alla progettazione del primer di pirosequenziamento (vedere la tabella dei materiali).
- Impostare la base SNP analizzata come destinazione del saggio di pirosequenziamento nel software evidenziando la base polimorfica e facendo clic con il pulsante destro del mouse e quindi selezionando la regione target impostata.
- Premi l'icona di riproduzione nell'angolo in alto a destra dell'interfaccia per avviare la selezione di primer.
- Attendi che il software generi automaticamente trii di primer: due primer per la preamplificazione del DNA del modello e un terzo primer per il sequenziamento per sintesi nella macchina di pirosequenziamento. Conservare tutti i set di primer facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando copia tutti i set di primer.
- Selezione dei set di primer ottimali dall'elenco generato
- Mantieni i set di primer con il punteggio di qualità più alto in base all'output del software, che fornisce set di primer in ordine decrescente in base al punteggio di qualità. Se possibile, omettere i set di primer con un punteggio inferiore a 80.
- Per i set di primer conservati, identificare e copiare l'amplicone prodotto dai primer di amplificazione.
- Allineare gli ampliconi prodotti con l'intero genoma dell'organismo da genotipizzare utilizzando NCBI Blast utilizzando il portale di presentazione online all'https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Dai menu a discesa durante l'invio, selezionare quanto segue:
- Seleziona database | Database genomici + trascrizioni.
- Selezionare Umano o Mouse nel menu a discesa, a seconda dell'SNP analizzato.
- Seleziona Ottimizza per | Sequenze in qualche modo simili (Blastn).
- (Facoltativo) Se si genotipa un organismo diverso da un topo o da un essere umano, selezionare quanto segue durante l'invio:
- Seleziona database | Database standard.
- Seleziona i genomi rappresentativi di RefSeq nel menu a discesa
- Seleziona Ottimizza per | Sequenze in qualche modo simili (Blastn)
- Quando possibile, omettere tutti gli ampliconi che hanno una perfetta omologia con l'amplicone del mtDNA, in particolare se le regioni di legame del primer sono perfettamente omologhe (vedi la discussione).
NOTA: Lo strumento di allineamento BLAST restituirà qualsiasi sequenza con notevole omologia agli ampliconi di pre-amplificazione. Ciò consente la rilevazione dei NUMT descritti nell'introduzione, che se non presi in considerazione, possono indurre un pregiudizio in quanto sono co-amplificati con il DNA mitocondriale. - Ordina gli oligo ottenuti tramite questa pipeline. Assicurarsi che la modifica della biotina 5' venga aggiunta al primer di amplificazione corretto durante l'ordine di sintesi, in modo tale che il primer di sequenziamento sia complementare al filamento biotinilato.
NOTA: La scelta del primer sequenziale è più flessibile rispetto ai primer di amplificazione e si consiglia di avere almeno una base che separi l'estremità 3' del primer di sequenziamento e la posizione variabile.
2. Ottimizzazione della PCR di preamplificazione
- Preparare i campioni di DNA estraendo il DNA genomico totale utilizzando un metodo appropriato.
NOTA: Questo dipenderà in gran parte dal numero di cellule da genotipizzare e dalla loro origine. Se si isola il DNA da singole cellule utilizzando un tampone di lisi contenente proteinasi K, il campione deve essere denaturato a 95 °C per 10 minuti in modo da non interrompere la polimerasi durante la successiva PCR. - Configurazione PCR e impostazioni del blocco termico
- Impostare la PCR con una polimerasi ad alta fedeltà di scelta. Prepara un Master Mix per quattro reazioni. Poiché sono necessari solo 10 μL di reazione PCR per una corsa di pirosequenziamento, preparare 25 μL di reazioni PCR (per consentire una ripetizione tecnica se necessario). Utilizzare 40 cicli di PCR con circa 10 ng di DNA genomico come materiale di partenza con 1 μM di entrambi i primer avanti e indietro.
