Summary
Os ensaios de pirosequenciamento permitem a genotipagem robusta e rápida de polimorfismos de nucleotídeo único do DNA mitocondrial em células ou tecidos heteroplasmáticos.
Abstract
Mutações no genoma mitocondrial (mtDNA) têm sido associadas a doenças genéticas maternas hereditárias. No entanto, o interesse em polimorfismos do mtDNA tem aumentado nos últimos anos devido à capacidade recentemente desenvolvida de produzir modelos por mutagênese do mtDNA e uma nova apreciação da associação entre aberrações genéticas mitocondriais e doenças comuns relacionadas à idade, como câncer, diabetes e demência. O pirosequenciamento é uma técnica de sequenciamento por síntese amplamente empregada em todo o campo mitocondrial para experimentos de genotipagem de rotina. Sua relativa acessibilidade quando comparada a métodos massivos de sequenciamento paralelo e facilidade de implementação a tornam uma técnica inestimável no campo da genética mitocondrial, permitindo a rápida quantificação de heteroplasmia com maior flexibilidade. Apesar da praticidade desse método, sua implementação como meio de genotipagem do mtDNA requer a observação de certas diretrizes, especificamente para evitar certos vieses de origem biológica ou técnica. Este protocolo descreve as etapas e precauções necessárias no projeto e implementação de ensaios de pirosequenciamento para uso no contexto da medição de heteroplasmia.
Introduction
O genoma mitocondrial existe na forma de pequenas moléculas circulares (mtDNA de 16,5 kb) presentes no compartimento mais interno da mitocôndria, denominado matriz e codifica 13 subunidades da cadeia respiratória mitocondrial, bem como os RNAt e RNAr necessários para sua tradução in situ pelo ribossomo mitocondrial1. Este genoma representa aproximadamente 1% de todas as proteínas necessárias para a função mitocondrial, sendo o restante codificado pelo DNA nuclear (nDNA). É comumente assumido que as mitocôndrias são derivadas de um evento de fusão endossimbiótico entre um ancestral alfa-proteobacteriano e uma célula eucariótica ancestral. Uma vez ocorrida essa simbiose hipotética, a informação genética das mitocôndrias foi gradualmente transferida para o núcleo ao longo de eras, o que explica a já mencionada compacidade do mtDNA quando comparada aos genomas das cianobactériasmodernas2. Tal transferência de genes é mais fortemente evidenciada pela existência de longos trechos de nDNA que são altamente homólogos às sequências encontradas no mtDNA. Essas sequências mitocondriais nucleares (NUMTs) são uma fonte comum de interpretação errônea durante a genotipagem, e certos cuidados devem ser tomados para evitar vieses nucleares ao genotipar o mtDNA3 (Figura 1A).
Outra característica distintiva do mtDNA é que seu número de cópias varia dependendo do tipo celular, numerando de dezenas a milhares de cópias por célula4. Devido a essa natureza multicopiada, o mtDNA pode abrigar uma ampla gama de genótipos dentro de uma única célula, o que pode resultar em uma distribuição mais contínua de alelos em contraste com os alelos discretos associados a genes nucleares quando se considera a zigosidade dos cromossomos. Essa heterogeneidade dos alelos mitocondriais é referida como heteroplasmia mitocondrial, que é tipicamente expressa na prevalência percentual de uma dada mutação como uma proporção do mtDNA total em uma dada célula. A heteroplasmia pode ser contrastada com a homoplasmia, que se refere a uma espécie única de mtDNA estar presente em uma célula.
A mensuração da heteroplasmia mitocondrial é de particular interesse quando se quantifica a proporção de moléculas de mtDNA que abrigam variantes patogênicas. Tais variantes apresentam-se na forma de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), pequenos indéis ou deleções em grande escala5. A maioria dos seres humanos é heteroplasmática para variantes patogênicas; no entanto, não exibem fenótipos clínicos, que muitas vezes só se manifestam em níveis mais elevados de heteroplasmia do mtDNA patogênico, em um fenômeno denominado efeito limiar6. Embora os valores associados à patogenicidade sejam altamente dependentes da natureza da mutação patogênica e do tecido em que ela ocorre, eles tipicamente encontram-se acima de 60% de heteroplasmia7.
