Summary
Пиросеквенирующие анализы обеспечивают надежное и быстрое генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов митохондриальной ДНК в гетероплазматических клетках или тканях.
Abstract
Мутации в митохондриальном геноме (мтДНК) были связаны с генетическими заболеваниями, унаследованными по материнской линии. Тем не менее, интерес к полиморфизмам мтДНК возрос в последние годы из-за недавно разработанной способности создавать модели с помощью мутагенеза мтДНК и нового понимания связи между митохондриальными генетическими аберрациями и распространенными возрастными заболеваниями, такими как рак, диабет и деменция. Пиросеквенирование — это метод секвенирования путем синтеза, который широко используется в митохондриальном поле для рутинных экспериментов по генотипированию. Его относительная доступность по сравнению с методами массового параллельного секвенирования и простота реализации делают его бесценным методом в области митохондриальной генетики, позволяя быстро количественно определять гетероплазмию с повышенной гибкостью. Несмотря на практичность этого метода, его реализация в качестве средства генотипирования мтДНК требует соблюдения определенных руководящих принципов, в частности, чтобы избежать определенных предубеждений биологического или технического происхождения. В этом протоколе изложены необходимые шаги и меры предосторожности при разработке и внедрении пиросеквенирующих анализов для использования в контексте измерения гетероплазмии.
Introduction
Митохондриальный геном существует в виде небольших (16,5 кб) кольцевых молекул (мтДНК), присутствующих во внутреннем компартменте митохондрий, называемом матрицей, и кодирует 13 субъединиц митохондриальной дыхательной цепи, а также тРНК и рРНК, необходимых для их трансляции in situ митохондриальной рибосомой1. Этот геном составляет примерно 1% всех белков, необходимых для функции митохондрий, остальная часть которых кодируется ядерной ДНК (нДНК). Обычно предполагается, что митохондрии происходят в результате эндосимбиотического слияния между альфа-протеобактериальным предком и предковой эукариотической клеткой. Как только этот гипотетический симбиоз произошел, генетическая информация митохондрий постепенно переносилась в ядро в течение эонов, что объясняет вышеупомянутую компактность мтДНК по сравнению с геномами современных цианобактерий2. Такой перенос генов наиболее убедительно подтверждается существованием длинных участков нДНК, которые высоко гомологичны последовательностям, обнаруженным в мтДНК. Эти ядерные митохондриальные последовательности (NUMT) являются распространенным источником неправильной интерпретации во время генотипирования, и необходимо принять определенные меры предосторожности, чтобы избежать ядерных предубеждений при генотипировании мтДНК3 (рис. 1A).
Еще одной отличительной особенностью мтДНК является то, что количество ее копий варьируется в зависимости от типа клетки, насчитывая от десятков до тысяч копий на клетку4. Из-за этой природы множественных копий мтДНК может содержать широкий спектр генотипов в одной клетке, что может привести к более непрерывному распределению аллелей в отличие от дискретных аллелей, связанных с ядерными генами, при рассмотрении зиготности хромосом. Эта гетерогенность митохондриальных аллелей называется митохондриальной гетероплазмией, которая обычно выражается в процентной распространенности данной мутации в процентах от общего количества мтДНК в данной клетке. Гетероплазмию можно противопоставить гомоплазмии, которая относится к уникальному виду мтДНК, присутствующему в клетке.
Измерение митохондриальной гетероплазмии представляет особый интерес при количественном определении доли молекул мтДНК, содержащих патогенные варианты. Такие варианты бывают в виде однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), небольших инделов или крупномасштабных делеций5. Большинство людей гетероплазматичны в отношении патогенных вариантов; однако они не проявляют каких-либо клинических фенотипов, которые часто проявляются только при более высоких уровнях гетероплазмии патогенной мтДНК в явлении, называемом пороговым эффектом6. Хотя значения, связанные с патогенностью, сильно зависят от природы патогенной мутации и ткани, в которой она происходит, они обычно лежат выше 60% гетероплазмии7.
