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Génotypage de polymorphismes mononucléotidiques dans le génome mitochondrial par pyroséquençage

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64361
Automatic Translation
1, 1, 1
1Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus

Summary

Les tests de pyroséquençage permettent le génotypage robuste et rapide des polymorphismes mononucléotidiques de l’ADN mitochondrial dans des cellules ou des tissus hétéroplasmiques.

Abstract

Des mutations dans le génome mitochondrial (ADNmt) ont été associées à des maladies génétiques héréditaires de la mère. Cependant, l’intérêt pour les polymorphismes de l’ADNmt a augmenté ces dernières années en raison de la capacité récemment développée de produire des modèles par mutagénèse de l’ADNmt et d’une nouvelle appréciation de l’association entre les aberrations génétiques mitochondriales et les maladies courantes liées à l’âge telles que le cancer, le diabète et la démence. Le pyroséquençage est une technique de séquençage par synthèse largement utilisée dans le domaine mitochondrial pour les expériences de génotypage de routine. Son prix relativement abordable par rapport aux méthodes de séquençage parallèle massif et sa facilité de mise en œuvre en font une technique inestimable dans le domaine de la génétique mitochondriale, permettant la quantification rapide de l’hétéroplasmie avec une flexibilité accrue. Malgré l’aspect pratique de cette méthode, sa mise en œuvre en tant que moyen de génotypage de l’ADNmt nécessite le respect de certaines lignes directrices, notamment pour éviter certains biais d’origine biologique ou technique. Ce protocole décrit les étapes et les précautions nécessaires à la conception et à la mise en œuvre de tests de pyroséquençage à utiliser dans le contexte de la mesure de l’hétéroplasmie.

Introduction

Le génome mitochondrial existe sous la forme de petites molécules circulaires (16,5 kb) (ADNmt) présentes dans le compartiment le plus interne des mitochondries nommé matrice et code 13 sous-unités de la chaîne respiratoire mitochondriale, ainsi que les ARNt et les ARNr nécessaires à leur traduction in situ par le ribosome mitochondrial1. Ce génome représente environ 1% de toutes les protéines nécessaires à la fonction mitochondriale, dont le reste est codé par l’ADN nucléaire (ADNn). Il est communément admis que les mitochondries sont dérivées d’un événement de fusion endosymbiotique entre un ancêtre alpha-protéobactérien et une cellule eucaryote ancestrale. Une fois cette symbiose hypothétique effectuée, l’information génétique des mitochondries a été progressivement transférée au noyau au fil des éons, ce qui explique la compacité susmentionnée de l’ADNmt par rapport aux génomes des cyanobactériesmodernes 2. Un tel transfert de gènes est le plus fortement mis en évidence par l’existence de longues étendues d’ADNn qui sont hautement homologues aux séquences trouvées dans l’ADNmt. Ces séquences mitochondriales nucléaires (NUMT) sont une source fréquente de mauvaise interprétation lors du génotypage, et certaines précautions doivent être prises pour éviter les biais nucléaires lors du génotypage del’ADNmt 3 (Figure 1A).

Une autre caractéristique distinctive de l’ADNmt est que son nombre de copies varie en fonction du type de cellule, allant de dizaines à des milliers de copies par cellule4. En raison de cette nature multi-copie, l’ADNmt peut héberger un large éventail de génotypes au sein d’une seule cellule, ce qui peut entraîner une distribution plus continue des allèles contrairement aux allèles discrets associés aux gènes nucléaires lorsque l’on considère la zygotie des chromosomes. Cette hétérogénéité des allèles mitochondriaux est appelée hétéroplasmie mitochondriale, qui est généralement exprimée en pourcentage de prévalence d’une mutation donnée en proportion de l’ADNmt total dans une cellule donnée. L’hétéroplasmie peut être comparée à l’homoplasmie, qui fait référence à une espèce unique d’ADNmt présente dans une cellule.

La mesure de l’hétéroplasmie mitochondriale est particulièrement intéressante pour quantifier la proportion de molécules d’ADNmt abritant des variantes pathogènes. Ces variantes se présentent sous la forme de polymorphismes mononucléotidiques (SNP), de petits indels ou de délétions à grande échelle5. La plupart des humains sont hétéroplasmiques pour les variantes pathogènes; cependant, ils ne présentent aucun phénotype clinique, qui ne se manifeste souvent qu’à des niveaux d’hétéroplasmie plus élevés d’ADNmt pathogène dans un phénomène appelé effet seuil6. Bien que les valeurs associées à la pathogénicité dépendent fortement de la nature de la mutation pathogène et du tissu dans lequel elle se produit, elles se situent généralement au-dessus de 60 % d’hétéroplasmie7.