Existem várias áreas de pesquisa nas quais a genotipagem mitocondrial é comum. Na área médica, testar ou quantificar mutações no mtDNA pode servir como critério diagnóstico para doenças mitocondriais, muitas das quais têm como origem as aberrações do mtDNA5. Além do estudo de mutações patogênicas humanas, é provável que a prevalência de modelos animais que abrigam SNPs patogênicos no mtDNA aumente, dado o recente advento da edição de bases mitocondriais possibilitada por editores de base de citosina derivados de DddA (DdCBEs) direcionados mitocondrialmente8 e deaminases baseadas em TALEs (TALEDs) para edição de bases de adenina9. Esta abordagem será fundamental para o entendimento da interação entre genótipos mitocondriais aberrantes e as disfunções resultantes. Há também pesquisas científicas em andamento sobre a remodelação do genoma mitocondrial para uso final como estratégia terapêutica em doenças mitocondriais humanas por meio de uma abordagem conhecida como deslocamento de heteroplasmia. Este campo de pesquisa envolve principalmente o direcionamento de nucleases específicas de mutação para a matriz mitocondrial; isso resulta na degradação preferencial do mtDNA patogênico, levando a resgates no fenótipo10,11,12,13. Quaisquer experimentos envolvendo a remodelação do genótipo mitocondrial requerem um método quantitativo robusto para avaliar os desvios heteroplasmáticos.
Uma grande variedade de métodos é usada para genotipar o mtDNA, e estes variam de acordo com a natureza da mutação. Os métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) são mais precisos quando se trata de quantificar SNPs no mtDNA; no entanto, esses métodos permanecem proibitivamente caros para a quantificação rotineira da heteroplasmia mitocondrial, particularmente se o número de amostras for pequeno. O sequenciamento de Sanger também pode permitir a detecção de SNPs; no entanto, essa abordagem não é quantitativa e muitas vezes falha em detectar baixos níveis de heteroplasmia ou pode ser imprecisa ao estimar altas heteroplasmias. O pirosequenciamento, como um ensaio que envolve preparação mínima e permite a quantificação rápida de heteroplasmia para qualquer amostra de mtDNA, é proposto como um compromisso adequado entre esses dois extremos. Esse método tem sido utilizado rotineiramente para quantificar SNPs mitocondriais por inúmeros pesquisadores em vários contextos, incluindo análise forense14,15, diagnóstico clínico16 ou genotipagem do mtDNA a partir de célulasisoladas17.
Este ensaio envolve uma primeira etapa de pré-amplificação por PCR de uma região flanqueando o SNP no mtDNA, que é seguida por um ensaio de sequenciamento por síntese usando uma fita do amplicon previamente gerado. Um dos dois primers utilizados na etapa de pré-amplificação deve ser biotinilado na extremidade 5', o que permitirá ao aparelho pirosequenciador isolar a fita única de DNA a ser usada como molde para a reação de sequenciamento. Um terceiro primer de sequenciamento é então recozido na fita biotinilada retida, o que permite que a síntese de DNA nascente como desoxinucleotídeos seja dispensada em uma ordem predefinida na câmara de reação. O pirosequenciador registra a quantidade de cada base incorporada com base em uma leitura luminescente, permitindo a quantificação relativa de alelos mitocondriais mutantes e selvagens após a síntese de DNA (Figura 1B). A luminescência é gerada por uma enzima luciferase, que emite luz na presença de ATP que uma ATP sulfurilase sintetiza de novo a cada evento de incorporação a partir dos pirofosfatos liberados por cada nucleotídeo. Essas duas reações podem ser resumidas da seguinte forma:
1. PPi (da incorporação de nucleotídeos) + APS → ATP + sulfato (ATP sulfurilase)
2. ATP + luciferina + O 2 → AMP + PPi + oxiluciferina + CO2 + luz (luciferase)
A detecção de bases de adenina pelo pirosequenciador sem reação cruzada de ATP com a luciferase na segunda reação é um desafio. No entanto, isso é resolvido usando um análogo de adenina para a síntese de DNA, ou seja, dATPαS. Apesar de não ser um substrato perfeito para a luciferase, produz uma luminescência mais forte em comparação com os outros três nucleotídeos, que é ajustada digitalmente pelo pirosequenciador e ajustada para um fator de 0,9. Devido a essa variabilidade inerente, sugere-se evitar o sequenciamento de adenina na posição SNP (veja a discussão para mais detalhes).
O protocolo a seguir detalha o método de avaliação da heteroplasmia do mtDNA por pirosequenciamento e descreve as precauções necessárias no planejamento dos primers de amplificação para evitar viés biológico ou técnico ao genotipar SNPs no mtDNA. Este último envolve o levantamento e seleção digital dos conjuntos de primers, a otimização da PCR pré-amplificação e, finalmente, o sequenciamento e refinamento do ensaio. Dois ensaios de exemplo aplicados são demonstrados: primeiro, a otimização da variante patogênica humana mais comum m.3243A>G18 e, segundo, a genotipagem de células de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) que sofreram deslocamento heteroplasmático usando tecnologias desenvolvidas no laboratório Minczuk em Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.