Существует несколько областей исследований, в которых распространено митохондриальное генотипирование. В области медицины тестирование или количественная оценка мутаций мтДНК может служить диагностическим критерием митохондриальных заболеваний, многие из которых имеют аберрации мтДНК в качестве источника5. В дополнение к изучению патогенных мутаций человека, распространенность животных моделей, содержащих патогенные SNP в мтДНК, вероятно, увеличится, учитывая недавнее появление редактирования митохондриальных оснований, обеспечиваемого митохондриально целевыми редакторами цитозиновых оснований, полученных из DddA (DdCBE)8, и деаминазами на основе TALE (TALED) для редактирования адениновых оснований9. Этот подход будет играть важную роль в понимании взаимодействия между аберрантными митохондриальными генотипами и возникающими в результате дисфункциями. Также продолжаются научные исследования по ремоделированию митохондриального генома для конечного использования в качестве терапевтической стратегии при митохондриальных заболеваниях человека с помощью подхода, известного как сдвиг гетероплазмии. Эта область исследований в первую очередь включает направление мутационно-специфических нуклеаз в митохондриальный матрикс; это приводит к преимущественной деградации патогенной мтДНК, что приводит к спасению фенотипа10,11,12,13. Любые эксперименты, связанные с ремоделированием митохондриального генотипа, требуют надежного количественного метода для оценки сдвигов гетероплазмии.
Для генотипирования мтДНК используется широкий спектр методов, которые варьируются в зависимости от характера мутации. Методы секвенирования следующего поколения (NGS) более точны, когда речь идет о количественном определении SNP в мтДНК; Однако эти методы остаются непомерно дорогими для рутинной количественной оценки митохондриальной гетероплазмии, особенно если количество образцов невелико. Секвенирование по Сэнгеру также может позволить обнаруживать SNP; Однако этот подход не является количественным и часто не позволяет обнаружить низкие уровни гетероплазмии или может быть неточным при оценке высоких гетероплазмий. Пиросеквенирование, как анализ, который включает минимальную подготовку и позволяет быстро количественно определить гетероплазмию для любого образца мтДНК, предлагается в качестве подходящего компромисса между этими двумя крайностями. Этот метод регулярно использовался для количественной оценки митохондриальных SNP многочисленными исследователями в различных контекстах, включая судебно-медицинский анализ 14,15, клинический диагноз16 или генотипирование мтДНК из отдельных клеток17.
Этот анализ включает в себя первый этап преамплификации ПЦР области, фланкирующей SNP в мтДНК, за которым следует анализ секвенирования путем синтеза с использованием одной цепи ранее сгенерированного ампликона. Один из двух праймеров, используемых на стадии преамплификации, должен быть биотинилирован на 5'-конце, что позволит пиросеквенирующему аппарату изолировать одну цепь ДНК, которая будет использоваться в качестве матрицы для реакции секвенирования. Затем третий праймер для секвенирования отжигают на сохраненную биотинилированную цепь, что позволяет зарождающемуся синтезу ДНК в виде дезоксинуклеотидов распределяться в заранее определенном порядке в реакционную камеру. Пиросеквенсор записывает количество каждого включенного основания на основе люминесцентного считывания, что позволяет проводить относительную количественную оценку мутантных и митохондриальных аллелей дикого типа при синтезе ДНК (рис. 1B). Люминесценция генерируется ферментом люциферазы, который излучает свет в присутствии АТФ, который АТФ-сульфурилаза синтезирует de novo при каждом событии включения из пирофосфатов, высвобождаемых каждым нуклеотидом. Эти две реакции можно резюмировать следующим образом:
1. PPi (от включения нуклеотидов) + APS → АТФ + сульфат (АТФ-сульфурилаза)
2. АТФ + люциферин + О2 → АМФ + РРi + оксилюциферин +СО2 + свет (люцифераза)
Обнаружение адениновых оснований пиросеквенсором без перекрестной реакции АТФ с люциферазой во второй реакции является сложной задачей. Однако это решается с помощью аналога аденина для синтеза ДНК, а именно dATPαS. Несмотря на то, что он не является идеальным субстратом для люциферазы, он производит более сильную люминесценцию по сравнению с тремя другими нуклеотидами, которая регулируется пиросеквенсором в цифровом виде и устанавливается на коэффициент 0,9. Из-за этой присущей изменчивости рекомендуется избегать секвенирования аденина в положении SNP (см. обсуждение для получения дополнительной информации).