- Impostare il tempo di estensione in base alle specifiche del produttore per la polimerasi utilizzata, tenendo conto della lunghezza dei primer di preamplificazione scelti.
- Utilizzare un termociclatore con impostazioni di temperatura di ricottura variabili. Poiché la temperatura di ricottura può variare a seconda della sequenza di primer, il contenuto di sale del tampone polimerasi e altri fattori, programmano quattro diverse temperature di ricottura nel programma di ciclo termico.
NOTA: l'esempio utilizzato nei risultati rappresentativi ha utilizzato le seguenti temperature: 55 °C, 60 °C, 65 °C e 70 °C. - Dividere il Master Mix in quattro tubi PCR da 200 μL e impostarli per funzionare a ciascuna delle quattro temperature di ricottura selezionate nel termociclatore per 40 cicli.
- Visualizzazione della banda di preamplificazione
- Durante l'esecuzione della PCR, preparare un gel di agarosio al 2% (p/v) in 1x TBE con SYBR Safe o bromuro di etidio come agente visualizzatore.
NOTA: Un gel con percentuale più alta è raccomandato per la visualizzazione poiché i frammenti amplificati sono solitamente brevi, in genere vanno da 100 a 500 paia di basi. - Al termine della PCR nella fase 2.2, mescolare 10 μL della reazione con una quantità appropriata di tampone di carico del DNA ed eseguire il gel di agarosio al 2% a 7 V / cm per circa 45 minuti.
- Visualizza i frammenti di DNA risultanti su un transilluminatore UV.
NOTA: Le condizioni di ciclo termico selezionate per la fase di preamplificazione devono produrre un'unica banda pulita delle dimensioni previste. Temperature di ricottura più basse possono occasionalmente provocare un'amplificazione fuori bersaglio, che può introdurre distorsioni al successivo pirosequenziamento. - Selezionare la temperatura di ricottura più bassa che produce una banda pulita della dimensione corretta per le successive amplificazioni.
- (Facoltativo) Prelevare una banda della dimensione prevista, purificare utilizzando un kit di estrazione del gel a scelta e analizzare mediante sequenziamento Sanger per confermare l'eteroplasmia approssimativa del campione come riferimento.
- Durante l'esecuzione della PCR, preparare un gel di agarosio al 2% (p/v) in 1x TBE con SYBR Safe o bromuro di etidio come agente visualizzatore.
3. Configurazione e funzionamento dello strumento
NOTA: Una volta ottimizzata la fase PCR nella sezione precedente, la fase successiva prevede la programmazione del pirosequenziatore con la sequenza nucleotidica corretta da analizzare per l'SNP specifico. Ciò comporta l'inserimento di 10 basi direttamente a valle dell'estremità 3' del primer di sequenziamento. Questo è dettagliato nella sezione seguente.
- Configurazione del saggio
- Aprire il software di esecuzione fornito con il pirosequenziatore e selezionare Nuovo saggio nell'angolo superiore sinistro dell'interfaccia.
- Selezionare il modello di analisi di quantificazione allelica .
- Inserire la Sequenza da analizzare nella casella corrispondente digitando i nucleotidi da incorporare direttamente a valle del primer di sequenziamento, che dovrebbe trovarsi a monte dell'SNP di interesse. Per la posizione variabile, indicare le due possibili basi separate da una barra (ad esempio, A/T).
- Premere Genera ordine di dispensazione e lasciare che il software determini automaticamente un ordine adatto per i nucleotidi da erogare nella reazione di sequenziamento per sintesi.
- Salvare e specificare un nome per il test.
- Preparazione e conservazione dei reagenti
- Diluire il primer di sequenziamento ordinato a 4 μM nel tampone di ricottura fornito nel kit di reagenti pirosequenziatori.