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Protocol
Consentimento informado foi fornecido para o uso das células cybrid 3243A>G humanas e dos MEFs m.5024C>T imortalizados usados neste estudo. A aprovação ética não foi necessária neste caso, pois as células do paciente não foram coletadas na Universidade de Cambridge. O uso de fibroblastos humanos pode, no entanto, exigir aprovação ética. É altamente recomendável seguir as melhores práticas para a configuração do PCR ao preparar o DNA da amostra para pirosequenciamento. A amplificação frequente usando primers idênticos pode levar à contaminação do amplicon e introduzir viés na genotipagem subsequente se não for observada uma separação rigorosa entre as áreas pré-PCR e pós-PCR. O pipeline aqui apresentado utiliza equipamentos específicos de um único fabricante; os detalhes podem ser encontrados na Tabela de Materiais. O desenho do primer para a PCR pode ser realizado manualmente, se assim desejar; no entanto, recomenda-se o uso de software existente para essa finalidade (consulte a Tabela de Materiais).
1. Projeto do primer pirosequenciante e seleção do ensaio
- Obtenção de candidatos a cartilha com software
- Obter um arquivo de sequência de mtDNA para a espécie a ser genotipada e identificar a posição do SNP. Assegurar que a sequência de referência utilizada empregue a numeração de base apropriada para a mutação estudada, de modo a que a posição do SNP possa ser facilmente identificada.
- Copie 1.000 pares de bases a montante e a jusante do site SNP e cole a sequência truncada no software destinado ao design do primer pirosequenciante (consulte a Tabela de Materiais).
- Defina a base SNP analisada como o alvo do ensaio de pirosequenciamento no software, destacando a base polimórfica e clicando com o botão direito do mouse e selecionando a região de destino definida.
- Pressione o ícone de reprodução no canto superior direito da interface para iniciar a seleção de primer.
- Aguarde que o software gere automaticamente trios de primers: dois primers para pré-amplificação do DNA molde e um terceiro primer para sequenciamento por síntese na máquina pirosequenciadora. Retenha todos os conjuntos de primers clicando com o botão direito do mouse e selecionando copiar todos os conjuntos de primers.
- Selecionando os conjuntos de primers ideais da lista gerada
- Retenha os conjuntos de primers com a pontuação de qualidade mais alta com base na saída do software, que fornece conjuntos de primers em ordem decrescente com base no índice de qualidade. Se possível, omita conjuntos de primers com pontuação abaixo de 80.
- Para os conjuntos de primers retidos, identifique e copie o amplicon produzido pelos primers de amplificação.
- Alinhar os amplicons produzidos com todo o genoma do organismo a ser genotipado usando NCBI Blast usando o portal de submissão on-line em https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Nos menus suspensos durante o envio, selecione o seguinte:
- Selecionar banco de dados | Bases de dados genômica + transcrição.
- Selecione Humano ou Mouse no menu suspenso, dependendo do SNP analisado.
- Selecione Otimizar para | Sequências um pouco semelhantes (Blastn).
- (Opcional) Se genotipar um organismo que não seja um rato ou um ser humano, seleccione o seguinte durante a submissão:
- Selecionar banco de dados | Banco de dados padrão.
- Selecione Genomas RefSeq Representativos no menu suspenso
- Selecione Otimizar para | Sequências um pouco semelhantes (Blastn)
- Quando possível, omitir quaisquer amplicons que tenham perfeita homologia com o amplicon do mtDNA, particularmente se as regiões de ligação do primer forem perfeitamente homólogas (veja a discussão).
NOTA: A ferramenta de alinhamento BLAST retornará qualquer sequência com homologia considerável para os amplicons de pré-amplificação. Isso permite a detecção dos NUMTs descritos na introdução, que se não forem contabilizados, podem induzir um viés, pois são co-amplificados com o DNA mitocondrial. - Encomende os oligos obtidos através deste pipeline. Certifique-se de que a modificação da biotina 5' seja adicionada ao primer de amplificação correto durante a ordem de síntese, de modo que o primer de sequenciamento seja complementar à fita biotinilada.
NOTA: A escolha do primer de sequenciamento é mais flexível do que os primers de amplificação, e recomenda-se ter pelo menos uma base separando a extremidade 3' do primer de sequenciamento e a posição variável.
2. Otimização da PCR pré-amplificação
- Preparar as amostras de ADN extraindo o ADN genómico total utilizando um método adequado.