Il existe plusieurs domaines de recherche dans lesquels le génotypage mitochondrial est courant. Dans le domaine médical, tester ou quantifier les mutations de l’ADNmt peut servir de critère diagnostique pour les maladies mitochondriales, dont beaucoup ont des aberrations d’ADNmt comme origine5. En plus de l’étude des mutations pathogènes humaines, la prévalence des modèles animaux hébergeant des SNP pathogènes dans l’ADNmt est susceptible d’augmenter, compte tenu de l’avènement récent de l’édition de bases mitochondriales rendue possible par les éditeurs de bases cytosines dérivées de DddA (DdCBEs)8 et les désaminases basées sur TALE (TALEDs) ciblant les mitochondries pour l’édition de bases d’adénine9. Cette approche sera déterminante pour comprendre l’interaction entre les génotypes mitochondriaux aberrants et les dysfonctionnements qui en résultent. Des recherches scientifiques sont également en cours sur le remodelage du génome mitochondrial pour une utilisation ultime en tant que stratégie thérapeutique dans les maladies mitochondriales humaines via une approche connue sous le nom de déplacement de l’hétéroplasmie. Ce domaine de recherche consiste principalement à diriger les nucléases spécifiques à la mutation vers la matrice mitochondriale; il en résulte la dégradation préférentielle de l’ADNmt pathogène, conduisant à des sauvetages dans le phénotype10,11,12,13. Toute expérience impliquant le remodelage du génotype mitochondrial nécessite une méthode quantitative robuste pour évaluer les changements d’hétéroplasmie.

Une grande variété de méthodes sont utilisées pour génotyper l’ADNmt, et celles-ci varient selon la nature de la mutation. Les méthodes de séquençage de nouvelle génération (NGS) sont plus précises lorsqu’il s’agit de quantifier les SNP dans l’ADNmt; Cependant, ces méthodes restent prohibitives pour la quantification de routine de l’hétéroplasie mitochondriale, en particulier si le nombre d’échantillons est faible. Le séquençage de Sanger peut également permettre la détection des SNP; Cependant, cette approche n’est pas quantitative et ne parvient souvent pas à détecter de faibles niveaux d’hétéroplasmie ou peut être inexacte lors de l’estimation des hétéroplasmies élevées. Le pyroséquençage, en tant que test qui implique une préparation minimale et permet la quantification rapide de l’hétéroplasmie pour n’importe quel échantillon d’ADNmt, est proposé comme un compromis approprié entre ces deux extrêmes. Cette méthode a été utilisée couramment pour quantifier les SNP mitochondriaux par de nombreux chercheurs dans divers contextes, y compris l’analyse médico-légale 14,15, le diagnostic clinique16, ou le génotypage de l’ADNmt à partir de cellules individuelles17.

Ce test implique une première étape de préamplification par PCR d’une région flanquant le SNP dans l’ADNmt, suivie d’un test de séquençage par synthèse utilisant un brin de l’amplicon précédemment généré. L’une des deux amorces utilisées dans l’étape de préamplification doit être biotinylée à l’extrémité 5', ce qui permettra à l’appareil de pyroséquençage d’isoler le simple brin d’ADN à utiliser comme modèle pour la réaction de séquençage. Une troisième amorce de séquençage est ensuite recuite sur le brin biotinylé retenu, ce qui permet de distribuer la synthèse naissante de l’ADN sous forme de désoxynucléotides dans un ordre prédéfini dans la chambre de réaction. Le pyroséquenceur enregistre la quantité de chaque base incorporée sur la base d’une lecture luminescente, permettant la quantification relative des allèles mitochondriaux mutants et de type sauvage lors de la synthèse de l’ADN (Figure 1B). La luminescence est générée par une enzyme luciférase, qui émet de la lumière en présence d’ATP qu’une ATP sulfurylase synthétise de novo à chaque événement d’incorporation à partir des pyrophosphates libérés par chaque nucléotide. Ces deux réactions peuvent se résumer comme suit :

1. PPi (à partir de l’incorporation de nucléotides) + APS → ATP + sulfate (ATP sulfurylase)

2. ATP + luciférine +O2 → AMP + PPi + oxyluciférine + CO2 + lumière (luciférase)

La détection des bases adénine par le pyroséquenceur sans réaction croisée de l’ATP avec la luciférase dans la deuxième réaction est un défi. Cependant, ceci est résolu en utilisant un analogue de l’adénine pour la synthèse de l’ADN, à savoir dATPαS. Bien qu’il ne s’agisse pas d’un substrat parfait pour la luciférase, il produit une luminescence plus forte par rapport aux trois autres nucléotides, qui est ajustée numériquement par le pyroséquenceur et réglée sur un facteur de 0,9. En raison de cette variabilité inhérente, il est suggéré d’éviter le séquençage de l’adénine à la position SNP (voir la discussion pour plus de détails).