NOTA: Il primer di sequenziamento può essere prima diluito in acqua a 100 μM come soluzione madre e successivamente ulteriormente diluito in tampone di ricottura a 4 μM secondo necessità. - Preparazione e manipolazione di enzimi e substrati
- Al primo unboxing, risciogliere l'enzima liofilizzato e il substrato secondo le raccomandazioni del produttore. Conservare a -20 °C quando non in uso.
- Dopo l'uso successivo, scongelare i flaconcini dell'enzima e del substrato da -20 °C.
NOTA: Tutti gli altri reagenti nel kit fornito possono essere conservati in frigorifero a 4 °C. I primer per sequenziamento diluito possono anche essere mantenuti a 4 °C.
- Mettere la quantità richiesta di ciascun reagente su ghiaccio.
- Conservare a 4 °C i restanti componenti necessari, vale a dire le sfere magnetiche rivestite di streptavidina, le strisce assorbenti e i dischi di pirosequenziamento.
- Diluire il primer di sequenziamento ordinato a 4 μM nel tampone di ricottura fornito nel kit di reagenti pirosequenziatori.
- Esegui esecuzione
NOTA: Quando un test viene progettato per la prima volta, deve essere calibrato utilizzando prodotti PCR di eteroplasmia nota, il che garantisce che il test possa distinguere accuratamente le eteroplasmie. I ricercatori possono utilizzare miscele di prodotti PCR di eteroplasmia nota come standard. I campioni possono anche essere verificati con altri metodi menzionati nell'introduzione e nella discussione, in particolare NGS.- Diluire il DNA da analizzare a 5 ng/μL. In particolare nella prima esecuzione, assicurarsi di includere campioni di eteroplasmia nota come riferimento e / o campioni wild-type.
- Eseguire una PCR di presequenziamento di 5 μL di DNA diluito in reazioni da 25 μL utilizzando i primer di amplificazione e i parametri identificati nella sezione 1 e nella sezione 2. Eseguire repliche tecniche di PCR per ogni campione.
NOTA: La PCR di preamplificazione può essere conservata a breve termine a 4 °C o a lungo termine a -20 °C prima di procedere al sequenziamento. - Eseguire l'installazione dei file
- Seleziona Nuova corsa nell'angolo in alto a sinistra del software pirosequenziale.
- Il pirosequenziatore può sequenziare simultaneamente 48 reazioni preamplificate separate, con un quadrato vuoto che rappresenta un singolo pozzo di sequenziamento su un disco di pirosequenziamento. Caricare i saggi configurati nella sezione 3.1 facendo clic con il pulsante destro del mouse su un quadrato e selezionando il saggio di carico. Se necessario, sequenziare fino a quattro saggi separati con diversi primer di sequenziamento.
- Impostare la modalità di dispensazione del primer su Automatico per assegnare automaticamente una camera di iniezione per ciascun primer di sequenziamento utilizzato per la corsa.
- Impostare la modalità di esecuzione su Standard a meno che non si eseguano quattro diversi tipi di test su un disco di sequenziazione.
- Assicurarsi che il numero di test sul file modello di esecuzione corrisponda al numero di reazioni PCR amplificate.
NOTA: se si eseguono più di 48 campioni, sarà necessario impostare ulteriori file di esecuzione. - Salvare i file eseguiti su un'unità USB.
- Innescamento del pirosequenziatore
- Premere il pulsante Pulizia sul touch screen principale del dispositivo e pulire tutti gli iniettori con acqua ad alta purezza seguendo le istruzioni visualizzate sullo schermo. Quando si inserisce la striscia assorbente nella macchina, assicurarsi che le estremità si incontrino nella posizione "ore 9" (direttamente a sinistra del centro).
- Collegare la chiavetta USB con le corse impostate al punto 3.3.3 e caricare i file di esecuzione definiti nel punto 3.3.3.
NOTA: i file eseguiti devono essere salvati al di fuori di qualsiasi directory o cartella sull'USB o non possono essere letti dalla macchina. - Seguire le istruzioni sul dispositivo per caricare e innescare i reagenti come richiesto negli iniettori corrispondenti sulla macchina.