В следующем протоколе подробно описывается метод оценки гетероплазмии мтДНК путем пиросеквенирования и излагаются необходимые меры предосторожности при разработке амплификационных праймеров, чтобы избежать биологической или технической предвзятости при генотипировании SNP в мтДНК. Последнее включает в себя цифровую съемку и выбор наборов праймеров, оптимизацию ПЦР с предварительной амплификацией и, наконец, секвенирование и уточнение анализа. Продемонстрированы два прикладных примера: во-первых, оптимизация наиболее распространенного патогенного варианта человека m.3243A>G18 и, во-вторых, генотипирование клеток эмбриональных фибробластов мыши (MEF), подвергшихся гетероплазменному сдвигу, с использованием технологий, разработанных в лаборатории Минчука в Кембридже 10,11,12,19,20,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Было предоставлено информированное согласие на использование клеток кибридов человека 3243A>G и иммортализированных MEF m.5024C>T, используемых в этом исследовании. В этом случае не требовалось этического одобрения, поскольку клетки пациентов не были собраны в Кембриджском университете. Однако использование фибробластов человека может потребовать этического одобрения. Настоятельно рекомендуется следовать рекомендациям по настройке ПЦР при подготовке образца ДНК к пиросеквенированию. Частая амплификация с использованием идентичных праймеров может привести к контаминации ампликонов и внести смещение в последующее генотипирование, если не наблюдается строгого разделения между областями до и после ПЦР. В представленном здесь трубопроводе используется специальное оборудование от одного производителя; подробности можно найти в Таблице материалов. Дизайн праймера для ПЦР может быть выполнен вручную при желании; однако для этой цели рекомендуется использовать существующее программное обеспечение (см. Таблицу материалов).
1. Проектирование пиросеквенирующей грунтовки и выбор анализа
- Получение кандидатов в праймеры с помощью программного обеспечения
- Получите файл последовательности мтДНК для генотипируемого вида и определите положение SNP. Убедитесь, что используемая эталонная последовательность использует соответствующую базовую нумерацию для изучаемой мутации, чтобы можно было легко идентифицировать положение SNP.
- Скопируйте 1000 пар оснований вверх и вниз по течению от сайта SNP и вставьте усеченную последовательность в программное обеспечение, предназначенное для проектирования пиросеквенирующей грунтовки (см. Таблицу материалов).
- Установите проанализированное основание SNP в качестве цели анализа пиросеквенирования в программном обеспечении, выделив полиморфное основание, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав « Установить целевую область».
- Нажмите значок воспроизведения в правом верхнем углу интерфейса, чтобы запустить выбор праймера.
- Подождите, пока программное обеспечение автоматически сгенерирует трио праймеров: два праймера для предварительной амплификации матричной ДНК и третий праймер для секвенирования путем синтеза в пиросеквенирующей машине. Сохраните все наборы праймеров, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав « Копировать все наборы праймеров».
- Выбор оптимальных наборов грунтовок из сформированного списка
- Сохраняйте наборы праймеров с наивысшей оценкой качества на основе выходных данных программного обеспечения, которые предоставляют наборы праймеров в порядке убывания на основе оценки качества. Если возможно, опустите наборы праймеров с оценкой ниже 80.
- Для сохраненных наборов праймеров идентифицируйте и копируйте ампликон, полученный амплификационными праймерами.
- Согласуйте полученные ампликоны со всем геномом организма, подлежащего генотипированию, с помощью NCBI Blast с помощью онлайн-портала подачи заявок по адресу https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. В раскрывающихся меню во время отправки выберите следующее:
- Выберите База данных | Базы данных Genomic + Transcript.
- Выберите « Человек » или «Мышь » в раскрывающемся меню, в зависимости от анализируемого SNP.
- Выберите Оптимизировать для | Несколько похожие последовательности (Бластн).
- (Необязательно) При генотипировании организма, отличного от мыши или человека, во время отправки выберите следующее:
- Выберите База данных | Стандартная база данных.