Le protocole suivant détaille la méthode d’évaluation de l’hétéroplasmie de l’ADNmt par pyroséquençage et décrit les précautions nécessaires lors de la conception des amorces d’amplification pour éviter les biais biologiques ou techniques lors du génotypage des SNP dans l’ADNmt. Ce dernier implique l’étude numérique et la sélection des ensembles d’amorces, l’optimisation de la PCR de préamplification et, enfin, le séquençage et le raffinement du test. Deux exemples d’essais appliqués sont démontrés : premièrement, l’optimisation de la variante pathogène humaine la plus courante m.3243A>G18, et deuxièmement, le génotypage de cellules de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) qui ont subi un déplacement d’hétéroplasmie à l’aide de technologies développées au laboratoire Minczuk à Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

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Protocol

Un consentement éclairé a été fourni pour l’utilisation des cellules cybrides humaines 3243A>G et des MEF m.5024C>T immortalisés utilisés dans cette étude. L’approbation éthique n’était pas requise dans ce cas, car les cellules des patients n’ont pas été collectées à l’Université de Cambridge. L’utilisation de fibroblastes humains peut toutefois nécessiter une approbation éthique. Il est fortement recommandé de suivre les meilleures pratiques pour la configuration de la PCR lors de la préparation de l’échantillon d’ADN pour le pyroséquençage. Une amplification fréquente à l’aide d’amorces identiques peut entraîner une contamination par amplicon et introduire un biais dans le génotypage ultérieur si une séparation stricte entre les zones pré-PCR et post-PCR n’est pas observée. Le pipeline présenté ici utilise des équipements spécifiques provenant d’un seul fabricant; les détails se trouvent dans le tableau des matériaux. La conception de l’amorce pour la PCR peut être effectuée manuellement si vous le souhaitez; cependant, il est recommandé d’utiliser les logiciels existants à cette fin (voir le tableau des matériaux).

1. Conception de l’amorce de pyroséquençage et sélection des essais

  1. Obtenir des candidats d’introduction avec un logiciel
    1. Obtenir un fichier de séquence d’ADNmt pour l’espèce en cours de génotypage et identifier la position du SNP. S’assurer que la séquence de référence utilisée utilise la numérotation de base appropriée pour la mutation étudiée afin que la position du SNP puisse être facilement identifiée.
    2. Copiez 1 000 paires de bases en amont et en aval du site SNP et collez la séquence tronquée dans le logiciel destiné à la conception de l’amorce pyroséquençage (voir le tableau des matériaux).
    3. Définissez la base SNP analysée comme cible du test de pyroséquençage dans le logiciel en mettant en surbrillance la base polymorphe et en cliquant avec le bouton droit de la souris, puis en sélectionnant définir la région cible.
    4. Appuyez sur l’icône de lecture dans le coin supérieur droit de l’interface pour lancer la sélection de l’amorce.
    5. Attendez que le logiciel génère maintenant automatiquement des trios d’amorces : deux amorces pour la préamplification de l’ADN modèle et une troisième amorce pour le séquençage par synthèse dans la machine de pyroséquençage. Conservez tous les jeux d’amorces en cliquant avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant Copier tous les jeux d’amorces.
  2. Sélection des jeux d’amorces optimaux dans la liste générée
    1. Conservez les jeux d’amorces avec le score de qualité le plus élevé en fonction de la sortie du logiciel, qui fournit des ensembles d’amorces par ordre décroissant en fonction du score de qualité. Si possible, omettez les ensembles d’amorces avec un score inférieur à 80.
    2. Pour les jeux d’amorces conservés, identifiez et copiez l’amplicon produit par les amorces d’amplification.
    3. Alignez les amplicons produits avec l’ensemble du génome de l’organisme à génotyper à l’aide de NCBI Blast en utilisant le portail de soumission en ligne à https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Dans les menus déroulants lors de la soumission, sélectionnez les éléments suivants :
      1. Sélectionnez Base de données | Bases de données génomiques + transcriptions.
      2. Sélectionnez Humain ou Souris dans le menu déroulant, en fonction du SNP analysé.
      3. Sélectionnez Optimiser pour | Séquences quelque peu similaires (Blastn).
    4. (Facultatif) Si vous génotypez un organisme autre qu’une souris ou un humain, sélectionnez les options suivantes lors de la soumission :
      1. Sélectionnez Base de données | Base de données standard.
      2. Sélectionnez RefSeq Representative genomes dans le menu déroulant
      3. Sélectionnez Optimiser pour | Séquences quelque peu similaires (Blastn)
    5. Dans la mesure du possible, omettez tous les amplicons qui ont une homologie parfaite avec l’amplicon de l’ADNmt, en particulier si les régions de liaison de l’amorce sont parfaitement homologues (voir la discussion).
      REMARQUE: L’outil d’alignement BLAST renverra n’importe quelle séquence avec une homologie considérable aux amplicons de pré-amplification. Cela permet de détecter les NUMT décrits dans l’introduction, qui, s’ils ne sont pas pris en compte, peuvent induire un biais car ils sont co-amplifiés avec l’ADN mitochondrial.
    6. Commandez les oligos obtenus via ce pipeline. Assurez-vous que la modification de la biotine 5' est ajoutée à l’amorce d’amplification correcte lors de l’ordre de synthèse, de sorte que l’amorce de séquençage soit complémentaire au brin biotinylé.
      REMARQUE: Le choix de l’amorce de séquençage est plus flexible que les amorces d’amplification, et il est recommandé d’avoir au moins une base séparant l’extrémité 3' de l’amorce de séquençage et la position variable.