- Preparazione del disco campione e lancio del test
- Lasciare che le sfere magnetiche rivestite di streptavidina si equilibrino a temperatura ambiente.
NOTA: Queste perle consentiranno al dispositivo di catturare il filamento biotinilato dalla fase di preamplificazione PCR. Devono essere acquistati separatamente dal kit. - Caricare 3 μL di perline nei pozzetti definiti nel file di esecuzione dal punto 3.3.3.
- Caricare 10 μL di ciascuna reazione PCR da sequenziare nel campione corrispondente e pipettare su e giù per mescolare il campione con le sfere magnetiche. Evitare le bolle, se possibile.
- Cerca l'indicazione nel pirosequenziatore innescato che il disco può essere caricato nella macchina. Svitare il dado di fissaggio della piastra prima di allineare la piastra di campionamento caricata con il perno metallico nello scomparto del disco.
- Una volta che la piastra è saldamente avvitata nel vano della piastra, avviare la sequenza premendo il pulsante di avvio sull'interfaccia touchscreen.
- Lasciare che le sfere magnetiche rivestite di streptavidina si equilibrino a temperatura ambiente.
4. Acquisizione dei risultati
- Una volta completata l'esecuzione, rimuovere l'unità USB dalla macchina e ricollegarla al computer su cui è in esecuzione il software pirosequenziale. Mentre procedi con i seguenti passaggi, procedi con la pulizia del pirosequenziatore seguendo le istruzioni se è l'ultima corsa della giornata.
- Attendere che il file di esecuzione appena generato venga visualizzato sull'unità USB e fare doppio clic sul file dei risultati dell'esecuzione. Questo analizza automaticamente l'output della luciferasi di ciascun pozzetto al momento dell'incorporazione nucleotidica e quantifica l'allele mitocondriale di interesse definito durante la configurazione del saggio nella sezione 3.1.
- Cerca i seguenti punteggi di colore mostrati dal software in base alla qualità delle letture. Il blu indica un'esecuzione ottimale, il giallo un'esecuzione con un avviso e il rosso un'esecuzione non riuscita. Per salvare i risultati, selezionare Report nella finestra superiore | Report completo per generare un file .pdf contenente i pirogrammi e i risultati di ciascun pozzetto della corsa. In alternativa, scaricare i risultati in altri formati nella scheda Report .
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Representative Results
Questa sezione presenta un esempio di ottimizzazione di un saggio di pirosequenziamento per una mutazione patogena del mtDNA umano, nonché i dati di sequenziamento dalla genotipizzazione di fibroblasti embrionali di topo (MEF) eteroplasmatici (m.5024C>T) trattati con nucleasi mitocondriali a dita di zinco (mtZFN). L'ottimizzazione del test per le cellule umane e il confronto di due diversi saggi dimostra come selezionare quello più accurato, mentre la genotipizzazione delle cellule MEF geneticamente modificate nel secondo esempio serve come esempio applicato per rilevare i cambiamenti dell'eteroplasmia dopo l'intervento di terapia genica.
Mutazione umana m.3243A>G
Questo esempio illustra la genotipizzazione di una variante patogena comune del mtDNA-m.3243A>G. La mutazione comune di m.3243A>G è alla base di diverse malattie cliniche, in particolare l'acidosi lattica da encefalopatia mitocondriale e gli episodi simili all'ictus (MELAS), la sordità e il diabete ereditari materni (MIDD) e l'oftalmoplegia esterna progressiva (PEO)23. Questo test può anche essere utilizzato per genotipizzare la meno comune variante m.3243A>T24 riprogrammando la sequenza di nucleotidi da incorporare, come descritto nella sezione 3.1.3 del protocollo.