- Выберите Репрезентативные геномы RefSeq в выпадающем меню
- Выберите Оптимизировать для | Несколько похожие последовательности (Blastn)
- По возможности опускайте ампликоны, которые имеют идеальную гомологию ампликону мтДНК, особенно если области связывания праймера совершенно гомологичны (см. обсуждение).
ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент выравнивания BLAST вернет любую последовательность со значительной гомологией в ампликоны предварительного усиления. Это позволяет обнаруживать NUMT, описанные во введении, которые, если их не учитывать, могут вызвать смещение, поскольку они амплифицированы совместно с митохондриальной ДНК. - Закажите олиго, полученные по этому трубопроводу. Убедитесь, что 5'-модификация биотина добавлена к правильному амплификационному праймеру во время порядка синтеза, так что праймер секвенирования будет комплементарен биотинилированной цепи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор праймера секвенирования является более гибким, чем праймеры усиления, и рекомендуется иметь по крайней мере одно основание, разделяющее 3'-конец праймера секвенирования и переменное положение.
2. Оптимизация ПЦР с предварительной амплификацией
- Подготовьте образцы ДНК путем извлечения общей геномной ДНК с использованием соответствующего метода.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет во многом зависеть от количества генотипируемых клеток и их происхождения. При выделении ДНК из отдельных клеток с использованием лизисного буфера, содержащего протеиназу К, образец необходимо денатурировать при 95 °C в течение 10 мин, чтобы не нарушить полимеразу при последующей ПЦР. - Настройка ПЦР и настройки термоблока
- Настройте ПЦР с полимеразой выбора высокой точности. Приготовьте мастер-микс для четырех реакций. Поскольку для пиросеквенирования требуется всего 10 мкл реакции ПЦР, подготовьте 25 мкл реакций ПЦР (чтобы при необходимости можно было провести технический повтор). Используйте 40 циклов ПЦР с примерно 10 нг геномной ДНК в качестве исходного материала с 1 мкМ как прямого, так и обратного праймеров.
- Установите время удлинения в соответствии со спецификациями производителя для используемой полимеразы, принимая во внимание длину выбранных праймеров предварительного усиления.
- Используйте термоциклер с переменной температурой отжига. Поскольку температура отжига может различаться в зависимости от последовательности грунтовки, содержания солей в полимеразном буфере и других факторов, запрограммируйте четыре различные температуры отжига в программу термоциклирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном примере в репрезентативных результатах использовались следующие температуры: 55 °C, 60 °C, 65 °C и 70 °C. - Разделите Master Mix на четыре ПЦР-пробирки по 200 мкл и настройте их на работу при каждой из четырех выбранных температур отжига в термоциклере в течение 40 циклов.
- Визуализация полосы предварительного усиления
- Во время проведения ПЦР приготовьте 2% (мас./об.) агарозный гель в 1x КЭ с SYBR Safe или бромидом этидия в качестве визуализирующего агента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации рекомендуется использовать гель с более высоким процентным содержанием, так как усиленные фрагменты обычно короткие, обычно от 100 до 500 пар оснований. - После завершения ПЦР на этапе 2.2 смешайте 10 мкл реакции с соответствующим количеством загрузочного буфера ДНК и проведите 2% агарозный гель при 7 об/см в течение примерно 45 мин.
- Визуализируйте полученные фрагменты ДНК на УФ-трансиллюминаторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия термоциклирования, выбранные для этапа предварительного усиления, должны давать одну чистую полосу ожидаемого размера. Более низкие температуры отжига могут иногда приводить к нецелевому усилению, что может привести к смещению при последующем пиросеквенировании. - Выберите самую низкую температуру отжига, при которой получается чистая полоса нужного размера для последующего усиления.
- (Необязательно) Иссеките полосу ожидаемого размера, очистите с помощью набора для экстракции геля по выбору и проанализируйте с помощью секвенирования Сэнгера, чтобы подтвердить приблизительную гетероплазмию образца в качестве эталона.
- Во время проведения ПЦР приготовьте 2% (мас./об.) агарозный гель в 1x КЭ с SYBR Safe или бромидом этидия в качестве визуализирующего агента.