2. Optimisation de la PCR de préamplification

  1. Préparer les échantillons d’ADN en extrayant l’ADN génomique total à l’aide d’une méthode appropriée.
    NOTE: Cela dépendra en grande partie du nombre de cellules génotypées et de leur origine. Si l’ADN est isolé à partir de cellules individuelles à l’aide d’un tampon de lyse contenant la protéinase K, l’échantillon doit être dénaturé à 95 °C pendant 10 minutes afin de ne pas perturber la polymérase lors de la PCR suivante.
  2. Configuration de la PCR et paramètres du bloc thermique
    1. Configurez la PCR avec une polymérase haute fidélité de votre choix. Préparez un Master Mix pour quatre réactions. Comme seulement 10 μL de réaction PCR sont nécessaires pour un cycle de pyroséquençage, préparez 25 μL de réactions PCR (pour permettre une répétition technique si nécessaire). Utiliser 40 cycles de PCR avec environ 10 ng d’ADN génomique comme matériau de départ avec 1 μM des amorces avant et arrière.
    2. Réglez le temps de prolongation en fonction des spécifications du fabricant pour la polymérase utilisée, en tenant compte de la longueur des amorces de préamplification choisies.
    3. Utilisez un thermocycleur avec des réglages de température de recuit variables. Comme la température de recuit peut varier en fonction de la séquence d’amorce, la teneur en sel du tampon polymérase et d’autres facteurs programment quatre températures de recuit différentes dans le programme de cyclage thermique.
      REMARQUE : L’exemple utilisé dans les résultats représentatifs utilisait les températures suivantes : 55 °C, 60 °C, 65 °C et 70 °C.
    4. Divisez le mélange maître en quatre tubes PCR de 200 μL et réglez-les pour qu’ils fonctionnent à chacune des quatre températures de recuit sélectionnées dans le thermocycleur pendant 40 cycles.
  3. Visualisation de bande de préamplification
    1. Pendant l’exécution de PCR, préparer un gel d’agarose à 2% (p / v) dans 1x TBE avec SYBR Safe ou du bromure d’éthidium comme agent de visualisation.
      REMARQUE: Un gel à pourcentage plus élevé est recommandé pour la visualisation car les fragments amplifiés sont généralement courts, allant généralement de 100 à 500 paires de bases.
    2. Une fois la PCR terminée à l’étape 2.2, mélanger 10 μL de la réaction avec une quantité appropriée de tampon de charge d’ADN et appliquer le gel d’agarose à 2 % à 7 V/cm pendant environ 45 minutes.
    3. Visualisez les fragments d’ADN résultants sur un transilluminateur UV.
      NOTE: Les conditions de cyclage thermique sélectionnées pour l’étape de préamplification doivent produire une seule bande propre de la taille attendue. Des températures de recuit plus basses peuvent parfois entraîner une amplification hors cible, ce qui peut introduire des biais dans le pyroséquençage ultérieur.
    4. Sélectionnez la température de recuit la plus basse qui produit une bande propre de la taille correcte pour les amplifications suivantes.
    5. (Facultatif) Extrayez une bande de la taille attendue, purifiez à l’aide d’un kit d’extraction de gel de votre choix et analysez par séquençage de Sanger pour confirmer l’hétéroplasmie approximative de l’échantillon comme référence.

3. Configuration et exécution de l’instrument

REMARQUE: Une fois que l’étape de PCR de la section précédente est optimisée, l’étape suivante consiste à programmer le pyroséquenceur avec la séquence nucléotidique correcte à analyser pour le SNP spécifique. Il s’agit d’entrer 10 bases directement en aval de l’extrémité 3' de l’amorce de séquençage. Ceci est détaillé dans la section suivante.