Seguendo le linee guida per l'ottimizzazione dei primer nella sezione 1, sono stati selezionati i seguenti set di primer, uno per entrambi i filamenti:
Saggio 1:
Avanti: 5' - [Biotina] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Retromarcia: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Sequenziamento: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'
Dimensione amplicone: 215 bp
Saggio 2:
Avanti: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Retromarcia: 5' - [Biotina] GTTGGCCATGGGTATGTTGTT- 3'
Sequenziamento: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'
Dimensione amplicone: 182 bp
Per determinare le condizioni del ciclo termico per il test, è stata prima eseguita una PCR a gradiente termico utilizzando una polimerasi Hot Start (vedere la Tabella dei materiali) e analizzata mediante elettroforesi, seguendo la sezione 2. Quaranta cicli sono stati utilizzati per amplificare circa 10 ng di DNA come modello di partenza. Seguendo i passaggi di cui alla sezione 2.3 del protocollo, è stata eseguita un'elettroforesi su gel di agarosio per verificare la specificità del protocollo di amplificazione a una data temperatura di ricottura (Figura 2A). Bande di successo delle dimensioni corrette (215 bp o 182 bp) potevano essere osservate a tutte le temperature; Tuttavia, le temperature di ricottura più basse nel saggio 1 hanno determinato un'amplificazione fuori bersaglio. La temperatura di ricottura corretta per la preamplificazione è stata stabilita a 70 °C (figura 2A). Per accertare l'accuratezza di entrambi i saggi e scegliere quello migliore, sono stati generati standard molari della percentuale nota di m.3243A>G miscelando volumi appropriati di prodotto PCR puro in vari rapporti: 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% e 100% di m.3243A>G, rispettivamente (Figura 2B, linea tratteggiata). Durante l'esecuzione di entrambi i test sugli standard, abbiamo osservato una maggiore correlazione con il risultato atteso nel saggio 2 (Figura 2B). Abbiamo quindi utilizzato entrambi i saggi su cellule cibride m.3243A>G in un esperimento di genotipizzazione e abbiamo osservato una distorsione pronunciata nel saggio 1, in particolare vicino a condizioni omoplasmatiche (Figura 2C).
Mutazione m.5024C>T murina
Questo esempio coinvolge cellule MEF trattate con mtZFN sviluppate per ridurre il livello della mutazione m.5024C>T12 come esempio di un esperimento di terapia genica mitocondriale in cui la genotipizzazione mediante pirosequenziamento è utile come confronto quantitativo tra campioni. Le cellule MEF derivano da un modello murino pubblicato che ospita una mutazione C>T in posizione 5.024 nel mtDNA del topo (m.5024C>T)25. L'esperimento ha comportato l'elettropostazione dei MEF con plasmidi codificanti mtZFN e diversi reporter fluorescenti e successivamente l'ordinamento delle cellule che esprimono i plasmidi mediante FACS dopo 24 ore. Le cellule sono state quindi lasciate recuperare per 2 settimane prima del confronto dell'eteroplasmia mediante pirosequenziamento.
Il set di primer utilizzato per sequenziare la posizione m.5024C>T era il seguente:
Avanti: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Retromarcia: 5' - [Biotina] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
Sequenziamento: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'
Dimensione amplicone: 267 bp
I campioni sono stati sequenziati in triplice copia tecnica per aumentare la fedeltà dei risultati. L'esperimento è stato eseguito anche in duplicato biologico, producendo così sei valori separati per ciascuna delle condizioni (Figura 3B). I dati di 2 dei 18 pirogrammi sono stati utilizzati per costruire la Figura 3B; questi pirogrammi sono visualizzati nella figura 3A.