NOTA: Isso dependerá em grande parte do número de células que estão sendo genotipadas e sua origem. Se isolar o ADN de células individuais utilizando um tampão de lise contendo proteinase K, a amostra deve ser desnaturada a 95 °C durante 10 minutos para não perturbar a polimerase durante a PCR subsequente. - Configuração de PCR e configurações de bloco térmico
- Configure o PCR com uma polimerase de alta fidelidade de escolha. Prepare um Master Mix para quatro reações. Como são necessários apenas 10 μL de reação de PCR para uma corrida de pirosequenciamento, prepare 25 μL de reações de PCR (para permitir uma repetição técnica, se necessário). Use 40 ciclos de PCR com aproximadamente 10 ng de DNA genômico como material de partida com 1 μM dos primers forward e reverse.
- Ajuste o tempo de extensão de acordo com as especificações do fabricante para a polimerase utilizada, levando em consideração o comprimento dos primers de pré-amplificação escolhidos.
- Use um termociclador com configurações de temperatura de recozimento variáveis. Como a temperatura de recozimento pode diferir dependendo da sequência do primer, do teor de sal do tampão polimerase e de outros fatores, programe quatro temperaturas de recozimento diferentes no programa de ciclagem térmica.
NOTA: O exemplo trabalhado nos resultados representativos utilizou as seguintes temperaturas: 55 °C, 60 °C, 65 °C e 70 °C. - Divida a mistura mestra em quatro tubos de PCR de 200 μL e configure-os para funcionar em cada uma das quatro temperaturas de recozimento selecionadas no termociclador por 40 ciclos.
- Visualização da banda de pré-amplificação
- Durante a execução da PCR, preparar um gel de agarose a 2% (p/v) em 1x TBE com SYBR Safe ou brometo de etídio como agente visualizador.
NOTA: Um gel de porcentagem mais alta é recomendado para visualização, pois os fragmentos amplificados são geralmente curtos, variando tipicamente de 100 a 500 pares de bases. - Após a PCR na etapa 2.2 estar completa, misturar 10 μL da reação com uma quantidade apropriada de tampão de carga de DNA e executar no gel de agarose a 2% a 7 V/cm por aproximadamente 45 min.
- Visualize os fragmentos de DNA resultantes em um transiluminador UV.
NOTA: As condições de ciclagem térmica selecionadas para a etapa de pré-amplificação devem produzir uma única banda limpa do tamanho esperado. Temperaturas de recozimento mais baixas podem ocasionalmente resultar em amplificação fora do alvo, o que pode introduzir vieses para o pirosequenciamento subsequente. - Selecione a temperatura de recozimento mais baixa que produza uma banda limpa do tamanho correto para amplificações subsequentes.
- (Opcional) Excisar uma faixa do tamanho esperado, purificar usando um kit de extração em gel de escolha e analisar por sequenciamento de Sanger para confirmar a heteroplasmia aproximada da amostra como referência.
- Durante a execução da PCR, preparar um gel de agarose a 2% (p/v) em 1x TBE com SYBR Safe ou brometo de etídio como agente visualizador.
3. Configuração e execução do instrumento
NOTA: Uma vez que a etapa de PCR na seção anterior é otimizada, a próxima etapa envolve a programação do pirosequenciador com a sequência de nucleotídeos correta para analisar o SNP específico. Isso envolve entrar 10 bases diretamente a jusante da extremidade 3' do primer de sequenciamento. Isso é detalhado na seção a seguir.
- Configuração do ensaio
- Abra o software de execução fornecido com o pirosequenciador e selecione Novo ensaio no canto superior esquerdo da interface.
- Selecione o modelo de ensaio de quantificação de alelos .
- Insira a Sequência a ser analisada na caixa correspondente digitando os nucleotídeos a serem incorporados diretamente a jusante do primer de sequenciamento, que deve estar a montante do SNP de interesse. Para a posição variável, denote as duas bases possíveis separadas por uma barra (por exemplo, A/T).
- Pressione Gerar ordem de dispensação e deixe que o software determine automaticamente uma ordem adequada para os nucleotídeos a serem dispensados na reação de sequenciamento por síntese.
- Salve e forneça um nome para o ensaio.
- Preparação e armazenamento de reagentes
- Diluir o primer de sequenciamento ordenado a 4 μM no tampão de recozimento fornecido no kit de reagentes pirosequenciadores.
NOTA: O primer de sequenciamento pode primeiro ser diluído em água até 100 μM como uma solução estoque e, posteriormente, diluído em tampão de recozimento para 4 μM, conforme necessário. - Preparação e manuseio de enzimas e substratos
- Ao primeiro desencaixotar, dissolva novamente a enzima liofilizada e o substrato de acordo com as recomendações do fabricante. Conservar a -20 °C quando não estiver a ser utilizado.