  1. Configuration du dosage
    1. Ouvrez le logiciel d’exécution fourni avec le pyroséquenceur et sélectionnez Nouveau test dans le coin supérieur gauche de l’interface.
    2. Sélectionnez le modèle de test de quantification Allele .
    3. Entrez la séquence à analyser dans la case correspondante en tapant les nucléotides à incorporer directement en aval de l’amorce de séquençage, qui doit être en amont du SNP d’intérêt. Pour la position variable, désignez les deux bases possibles séparées par une barre oblique (par exemple, A/T).
    4. Appuyez sur Générer l’ordre de dispensation et laissez le logiciel déterminer automatiquement un ordre approprié pour les nucléotides à distribuer dans la réaction de séquençage par synthèse.
    5. Enregistrez et donnez un nom pour le test.
  2. Préparation et stockage des réactifs
    1. Diluer l’amorce de séquençage commandée à 4 μM dans le tampon de recuit fourni dans le kit de réactif pyroséquenceur.
      NOTE: L’amorce de séquençage peut d’abord être diluée dans de l’eau à 100 μM sous forme de solution mère, puis diluée dans un tampon de recuit à 4 μM si nécessaire.
    2. Préparation et manipulation des enzymes et des substrats
      1. Lors du premier déballage, dissoudre à nouveau l’enzyme lyophilisée et le substrat conformément aux recommandations du fabricant. Conserver à −20 °C lorsqu’il n’est pas utilisé.
      2. Lors de l’utilisation ultérieure, décongeler les flacons d’enzymes et de substrat à partir de −20 °C.
        REMARQUE: Tous les autres réactifs du kit fourni peuvent être conservés au réfrigérateur à 4 °C. Les amorces de séquençage diluées peuvent également être conservées à 4 °C.
    3. Placez la quantité requise de chaque réactif sur de la glace.
    4. Maintenir les autres composants nécessaires, à savoir les billes magnétiques recouvertes de streptavidine, les bandes absorbantes et les disques pyroséquençables, à 4 °C.
  3. Exécuter l’exécution
    REMARQUE : Lorsqu’un test est conçu pour la première fois, il doit être étalonné à l’aide de produits PCR d’hétéroplasmie connue, ce qui garantit que le test peut distinguer avec précision les hétéroplasmies. Les chercheurs peuvent utiliser des mélanges de produits PCR d’hétéroplasmie connue comme étalons. Les échantillons peuvent également être vérifiés par d’autres méthodes mentionnées dans l’introduction et la discussion, notamment NGS.
    1. Diluer l’ADN à analyser à 5 ng/μL. En particulier lors de la première exécution, assurez-vous d’inclure des échantillons d’hétéroplasmie connue comme échantillon de référence et / ou de type sauvage.
    2. Effectuer une PCR de préséquençage de 5 μL d’ADN dilué dans des réactions de 25 μL en utilisant les amorces d’amplification et les paramètres identifiés dans les sections 1 et 2. Effectuer des répétitions techniques de PCR pour chaque échantillon.
      REMARQUE: La PCR de préamplification peut être stockée à court terme à 4 °C ou à long terme à -20 °C avant de procéder au séquençage.
    3. Exécuter le programme d’installation du fichier
      1. Sélectionnez Nouvelle exécution dans le coin supérieur gauche du logiciel pyroséquenceur.
      2. Le pyroséquenceur peut séquencer simultanément 48 réactions préamplifiées distinctes, avec un carré vide représentant un seul puits de séquençage sur un disque de pyroséquençage. Chargez les tests configurés dans la section 3.1 en cliquant avec le bouton droit de la souris sur un carré et en sélectionnant le test de charge. Si nécessaire, séquencez jusqu’à quatre essais distincts avec différentes amorces de séquençage.
      3. Réglez le mode de distribution de l’amorce sur Automatique pour attribuer automatiquement une chambre d’injection pour chaque amorce de séquençage utilisée pour l’exécution.
      4. Définissez le mode d’exécution sur Standard , sauf si vous exécutez quatre types de tests différents sur un disque de séquencement.
      5. Assurez-vous que le nombre de tests sur le fichier de modèle d’exécution correspond au nombre de réactions PCR amplifiées.
        Remarque : Si vous exécutez plus de 48 exemples, des fichiers d’exécution supplémentaires devront être configurés.
      6. Enregistrez les fichiers d’exécution sur une clé USB.
    4. Amorçage du pyroséquenceur
      1. Appuyez sur le bouton Nettoyage sur l’écran tactile principal de l’appareil et nettoyez tous les injecteurs avec de l’eau de haute pureté en suivant les instructions à l’écran. Lors de l’insertion de la bande absorbante dans la machine, assurez-vous que les extrémités se rencontrent dans la position « 9 heures » (directement à gauche du centre).
      2. Branchez la clé USB avec les exécutions configurées à l’étape 3.3.3 et chargez les fichiers d’exécution définis à l’étape 3.3.3.
        REMARQUE: Les fichiers d’exécution doivent être enregistrés en dehors de n’importe quel répertoire ou dossier sur la clé USB ou ils ne peuvent pas être lus par la machine.
      3. Suivez les instructions sur l’appareil pour charger et amorcer les réactifs selon les besoins dans les injecteurs correspondants sur la machine.
    5. Préparation du disque d’échantillon et lancement de l’essai
      1. Laissez les billes magnétiques enrobées de streptavidine s’équilibrer à température ambiante.
        REMARQUE: Ces billes permettront à l’appareil de capturer le brin biotinylé de l’étape de PCR de préamplification. Ils doivent être achetés séparément du kit.
      2. Chargez 3 μL de billes dans les puits définis dans le fichier d’exécution de l’étape 3.3.3.
      3. Charger 10 μL de chaque réaction PCR à séquencer dans l’échantillon correspondant, et pipeter de haut en bas pour mélanger l’échantillon avec les billes magnétiques. Évitez les bulles si possible.
      4. Recherchez l’indication dans le pyroséquenceur amorcé que le disque peut être chargé dans la machine. Dévissez l’écrou de maintien de la plaque avant d’aligner la plaque d’échantillon chargée avec la goupille métallique dans le compartiment à disque.
      5. Une fois la plaque fermement vissée dans le compartiment de la plaque, lancez l’exécution du séquençage en appuyant sur le bouton de démarrage de l’interface de l’écran tactile.