3. Настройка и запуск прибора
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как этап ПЦР в предыдущем разделе оптимизирован, следующий шаг включает программирование пиросеквенсора с правильной нуклеотидной последовательностью для анализа конкретного SNP. Это включает в себя ввод 10 оснований непосредственно после 3'-конца праймера секвенирования. Это подробно описано в следующем разделе.
- Конфигурация анализа
- Откройте программное обеспечение для запуска, поставляемое с пиросеквенсором, и выберите « Новый анализ » в верхнем левом углу интерфейса.
- Выберите шаблон анализа количественного определения аллелей .
- Введите последовательность, подлежащую анализу, в соответствующее поле, введя нуклеотиды, которые должны быть включены непосредственно ниже по течению от праймера секвенирования, который должен находиться выше по течению от интересующего SNP. Для переменной позиции обозначьте два возможных основания, разделенных косой чертой (например, A/T).
- Нажмите «Создать порядок дозирования» и позвольте программному обеспечению автоматически определить подходящий порядок для нуклеотидов, которые будут распределяться в реакции секвенирования путем синтеза.
- Сохраните и укажите имя для анализа.
- Приготовление и хранение реагентов
- Разбавьте заказанный праймер для секвенирования до 4 мкМ в буфере для отжига, входящем в комплект реагентов пиросеквенсора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Праймер для секвенирования можно сначала разбавить в воде до 100 мкМ в качестве исходного раствора, а затем дополнительно разбавить в буфере для отжига до 4 мкМ по мере необходимости. - Подготовка и обработка ферментов и субстратов
- При первой распаковке повторно растворите лиофилизированный фермент и субстрат в соответствии с рекомендациями производителя. Хранить при температуре -20 ° C, когда он не используется.
- При последующем использовании разморозьте флаконы с ферментом и субстратом при температуре -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все остальные реагенты в прилагаемом наборе можно хранить в холодильнике при температуре 4 °C. Разбавленные праймеры для секвенирования также можно хранить при температуре 4 °C.
- Поместите необходимое количество каждого реагента на лед.
- Остальные необходимые компоненты, а именно магнитные шарики с покрытием стрептавидином, абсорбирующие полосы и пиросеквенирующие диски, храните при температуре 4 °C.
- Разбавьте заказанный праймер для секвенирования до 4 мкМ в буфере для отжига, входящем в комплект реагентов пиросеквенсора.
- Запуск выполнения
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда анализ впервые разрабатывается, он должен быть откалиброван с использованием продуктов ПЦР известной гетероплазмии, что гарантирует, что анализ может точно различать гетероплазмии. Исследователи могут использовать смеси продуктов ПЦР известной гетероплазмии в качестве стандартов. Образцы также могут быть проверены другими методами, упомянутыми во введении и обсуждении, в частности NGS.- Разбавьте анализируемую ДНК до 5 нг / мкл. В частности, при первом запуске обязательно включите образцы известной гетероплазмии в качестве эталонных образцов и/или образцов дикого типа.
- Проведите ПЦР с предварительным секвенированием 5 мкл разбавленной ДНК в реакциях 25 мкл с использованием амплификационных праймеров и параметров, указанных в разделах 1 и 2. Выполните технические репликации ПЦР для каждого образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Преамплификационная ПЦР может храниться краткосрочно при 4 ° C или в течение длительного времени при -20 ° C, прежде чем приступить к секвенированию. - Запустите программу настройки файла
- Выберите «Новый запуск» в верхнем левом углу программного обеспечения пиросеквенсора.
- Пиросеквенсор может одновременно секвенировать 48 отдельных предварительно усиленных реакций, при этом пустой квадрат представляет собой одну секвенирующую скважину на пиросеквенирующем диске. Загрузите анализы, настроенные в разделе 3.1, щелкнув правой кнопкой мыши квадрат и выбрав « Загрузить анализ». При необходимости секвенируйте до четырех отдельных анализов с разными праймерами секвенирования.
- Установите режим дозирования праймера на Автоматический , чтобы автоматически назначать камеру впрыска для каждого праймера секвенирования, используемого для прогона.