- Após a utilização subsequente, descongelar os frascos para injetáveis de enzima e substrato a -20 °C.
NOTA: Todos os outros reagentes do kit fornecido podem ser mantidos refrigerados a 4 °C. Os primers de sequenciamento diluídos também podem ser mantidos a 4 °C.
- Coloque a quantidade necessária de cada reagente no gelo.
- Mantenha os restantes componentes necessários, nomeadamente as esferas magnéticas revestidas de estreptavidina, as tiras absorvedoras e os discos pirosequenciantes, a 4 °C.
- Diluir o primer de sequenciamento ordenado a 4 μM no tampão de recozimento fornecido no kit de reagentes pirosequenciadores.
- Executar execução
NOTA: Quando um ensaio é projetado pela primeira vez, ele deve ser calibrado usando produtos de PCR de heteroplasmia conhecida, o que garante que o ensaio possa distinguir com precisão heteroplasmias. Os pesquisadores podem usar misturas de produtos de PCR de heteroplasmia conhecida como padrões. As amostras também podem ser verificadas por outros métodos mencionados na introdução e na discussão, notadamente NGS.- Diluir o DNA a ser analisado para 5 ng/μL. Particularmente na primeira execução, certifique-se de incluir amostras de heteroplasmia conhecida como referência e/ou amostras de tipo selvagem.
- Realizar uma PCR pré-sequencial de 5 μL de ADN diluído em reações de 25 μL utilizando os primers de amplificação e parâmetros identificados nas secções 1 e 2. Realizar réplicas técnicas de PCR para cada amostra.
NOTA: A PCR de pré-amplificação pode ser armazenada a curto prazo a 4 °C ou a longo prazo a -20 °C antes de prosseguir para o sequenciamento. - Executar a instalação do arquivo
- Selecione Nova execução no canto superior esquerdo do software pirosequenciador.
- O pirosequenciador pode sequenciar simultaneamente 48 reações pré-amplificadas separadas, com um quadrado vazio representando um único poço de sequenciamento em um disco pirosequenciador. Carregue os ensaios configurados na seção 3.1 clicando com o botão direito do mouse em um quadrado e selecionando carregar ensaio. Se necessário, sequencie até quatro ensaios separados com iniciadores de sequenciamento diferentes.
- Defina o modo de dispensação do primer como Automático para atribuir automaticamente uma câmara de injeção para cada primer de sequenciamento usado para a execução.
- Defina o modo de execução como Padrão , a menos que execute quatro tipos diferentes de ensaios em um disco de sequenciamento.
- Verifique se o número de ensaios no arquivo de modelo de execução corresponde ao número de reações de PCR que estão sendo amplificadas.
Observação : se estiver executando mais de 48 exemplos, arquivos de execução adicionais precisarão ser configurados. - Salve os arquivos executados em uma unidade USB.
- Escorvamento do pirosequenciador
- Pressione o botão Limpeza na tela principal sensível ao toque do dispositivo e limpe todos os injetores com água de alta pureza seguindo as instruções na tela. Ao inserir a tira absorvedora na máquina, certifique-se de que as extremidades se encontram na posição "9 horas" (diretamente à esquerda do centro).
- Conecte o pendrive com as execuções configuradas na etapa 3.3.3 e carregue os arquivos de execução definidos na etapa 3.3.3.
Observação : os arquivos executados devem ser salvos fora de qualquer diretório ou pasta no USB ou eles não podem ser lidos pelo computador. - Siga as instruções no dispositivo para carregar e colocar os reagentes conforme necessário nos injetores correspondentes na máquina.
- Preparação do disco de amostra e lançamento do ensaio
- Permita que as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina se equilibrem à temperatura ambiente.
NOTA: Estas contas permitirão que o dispositivo capture a fita biotinilada da etapa de PCR de pré-amplificação. Eles precisam ser adquiridos separadamente do kit. - Carregue 3 μL de contas nos poços definidos no arquivo de execução da etapa 3.3.3.
- Carregar 10 μL de cada reação de PCR a ser sequenciada na amostra correspondente e pipetar para cima e para baixo para misturar a amostra com as esferas magnéticas. Evite bolhas, se possível.
- Procure a indicação no pirosequenciador preparado de que o disco pode ser carregado na máquina. Desparafuse a porca de retenção da placa antes de alinhar a placa de amostra carregada com o pino de metal no compartimento do disco.