4. Acquisition des résultats

  1. Une fois l’exécution terminée, retirez la clé USB de la machine et rebranchez-la sur l’ordinateur exécutant le logiciel pyroséquenceur. Tout en procédant aux étapes suivantes, procédez au nettoyage du pyroséquenceur en suivant les instructions s’il s’agit de la dernière exécution de la journée.
  2. Attendez que le fichier d’exécution nouvellement généré apparaisse sur le lecteur USB et double-cliquez sur le fichier de résultats de l’exécution. Cela analyse automatiquement la sortie de luciférase de chaque puits lors de l’incorporation de nucléotides et quantifie l’allèle mitochondrial d’intérêt défini lors de la configuration du test dans la section 3.1.
  3. Recherchez les scores de couleur suivants affichés par le logiciel en fonction de la qualité des lectures. Le bleu indique une exécution optimale, le jaune une exécution avec un avertissement et le rouge une exécution échouée. Pour enregistrer les résultats, sélectionnez Rapports dans la fenêtre supérieure | Rapport complet pour générer un fichier .pdf contenant les pyrogrammes et les résultats de chaque puits de l’essai. Vous pouvez également télécharger les résultats dans d’autres formats sous l’onglet Rapports .

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Representative Results

Cette section présente un exemple d’optimisation d’un test de pyroséquençage pour une mutation de l’ADNmt pathogène humain, ainsi que des données de séquençage provenant du génotypage de fibroblastes embryonnaires de souris hétéroplasmiques (m.5024C>T) traités avec des nucléases mitochondriales à doigts de zinc (mtZFN). L’optimisation du dosage pour les cellules humaines et la comparaison de deux tests différents montrent comment sélectionner le plus précis, tandis que le génotypage des cellules MEF génétiquement modifiées dans le deuxième exemple sert d’exemple appliqué de détection des changements d’hétéroplasmie après une intervention de thérapie génique.

Mutation humaine m.3243A>G
Cet exemple illustre le génotypage d’une variante pathogène commune de mtDNA-m.3243A>G. La mutation commune m.3243A>G sous-tend plusieurs maladies cliniques, notamment l’encéphalopathie mitochondriale, l’acidose lactique et les épisodes de type AVC (MELAS), la surdité et le diabète héréditaires de la mère (MIDD) et l’ophtalmoplégie externe progressive (PEO)23. Ce test peut également être utilisé pour génotyper la variante24 m.3243A>T moins courante en reprogrammant la séquence de nucléotides à incorporer, comme décrit dans la section 3.1.3 du protocole.

Conformément aux lignes directrices sur l’optimisation des amorces de la section 1, les ensembles d’amorces suivants ont été sélectionnés, un pour l’un ou l’autre brin :

Essai 1 :

Avant: 5' - [Biotine] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Revers: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Séquençage: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'

Taille de l’amplicon : 215 pb

Dosage 2 :

Avant: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Revers: 5' - [Biotine] GTTGGCCATGGGTATGTTGTT- 3'
Séquençage: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'

Taille de l’amplicon : 182 pb

Pour déterminer les conditions de cyclage thermique pour l’essai, une PCR à gradient thermique utilisant une polymérase Hot Start (voir le tableau des matériaux) a d’abord été réalisée et analysée par électrophorèse, conformément à la section 2. Quarante cycles ont été utilisés pour amplifier environ 10 ng d’ADN comme modèle de départ. En suivant les étapes de la section 2.3 du protocole, une électrophorèse sur gel d’agarose a été réalisée pour vérifier la spécificité du protocole d’amplification à une température de recuit donnée (Figure 2A). Des bandes réussies des tailles correctes (215 pb ou 182 pb ont pu être observées à toutes les températures; Cependant, les températures de recuit plus basses dans le test 1 ont entraîné une amplification hors cible. La température de recuit appropriée pour la préamplification a été établie à 70 °C (figure 2A). Pour déterminer la précision des deux dosages et choisir le meilleur, des étalons molaires de pourcentage m.3243A>G connus ont été générés en mélangeant des volumes appropriés de produit PCR pur dans différents rapports : 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% et 100% de m.3243A>G, respectivement (Figure 2B, ligne pointillée). Lors de la réalisation des deux tests sur les étalons, nous avons observé une plus grande corrélation avec le résultat attendu dans le test 2 (Figure 2B). Nous avons ensuite utilisé les deux tests sur des cellules cybrides m.3243A>G dans une expérience de génotypage et observé un biais prononcé dans le test 1, en particulier près des conditions homoplasmiques (Figure 2C).

Mutation m.5024C>T murine
Cet exemple implique des cellules MEF traitées avec des mtZFN développées pour diminuer le niveau de la mutation m.5024C>T12 comme exemple d’une expérience de thérapie génique mitochondriale où le génotypage par pyroséquençage est utile comme comparaison quantitative entre échantillons. Les cellules MEF sont dérivées d’un modèle murin publié hébergeant une mutation C>T en position 5 024 dans l’ADNmt de la souris (m.5024C>T)25. L’expérience consistait à électropoler les MEF avec des plasmides codant pour les mtZFN et différents rapporteurs fluorescents, puis à trier les cellules exprimant les plasmides par FACS après 24 heures. Les cellules ont ensuite été laissées récupérer pendant 2 semaines avant comparaison de l’hétéroplasmie par pyroséquençage.