Figura 1: Schemi che rappresentano le sequenze mitocondriali in una cellula e lo schema tecnico generale del pirosequenziamento. (A) Rappresentazione schematica del DNA mitocondriale e delle sequenze mitocondriali nucleari. La figura rappresenta l'origine evolutiva delle sequenze ad alta omologia. (B) Rappresentazione schematica della pipeline di saggi di pirosequenziamento con una sequenza di esempio finale raffigurante un valore di eteroplasmia C>G approssimativo del 50%. Il DNA modello viene prima amplificato da primer di amplificazione selezionati, uno dei quali è biotinilato all'estremità 5'. Dopo l'amplificazione, il pirosequenziatore conserva un singolo filamento di DNA come modello per il sequenziamento utilizzando perle magnetiche rivestite di streptavidina, mostrate in blu. Infine, un primer di sequenziamento consente il sequenziamento per sintesi di una serie predefinita di nucleotidi, generando un pirogramma che viene schematicamente rappresentato. Le stechiometrie di ciascuna base sono facilmente ottenibili confrontando le altezze relative dei picchi ad ogni evento di incorporazione: lo stesso nucleotide due volte di seguito genererà un doppio picco rispetto ad una singola base. Lo slash nella sequenza da analizzare denota l'ipotetico SNP, che potrebbe essere "C" o "G". Si noti la dispensazione iniziale di una finta base "G" sull'asse x del pirogramma, che viene tipicamente eseguita dal pirosequenziatore come controllo negativo. Abbreviazioni: mtDNA = DNA mitocondriale; NUMTs = sequenze mitocondriali nucleari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Ottimizzazione del set di primer per il pirosequenziamento come illustrato sulla mutazione umana m.3242A>G. (A) Elettroforesi su gel di agarosio (2% p/v) di un'amplificazione PCR utilizzando i primer di amplificazione di entrambi i set selezionati per la mutazione m.3242A>G. WT denota DNA di controllo wild-type, mentre Het è il campione m.3243A>G quasi omoplasmatico da analizzare. Le temperature sono la temperatura di ricottura utilizzata in una reazione PCR a 40 cicli. (B). Un confronto delle prestazioni di entrambi i set di primer utilizzando standard molari per la calibrazione, ottenuti mescolando vari rapporti di prodotto wild-type puro e mutante puro m3243A>G. I valori misurati sono indicati dalle linee tratteggiate verticali. Viene visualizzata una funzione lineare X = Y per illustrare quanto ciascuno dei due saggi testati sia vicino a una misurazione ideale. I nomi delle linee cellulari sull'asse x sono i nomi dei vari cloni di cibridi che sono stati genotipizzati usando questo test. (C) Risultati della genotipizzazione su quattro cloni di cibridi di eteroplasmia m.3243A>G sconosciuta utilizzando entrambi i saggi. Il sequenziamento è stato eseguito in triplice copia tecnica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Misurazione dell'eteroplasmia su MEF m.5024C>T ordinati FACS trattati con tecnologia di editing genetico mtZFN. (A) Pirogrammi da due repliche di campioni di cellule MEF utilizzate per generare la Figura 3B e il controllo della genotipizzazione wild-type. I valori di luminescenza sull'asse Y sono in A.U. (B) Risultati di genotipizzazione di cellule trattate con mtZFN insieme a controlli non trattati e trattati con simulazione. I MEF sono stati elettroporati con plasmidi codificanti mtZFN e diversi reporter fluorescenti e successivamente ordinati da FACS dopo 24 ore. Le cellule sono state quindi lasciate recuperare per 2 settimane prima del confronto dell'eteroplasmia mediante pirosequenziamento. Le barre di errore sono state calcolate con duplicati biologici, ognuno dei quali è stato sottoposto a pirosequenziamento in triplice triplice tecnica. Abbreviazioni: FACS = selezione cellulare attivata da fluorescenza; MEF = fibroblasti embrionali di topo; mtZFN = nucleasi mitocondriale a dita di zinco; U.A. = unità arbitrarie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Un aspetto critico per il successo del protocollo è evitare contaminazioni, in particolare quando si utilizzano basse quantità di materiale di partenza. Si consiglia di utilizzare una cappa UV e punte di pipette filtrate durante la preparazione dei campioni, ove possibile, nonché di mantenere separate le aree di preamplificazione e post-amplificazione. Le misurazioni in bianco e i campioni di eteroplasmia nota (come il DNA wild-type) dovrebbero sempre essere inclusi da utilizzare come parametri di riferimento per verificare la presenza di distorsioni tecniche o biologiche.