- Установите для параметра Режим выполнения значение Стандартный , если на одном диске виртуализации не выполняются четыре разных типа анализов.
- Убедитесь, что количество анализов в файле шаблона запуска совпадает с количеством амплируемых реакций ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если выполняется более 48 сэмплов, необходимо настроить дополнительные файлы запуска. - Сохраните запущенные файлы на USB-накопитель.
- Грунтовка пиросеквенсора
- Нажмите кнопку «Очистка » на главном сенсорном экране устройства и очистите все форсунки водой высокой чистоты, следуя инструкциям на экране. Вставляя полосу амортизатора в машину, убедитесь, что концы сходятся в положении «9 часов» (прямо слева от центра).
- Подключите USB-накопитель с запусками, настроенными на шаге 3.3.3, и загрузите файлы запуска, определенные на шаге 3.3.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запущенные файлы должны быть сохранены вне любого каталога или папки на USB, иначе они не могут быть прочитаны аппаратом. - Следуйте инструкциям на устройстве, чтобы загрузить и заправить реагенты по мере необходимости в соответствующие форсунки на машине.
- Подготовка диска с образцами и запуск анализа
- Дайте магнитным шарикам с покрытием стрептавидин уравновеситься до комнатной температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шарики позволят устройству захватывать биотинилированную цепь на этапе ПЦР с предварительной амплификацией. Их нужно приобретать отдельно от комплекта. - Загрузите 3 мкл шариков в лунки, определенные в файле запуска из шага 3.3.3.
- Загрузите 10 мкл каждой реакции ПЦР, которая должна быть секвенирована в соответствующий образец, и пипеткой вверх и вниз, чтобы смешать образец с магнитными шариками. По возможности избегайте пузырьков.
- Ищите в заправленном пиросеквенсоре индикацию того, что диск может быть загружен в машину. Отвинтите гайку, удерживающую пластину, прежде чем совмещеть загруженную пластину образца с металлическим штифтом в отсеке для диска.
- После того, как пластина плотно ввинчена в отсек пластины, запустите последовательность, нажав кнопку запуска на сенсорном интерфейсе.
- Дайте магнитным шарикам с покрытием стрептавидин уравновеситься до комнатной температуры.
4. Получение результата
- После завершения запуска извлеките USB-накопитель из машины и снова подключите его к компьютеру, на котором запущено программное обеспечение пиросеквенсора. Выполняя следующие шаги, приступайте к очистке пиросеквенсора, следуя подсказкам, если это последний запуск дня.
- Подождите, пока только что сгенерированный файл запуска появится на USB-накопителе, и дважды щелкните файл результата запуска. Это автоматически анализирует выход люциферазы из каждой лунки при включении нуклеотидов и количественно определяет интересующий митохондриальный аллель, определенный во время конфигурации анализа в разделе 3.1.
- Найдите следующие цветовые показатели, показанные программным обеспечением в зависимости от качества чтения. Синий цвет указывает на оптимальный запуск, желтый — на запуск с предупреждением, а красный — на неудачный запуск. Чтобы сохранить результаты, выберите Отчеты в верхнем окне | Полный отчет для создания файла .pdf, содержащего пирограммы и результаты из каждой скважины пробега. Кроме того, вы можете загрузить результаты в других форматах на вкладке «Отчеты ».
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом разделе представлен пример оптимизации пиросеквенирующего анализа патогенной мутации мтДНК человека, а также данные секвенирования генотипирования гетероплазматических (m.5024C>T) эмбриональных фибробластов (MEF) мышей, обработанных митохондриальными нуклеазами цинкового пальца (mtZFN). Оптимизация анализа для клеток человека и сравнение двух разных анализов демонстрирует, как выбрать наиболее точный, тогда как генотипирование генетически модифицированных клеток MEF во втором примере служит прикладным примером обнаружения сдвигов гетероплазмии после вмешательства генной терапии.