L’ensemble d’amorces utilisé pour séquencer la position m.5024C>T était le suivant :

Attaquant: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Revers : 5' - [Biotine] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
Séquençage: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'

Taille de l’amplicon : 267 pb

Les échantillons ont été séquencés en triple exemplaire technique pour augmenter la fidélité des résultats. L’expérience a également été réalisée en double biologique, produisant ainsi six valeurs distinctes pour chacune des conditions (Figure 3B). Les données de 2 des 18 pyrogrammes ont été utilisées pour construire la figure 3B; ces pyrogrammes sont présentés à la figure 3A.

Figure 1
Figure 1 : Schémas représentant les séquences mitochondriales dans une cellule et schéma technique général du pyroséquençage. (A) Représentation schématique de l’ADN mitochondrial et des séquences mitochondriales nucléaires. La figure représente l’origine évolutive des séquences à haute homologie. (B) Représentation schématique du pipeline d’essais de pyroséquençage avec un dernier exemple de séquence illustrant une valeur d’hétéroplasmie C>G d’environ 50 %. L’ADN du modèle est d’abord amplifié par des amorces d’amplification sélectionnées, dont l’une est biotinylée à l’extrémité 5'. Après l’amplification, le pyroséquenceur conserve un seul brin d’ADN comme modèle pour le séquençage à l’aide de billes magnétiques recouvertes de streptavidine, représentées en bleu. Enfin, une amorce de séquençage permet le séquençage par synthèse d’une série prédéfinie de nucléotides, générant un pyrogramme représenté schématiquement. Les stœchiométrie de chaque base sont facilement obtenues en comparant les hauteurs relatives des pics à chaque événement d’incorporation : le même nucléotide deux fois de suite générera un double pic par rapport à une seule base. La barre oblique dans la séquence à analyser indique le SNP hypothétique, qui pourrait être « C » ou « G ». Notez la dispense initiale d’une base « G » simulée sur l’axe des x du pyrogramme, qui est généralement effectuée par le pyroséquenceur en tant que témoin négatif. Abréviations : ADNmt = ADN mitochondrial; NUMT = séquences mitochondriales nucléaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Optimisation de l’amorce de pyroséquençage illustrée sur la mutation humaine m.3242A>G. (A) Électrophorèse sur gel d’agarose (2 % p/v) d’une amplification par PCR utilisant les amorces d’amplification des deux ensembles sélectionnés pour la mutation m.3242A>G. WT désigne l’ADN témoin de type sauvage, tandis que Het est l’échantillon m.3243A>G presque homoplasmique à analyser. Les températures sont la température de recuit utilisée dans une réaction PCR à 40 cycles. (B). Une comparaison des performances des deux jeux d’amorces utilisant des étalons molaires pour l’étalonnage, qui ont été obtenus en mélangeant divers rapports de produit pur de type sauvage et de produit pur mutant m3243A>G. Les valeurs mesurées sont indiquées par les lignes pointillées verticales. Une fonction linéaire X = Y est affichée pour illustrer à quel point chacun des deux tests testés est proche d’une mesure idéale. Les noms des lignées cellulaires sur l’axe des x sont les noms des différents clones de cybride qui ont été génotypés à l’aide de ce test. (C) Résultats du génotypage sur quatre clones de cybride d’hétéroplasmie m.3243A>G inconnue à l’aide des deux essais. Le séquençage a été effectué en triplat technique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Mesure de l’hétéroplasmie sur des MEF m.5024C>T triés par FACS traités avec la technologie d’édition de gènes mtZFN. (A) Pyrogrammes provenant de deux réplicas PCR d’échantillons de cellules MEF utilisés pour générer la figure 3B ainsi que le contrôle du génotypage de type sauvage. Les valeurs de luminescence sur l’axe des Y sont exprimées dans A.U. (B) Résultats de génotypage de cellules traitées mtZFN ainsi que de témoins non traités et simulés. Les MEF ont été électroporés avec des plasmides codant pour des mtZFN et différents rapporteurs fluorescents, puis triés par FACS après 24 heures. Les cellules ont ensuite été laissées récupérer pendant 2 semaines avant comparaison de l’hétéroplasmie par pyroséquençage. Les barres d’erreur ont été calculées à l’aide de doublons biologiques, dont chacun a subi un pyroséquençage en triplic technique. Abréviations : FACS = tri cellulaire activé par fluorescence; MEF = fibroblastes embryonnaires de souris; mtZFN = nucléase mitochondriale à doigt de zinc; A.U. = unités arbitraires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Un aspect essentiel pour le succès du protocole est d’éviter les contaminations, en particulier lors de l’utilisation de faibles quantités de matières premières. Il est recommandé d’utiliser une hotte UV et des pointes de pipettes filtrées lors de la préparation des échantillons dans la mesure du possible, ainsi que de séparer les zones de préamplification et de post-amplification. Des mesures à blanc et des échantillons d’hétéroplasmie connue (tels que l’ADN de type sauvage) doivent toujours être inclus pour être utilisés comme points de référence pour vérifier les biais techniques ou biologiques.