- Uma vez que a placa está firmemente parafusada no compartimento da placa, inicie a execução de sequenciamento pressionando o botão de início na interface da tela sensível ao toque.
- Permita que as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina se equilibrem à temperatura ambiente.
4. Aquisição de resultados
- Quando a execução estiver concluída, remova a unidade USB da máquina e conecte-a novamente ao computador que executa o software pirosequenciador. Ao prosseguir com as etapas a seguir, prossiga com a limpeza do pirosequenciador seguindo as instruções, se for a última corrida do dia.
- Aguarde até que o arquivo de execução recém-gerado apareça na unidade USB e clique duas vezes no arquivo de resultado da execução. Isso analisa automaticamente a saída de luciferase de cada poço após a incorporação de nucleotídeos e quantifica o alelo mitocondrial de interesse definido durante a configuração do ensaio na seção 3.1.
- Procure as seguintes pontuações de cores mostradas pelo software com base na qualidade das leituras. Azul indica uma execução ideal, amarelo uma execução com um aviso e vermelho uma execução com falha. Para salvar os resultados, selecione Relatórios na janela superior | Relatório completo para gerar um arquivo .pdf contendo os pirogramas e resultados de cada poço da corrida. Como alternativa, baixe os resultados em outros formatos na guia Relatórios .
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Representative Results
Esta seção apresenta um exemplo de otimização de um ensaio de pirosequenciamento para uma mutação patogênica humana no mtDNA, bem como dados de sequenciamento da genotipagem de fibroblastos embrionários (MEFs) heteroplasmáticos (m.5024C>T) tratados com nucleases mitocondriais de dedo de zinco (mtZFNs). A otimização do ensaio para células humanas e a comparação de dois ensaios diferentes demonstram como selecionar o mais preciso, enquanto a genotipagem de células MEF geneticamente modificadas no segundo exemplo serve como um exemplo aplicado de detecção de mudanças heteroplasmáticas após a intervenção da terapia gênica.
Mutação humana m.3243A>G
Este exemplo ilustra a genotipagem de uma variante patogênica comum do mtDNA-m.3243A>G. A mutação comum m.3243A>G está subjacente a várias doenças clínicas, notadamente encefalopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios semelhantes a acidente vascular cerebral (MELAS), surdez e diabetes hereditários maternos (MIDD) e oftalmoplegia externa progressiva (OPE)23. Este ensaio também pode ser usado para genotipar a variante24 m.3243A>T menos comum, reprogramando a sequência de nucleotídeos a serem incorporados, conforme descrito na seção 3.1.3 do protocolo.
Seguindo as diretrizes de otimização de primers na seção 1, os seguintes conjuntos de primers foram selecionados, um para cada vertente:
Ensaio 1:
Avançado: 5' - [Biotina] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Reverso: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Sequência: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'
Amplicon tamanho: 215 bp
Ensaio 2:
Avançado: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Reverso: 5' - [Biotina] GTTGGCCATGGGTATGTTGTT- 3'
Sequenciamento: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'
Tamanho Amplicon: 182 bp
Para determinar as condições de ciclagem térmica para o ensaio, uma PCR de gradiente térmico usando uma polimerase de partida a quente (ver Tabela de Materiais) foi primeiramente realizada e analisada por eletroforese, seguindo a seção 2. Quarenta ciclos foram usados para amplificar aproximadamente 10 ng de DNA como molde inicial. Após os passos do item 2.3 do protocolo, foi realizada eletroforese em gel de agarose para verificar a especificidade do protocolo de amplificação em uma dada temperatura de anelamento (Figura 2A). Bandas bem-sucedidas dos tamanhos corretos (215 pb ou 182 pb) puderam ser observadas em todas as temperaturas; no entanto, as temperaturas de anelamento mais baixas no ensaio 1 resultaram em amplificação fora do alvo. A temperatura de anelamento adequada para pré-amplificação foi estabelecida em 70 °C (Figura 2A). Para determinar a acurácia de ambos os ensaios e escolher o melhor, padrões molares de porcentagem conhecida de m.3243A>G foram gerados pela mistura de volumes apropriados do produto puro da PCR em várias proporções: 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% e 100% de m.3243A>G, respectivamente (Figura 2B, linha pontilhada). Ao realizarmos ambos os ensaios nos padrões, observamos maior correlação com o resultado esperado no Ensaio 2 (Figura 2B). Em seguida, usamos ambos os ensaios em células cybrid m.3243A>G em um experimento de genotipagem e observamos um viés pronunciado no ensaio 1, particularmente perto de condições homoplasmáticas (Figura 2C).