Человеческая мутация m.3243A>G
Этот пример иллюстрирует генотипирование распространенного патогенного варианта мтДНК-m.3243A>G. Распространенная мутация m.3243A>G лежит в основе нескольких клинических заболеваний, в частности митохондриальной энцефалопатии, лактоацидоза и инсультоподобных эпизодов (MELAS), глухоты и диабета по материнской линии (MIDD) и прогрессирующей наружной офтальмоплегии (PEO)23. Этот анализ также может быть использован для генотипирования менее распространенного варианта24 m.3243A>T путем перепрограммирования последовательности нуклеотидов, подлежащих включению, как описано в разделе 3.1.3 протокола.
В соответствии с рекомендациями по оптимизации праймеров, приведенными в разделе 1, были выбраны следующие наборы праймеров, по одному для каждой нити:
Анализ 1:
Нападающий: 5' - [Биотин] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Реверс: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Последовательность действий: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'
Размер ампликона: 215.н.
Анализ 2:
Нападающий: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Реверс: 5' - [Биотин] GTTGGCCATGGGTATGTGTGTT- 3'
Последовательность: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'
Размер ампликона: 182.н.
Для определения условий термоциклирования для анализа сначала проводили термоградиентную ПЦР с использованием полимеразы горячего старта (см. Таблицу материалов) и анализировали с помощью электрофореза в соответствии с разделом 2. Сорок циклов были использованы для амплификации примерно 10 нг ДНК в качестве исходной матрицы. После шагов, описанных в разделе 2.3 протокола, был выполнен электрофорез в агарозном геле для проверки специфичности протокола амплификации при заданной температуре отжига (рис. 2А). Успешные полосы правильных размеров (215.н. или 182.н.) можно было наблюдать при любых температурах; Однако более низкие температуры отжига в анализе 1 приводили к нецелевому усилению. Было установлено, что надлежащая температура отжига для предварительного усиления составляет 70 °C (рис. 2A). Чтобы убедиться в точности обоих анализов и выбрать наилучший из них, молярные стандарты известного процентного содержания m.3243A>G были получены путем смешивания соответствующих объемов чистого продукта ПЦР в различных соотношениях: 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% и 100% m.3243A>G соответственно (рис. 2B, пунктирная линия). При проведении обоих анализов на стандартах мы наблюдали большую корреляцию с ожидаемым результатом в анализе 2 (рис. 2B). Затем мы использовали оба анализа на клетках цибридов m.3243A>G в эксперименте по генотипированию и наблюдали выраженное смещение в анализе 1, особенно вблизи гомоплазматических условий (рис. 2C).
Мутация m.5024C>T у мышей
Этот пример включает клетки MEF, обработанные mtZFN, разработанными для снижения уровня мутации m.5024C>T12 , в качестве примера эксперимента по митохондриальной генной терапии, где генотипирование путем пиросеквенирования полезно в качестве количественного сравнения между образцами. Клетки MEF получены из опубликованной мышиной модели, содержащей мутацию C>T в позиции 5,024 в мтДНК мыши (m.5024C>T)25. Эксперимент включал электропорирование MEF плазмидами, кодирующими mtZFN и различные флуоресцентные репортеры, и последующую сортировку клеток, экспрессирующих плазмиды, с помощью FACS через 24 часа. Затем клеткам давали восстановиться в течение 2 недель перед сравнением гетероплазмии путем пиросеквенирования.
Набор капсюлей, использованный для секвенирования положения m.5024C>T, был следующим:
Нападающий: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Реверс: 5' - [Биотин] GCAAATTCGAAGGTAGAGAAA - 3'
Последовательность действий: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'
Размер ампликона: 267 bp
Образцы были секвенированы в техническом трипликате для повышения точности результатов. Эксперимент также был проведен в биологическом дубликате, таким образом, получив шесть отдельных значений для каждого из условий (рис. 3B). Данные 2 из 18 пирограмм были использованы для построения рисунка 3B; эти пирограммы показаны на рисунке 3А.