Un notevole pregiudizio tecnico inerente al test è l'aumento del segnale luminescente prodotto dall'incorporazione analogica dell'adenina. Quando l'adenina viene utilizzata in una posizione variabile, spesso produce un picco fluorescente residuo (ad esempio, Figura 2C). È per questo motivo che si consiglia di eseguire saggi di pirosequenziamento sul filamento opposto (dove verrà incorporata una timina), quando possibile per evitare di dover incorporare l'analogo dell'adenina nella posizione variabile. Tuttavia, nel caso di mutazioni A>T o T>A, questo è impossibile. Tuttavia, come evidenziato nei risultati rappresentativi, una scelta appropriata di primer può essere di maggiore importanza quando si progetta un test. Saggio 2 per la mutazione m.3243A>G, nella prima sezione dei risultati rappresentativi, sequenze basate sul rapporto A/G in posizione variabile rispetto al saggio 1, che misura il rapporto T/C. Nonostante sia suscettibile al bias di incorporazione dell'adenina, il saggio 2 fornisce risultati più accurati basati sul confronto con gli standard molari, come mostrato da una semplice analisi di regressione lineare (Figura 2B).
I pregiudizi sono principalmente il risultato della co-amplificazione NUMT3. Il grande numero di copie mitocondriali tipicamente impedisce alle sequenze nucleari fuori bersaglio di introdurre qualsiasi distorsione significativa; tuttavia, alcune regioni del mtDNA sono presenti in molti NUMTS e dovrebbero essere evitate usando i metodi indicati nel protocollo di cui alla sezione 1.
Quando si prendono le precauzioni di cui sopra, questo metodo è un mezzo altamente modulare, rapido ed economico per genotipizzare gli SNP nel mtDNA. Tuttavia, il metodo non è adatto per tutte le applicazioni di genotipizzazione mitocondriale, in particolare le delezioni su larga scala per le quali è raccomandata la PCR digitale a goccia26. La variabilità nella dispensazione dei reagenti da parte del sequenziatore o diverse condizioni di primer/amplificazione possono portare all'introduzione di piccole distorsioni. È per questo motivo che i triplicati tecnici sono solitamente raccomandati per confermare la veridicità dei risultati della genotipizzazione. Un'altra limitazione dell'approccio è l'ambito, poiché solo brevi intervalli predefiniti di mtDNA possono essere genotipizzati. Mentre i pirosequenziatori possono essere programmati per sequenziare centinaia di coppie di basi di sequenza sconosciuta, questo diventa rapidamente meno conveniente rispetto all'utilizzo di un approccio NGS. I ricercatori potrebbero inizialmente implementare il pirosequenziamento come metodo di genotipizzazione rapida che produce una risposta quantitativa precisa, ma potrebbero successivamente analizzare campioni scelti da NGS per ulteriore precisione e contesto.
In conclusione, questo metodo ben consolidato rimane un punto fermo nella ricerca genetica mitocondriale, fornendo un accesso rapido e semplice alle misurazioni quantitative dell'eteroplasmia che sono fondamentali in molti contesti di ricerca nel campo, come la diagnosi del paziente, la terapia genica o la genotipizzazione di modelli animali.
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Disclosures
M.M. è co-fondatore, azionista e membro del comitato consultivo scientifico di Pretzel Therapeutics, Inc. e P.A.N. forniscono servizi di consulenza per Pretzel Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Si ringraziano Silvia Marchet e Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milano) per aver preparato e fornito le cellule cibride m.3243A>G utilizzate come esempi illustrativi per questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare i membri del Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, Università di Cambridge) per l'utile discussione nel corso di questa ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti di base del Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 e MC_UU_00028/3). P.A.N. e P.S.-P. sono inoltre supportati rispettivamente da The Lily Foundation e The Champ Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
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