Mutação murina m.5024C>T
Este exemplo envolve células MEF tratadas com mtZFNs desenvolvidas para diminuir o nível da mutação m.5024C>T12 como um exemplo de um experimento de terapia gênica mitocondrial onde a genotipagem por pirosequenciamento é útil como uma comparação quantitativa entre amostras. As células MEF são derivadas de um modelo publicado em camundongos que abriga uma mutação C>T na posição 5.024 no mtDNA de camundongos (m.5024C>T)25. O experimento envolveu a eletroporação dos MEFs com plasmídeos que codificam mtZFNs e diferentes repórteres fluorescentes e, posteriormente, a classificação das células que expressam os plasmídeos por FACS após 24 h. As células foram então deixadas se recuperar por 2 semanas antes da comparação de heteroplasmia por pirosequenciamento.
O conjunto de primers utilizado para sequenciar a posição m.5024C>T foi o seguinte:
Avançado: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Reverso: 5' - [Biotina] GCAAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
Sequenciamento: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'
Tamanho Amplicon: 267 bp
As amostras foram sequenciadas em triplicata técnica para aumentar a fidelidade dos resultados. O experimento também foi realizado em duplicata biológica, obtendo-se seis valores distintos para cada uma das condições (Figura 3B). Os dados de 2 dos 18 pirogramas foram utilizados para construir a Figura 3B; esses pirogramas são apresentados na Figura 3A.
Figura 1: Esquemas que representam sequências mitocondriais em uma célula e o esboço técnico geral do pirosequenciamento . (A) Representação esquemática do DNA mitocondrial e sequências mitocondriais nucleares. A figura representa a origem evolutiva das sequências de alta homologia. (B) Representação esquemática do pipeline de ensaio de pirosequenciamento com uma sequência de exemplo final representando um valor aproximado de 50% de heteroplasmia C>G. O DNA molde é primeiramente amplificado por primers de amplificação selecionados, um dos quais é biotinilado na extremidade 5'. Após a amplificação, o pirosequenciador retém uma única fita de DNA como molde para sequenciamento usando esferas magnéticas revestidas com estreptavidina, mostradas em azul. Por fim, um primer sequencial permite o sequenciamento por síntese de uma série predefinida de nucleotídeos, gerando um pirograma que é esquematicamente representado. As estequiometrias de cada base são facilmente obtidas comparando-se as alturas relativas dos picos em cada evento de incorporação: o mesmo nucleotídeo duas vezes seguidas gerará um pico duplo em comparação com uma única base. A barra na sequência a ser analisada denota o SNP hipotético, que poderia ser "C" ou "G". Observe a dispensação inicial de uma base "G" simulada no eixo x do pirograma, que é tipicamente realizada pelo pirosequenciador como um controle negativo. Abreviações: mtDNA = DNA mitocondrial; NUMTs = sequências mitocondriais nucleares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Otimização do conjunto de primers pirosequenciadores conforme ilustrado na mutação m.3242A>G humana. (A) Eletroforese em gel de agarose (2% p/v) de uma amplificação por PCR usando os primers de amplificação de ambos os conjuntos selecionados para a mutação m.3242A>G. WT denota DNA controle selvagem, enquanto Het é a amostra m.3243A>G quase homoplasmática a ser analisada. As temperaturas são a temperatura de recozimento usada em uma reação de PCR de 40 ciclos. (B). Uma comparação do desempenho de ambos os conjuntos de primers usando padrões molares para calibração, os quais foram obtidos pela mistura de várias proporções do produto m3243A>G puro selvagem e mutante puro. Os valores medidos são indicados pelas linhas pontilhadas verticais. Uma função linear X = Y é exibida para ilustrar o quão próximo cada um dos dois ensaios testados está de uma medida ideal. Os nomes das linhagens celulares no eixo x são os nomes dos vários clones de cybrid que foram genotipados usando este ensaio. (C) Resultados de genotipagem em quatro clones de cybrid de heteroplasmia m.3243A>G desconhecida usando ambos os ensaios. O sequenciamento foi realizado em triplicata técnica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medição de heteroplasmia em MEFs m.5024C>T classificados por FACS tratados com tecnologia de edição de genes mtZFN. (A) Pirogramas de duas réplicas de PCR de amostra de células MEF usadas para gerar a Figura 3B, bem como o controle de genotipagem selvagem. Os valores de luminescência no eixo Y estão nos resultados da genotipagem de células tratadas com mtZFN em A.U. (B), juntamente com controles não tratados e tratados simuladamente. Os MEFs foram eletroporados com plasmídeos que codificam mtZFNs e diferentes repórteres fluorescentes e posteriormente classificados por FACS após 24 h. As células foram então deixadas se recuperar por 2 semanas antes da comparação de heteroplasmia por pirosequenciamento. As barras de erro foram calculadas com duplicatas biológicas, cada uma das quais foi submetida a pirosequenciamento em triplicata técnica. Abreviações: FACS = fluorescence-activated cell sorting; MEFs = fibroblastos embrionários de camundongos; mtZFN = nuclease mitocondrial do dedo de zinco; U.A. = unidades arbitrárias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Um aspecto crítico para o sucesso do protocolo é evitar contaminações, especialmente quando se utilizam baixas quantidades de material de partida. Recomenda-se o uso de uma capa UV e pontas de pipeta filtradas ao preparar as amostras sempre que possível, bem como manter as áreas de pré-amplificação e pós-amplificação separadas. Medições em branco e amostras de heteroplasmia conhecida (como DNA selvagem) devem sempre ser incluídas para serem usadas como referência para verificar vieses técnicos ou biológicos.