Un biais technique notable inhérent au test est l’augmentation du signal luminescent produit par l’incorporation analogique de l’adénine. Lorsque l’adénine est utilisée à une position variable, elle produit souvent un pic fluorescent résiduel (p. ex., figure 2C). C’est pour cette raison qu’il est recommandé d’effectuer des essais de pyroséquençage sur le brin opposé (où une thymine sera incorporée), lorsque cela est possible pour éviter d’avoir à incorporer l’analogue de l’adénine en position variable. Cependant, dans le cas de mutations A>T ou T>A, cela est impossible. Néanmoins, comme en témoignent les résultats représentatifs, un choix approprié d’amorces peut être d’une plus grande importance lors de la conception d’un essai. Dosage 2 pour la mutation m.3243A>G, dans la première section des résultats représentatifs, séquences basées sur le rapport A/G à la position variable contrairement au test 1, qui mesure le rapport T/C. Bien qu’il soit sensible au biais d’incorporation d’adénine, le test 2 fournit des résultats plus précis basés sur la comparaison avec les étalons molaires, comme le montre une simple analyse de régression linéaire (Figure 2B).

Les biais sont principalement le résultat de la co-amplification NUMT3. Le grand nombre de copies mitochondriales empêche généralement les séquences nucléaires hors cible d’introduire un biais significatif; cependant, certaines régions de l’ADNmt sont présentes dans de nombreux NUMTS et doivent être évitées en utilisant les méthodes indiquées dans le protocole à la section 1.

Lorsque vous prenez les précautions susmentionnées, cette méthode est un moyen très modulaire, rapide et rentable de génotypage des SNP dans l’ADNmt. Cependant, la méthode n’est pas adaptée à toutes les applications de génotypage mitochondrial, notamment les délétions à grande échelle pour lesquelles la PCR par gouttelettes numériques est recommandée26. La variabilité de la distribution des réactifs par le séquenceur ou différentes conditions d’amorce/amplification peut entraîner l’introduction de petits biais. C’est pour cette raison que les triplicates techniques sont généralement recommandés pour confirmer la véracité des résultats du génotypage. Une autre limite de l’approche est la portée, puisque seules de courtes étendues prédéfinies d’ADNmt peuvent être génotypées. Bien que les pyroséquenceurs puissent être programmés pour séquencer des centaines de paires de bases de séquences inconnues, cela devient rapidement moins rentable que d’utiliser une approche NGS. Les chercheurs pourraient initialement mettre en œuvre le pyroséquençage comme méthode de génotypage rapide qui donne une réponse quantitative précise, mais pourraient ensuite analyser des échantillons choisis par NGS pour plus de précision et de contexte.

En conclusion, cette méthode bien établie reste un incontournable de la recherche génétique mitochondriale, offrant un accès rapide et simple à des mesures quantitatives de l’hétéroplasmie qui sont essentielles dans de nombreux contextes de recherche dans le domaine, tels que le diagnostic des patients, la thérapie génique ou le génotypage de modèles animaux.

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Disclosures

M.M. est cofondateur, actionnaire et membre du conseil consultatif scientifique de Pretzel Therapeutics, Inc. P.S.-P. et P.A.N. fournissent des services de conseil à Pretzel Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Silvia Marchet et Constanza Lamperti (Istituto Neurologico « Carlo Besta », Fondazione IRCCS, Milan) pour avoir préparé et fourni les cellules cybrides m.3243A>G utilisées comme exemples illustratifs pour ce protocole. Nous tenons également à remercier les membres du Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, Université de Cambridge) pour les discussions utiles au cours de cette recherche. Ce travail a été soutenu par un financement de base du Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 et MC_UU_00028/3). P.A.N. et P.S.-P. sont également soutenus par The Lily Foundation et The Champ Foundation, respectivement.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD Hot Start DNA Polymerase Sigma-Aldrich 71086
PyroMark Assay Design 2.0 QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips  QIAGEN 974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) QIAGEN 974022
Pyromark Q48 Autoprep  QIAGEN 9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set QIAGEN 9024321
Pyromark Q48 Disks QIAGEN 974901
Pyromark Q48 Magnetic beads  QIAGEN 974203
PyroMark Q48 Software License (1) QIAGEN 9024325

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References

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Rétractation No. 192
Génotypage de polymorphismes mononucléotidiques dans le génome mitochondrial par pyroséquençage
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Nash, P. A., Silva-Pinheiro, P.,… More

Nash, P. A., Silva-Pinheiro, P., Minczuk, M. A. Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing. J. Vis. Exp. (192), e64361, doi:10.3791/64361 (2023).

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