Um viés técnico digno de nota inerente ao ensaio é o aumento do sinal luminescente produzido pela incorporação analógica de adenina. Quando a adenina é usada em uma posição variável, geralmente produz um pico fluorescente residual (por exemplo, Figura 2C). É por esta razão que se recomenda executar ensaios de pirosequenciamento na fita oposta (onde uma timina será incorporada), quando possível para evitar ter que incorporar o análogo de adenina na posição variável. No entanto, no caso de mutações A>T ou T>A, isso é impossível. No entanto, como evidenciado nos resultados representativos, uma escolha adequada de primers pode ser de maior importância no desenho de um ensaio. Ensaio 2 para a mutação m.3243A>G, na primeira seção dos resultados representativos, sequências baseadas na relação A/G na posição variável em contraste com o ensaio 1, que mede a relação T/C. Apesar de ser suscetível ao viés de incorporação de adenina, o ensaio 2 apresenta resultados mais precisos a partir da comparação com os padrões molares, como mostrado por uma análise de regressão linear simples (Figura 2B).
Os vieses são primariamente o resultado da co-amplificação do NUMT3. O grande número de cópias mitocondriais tipicamente impede que sequências nucleares fora do alvo introduzam qualquer viés significativo; no entanto, certas regiões do mtDNA estão presentes em muitos NUMTS e devem ser evitadas usando os métodos indicados no protocolo na seção 1.
Ao tomar as precauções acima mencionadas, este método é um meio altamente modular, rápido e custo-efetivo de genotipagem de SNPs no mtDNA. No entanto, o método não é adequado para todas as aplicações de genotipagem mitocondrial, notadamente, deleções em larga escala para as quais a PCR digital em gotículas é recomendada26. A variabilidade na dispensação de reagentes pelo sequenciador ou diferentes condições de primers/amplificação pode levar à introdução de pequenos vieses. É por esta razão que as triplicatas técnicas são geralmente recomendadas para confirmar a veracidade dos resultados da genotipagem. Outra limitação da abordagem é a abrangência, uma vez que apenas extensões curtas e predefinidas de mtDNA podem ser genotipadas. Embora os pirosequenciadores possam ser programados para sequenciar centenas de pares de bases de sequências desconhecidas, isso rapidamente se torna menos econômico do que usar uma abordagem NGS. Os pesquisadores poderiam inicialmente implementar o pirosequenciamento como um método de genotipagem rápida que produz uma resposta quantitativa precisa, mas poderiam posteriormente analisar amostras escolhidas pelo NGS para maior precisão e contexto.
Em conclusão, este método bem estabelecido permanece um grampo na pesquisa genética mitocondrial, fornecendo acesso rápido e simples a medidas quantitativas de heteroplasmia que são fundamentais em muitos contextos de pesquisa na área, como diagnóstico de pacientes, terapia gênica ou genotipagem de modelos animais.
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Disclosures
M.M. é cofundador, acionista e membro do Conselho Consultivo Científico da Pretzel Therapeutics, Inc. e P.A.N. prestam serviços de consultoria para a Pretzel Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Silvia Marchet e Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milão) pela preparação e fornecimento das células cybrid m.3243A>G usadas como exemplos ilustrativos para este protocolo. Gostaríamos também de agradecer aos membros do Grupo de Genética Mitocondrial (MRC-MBU, Universidade de Cambridge) pela discussão útil durante o curso desta pesquisa. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento principal do Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 e MC_UU_00028/3). P.A.N. e P.S.-P. são adicionalmente apoiados pela The Lily Foundation e The Champ Foundation, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
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