Рисунок 1: Схемы, представляющие митохондриальные последовательности в клетке и общую техническую схему пиросеквенирования. (A) Схематическое изображение митохондриальной ДНК и ядерных митохондриальных последовательностей. На рисунке показано эволюционное происхождение последовательностей с высокой гомологией. (B) Схематическое изображение конвейера пиросеквенирующего анализа с окончательным примером последовательности, изображающей приблизительно 50% значение гетероплазмии C>G. Матричная ДНК сначала амплифицируется выбранными амплификационными праймерами, один из которых биотинилирован на 5'-конце. После амплификации пиросеквенсор сохраняет одну цепь ДНК в качестве матрицы для секвенирования с использованием магнитных шариков с покрытием стрептавидином, показанных синим цветом. Наконец, праймер для секвенирования позволяет проводить секвенирование путем синтеза заранее определенной серии нуклеотидов, генерируя пирограмму, которая представлена схематично. Стехиометрии каждого основания легко получить путем сравнения относительных высот пиков при каждом событии включения: один и тот же нуклеотид два раза подряд будет генерировать двойной пик по сравнению с одним основанием. Косая черта в анализируемой последовательности обозначает гипотетический SNP, который может быть «C» или «G». Обратите внимание на начальную диспенсацию имитации основания «G» на оси x пирограммы, которая обычно выполняется пиросеквенсором в качестве отрицательного контроля. Сокращения: мтДНК = митохондриальная ДНК; NUMT = ядерные митохондриальные последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Оптимизация набора праймеров пиросеквенирования, как показано на примере мутации m.3242A>G человека. (A) Электрофорез в агарозном геле (2% мас./об.) амплификации ПЦР с использованием амплификационных праймеров из обоих наборов, отобранных для мутации m.3242A>G. WT обозначает контрольную ДНК дикого типа, тогда как Het — это почти гомоплазматический образец m.3243A>G, подлежащий анализу. Температуры - это температура отжига, используемая в 40-цикловой реакции ПЦР. (B). Сравнение характеристик обоих наборов праймеров с использованием молярных эталонов для калибровки, которые были получены путем смешивания различных соотношений чистого продукта дикого типа и чистого мутантного продукта m3243A>G. Измеренные значения обозначаются вертикальными пунктирными линиями. Линейная функция X = Y отображается, чтобы проиллюстрировать, насколько близок каждый из двух тестируемых анализов к идеальному измерению. Названия клеточных линий на оси X — это названия различных клонов кибридов, которые были генотипированы с помощью этого анализа. (C) Результаты генотипирования четырех клонов цибридов неизвестной гетероплазмии m.3243A>G с использованием обоих анализов. Секвенирование проводили в техническом трипликате. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Измерение гетероплазмии на FACS-сортированных MEF m.5024C>T, обработанных технологией редактирования генов mtZFN. (A) Пирограммы из двух ПЦР-реплик образцов клеток MEF, используемые для получения рисунка 3B, а также контроля генотипирования дикого типа. Значения люминесценции по оси Y приведены в результатах генотипирования клеток, обработанных mtZFN, вместе с контрольной группой, не обработанной и обработанной имитацией. МЭФ электропорировали плазмидами, кодирующими мтZFN и различные флуоресцентные репортеры, а затем сортировали с помощью FACS через 24 часа. Затем клеткам давали восстановиться в течение 2 недель перед сравнением гетероплазмии путем пиросеквенирования. Полосы погрешности были рассчитаны с биологическими дубликатами, каждый из которых подвергся пиросеквенированию в техническом трипликате. Сокращения: FACS = сортировка клеток, активируемая флуоресценцией; MEFs = эмбриональные фибробласты мыши; mtZFN = митохондриальная нуклеаза цинкового пальца; A.U. = произвольные единицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшим аспектом успеха протокола является предотвращение загрязнений, особенно при использовании небольшого количества исходного материала. Рекомендуется использовать УФ-колпак и фильтрованные наконечники пипеток при подготовке образцов, где это возможно, а также разделять области предварительной и постамплификации. Пустые измерения и образцы известной гетероплазмии (например, ДНК дикого типа) всегда должны быть включены для использования в качестве ориентиров для проверки технической или биологической предвзятости.
Примечательным техническим предубеждением, присущим анализу, является повышенный люминесцентный сигнал, создаваемый включением аналогового аденина. Когда аденин используется в переменном положении, он часто образует остаточный флуоресцентный пик (например, рис. 2C). Именно по этой причине рекомендуется проводить анализы пиросеквенирования на противоположной цепи (где будет включен тимин), когда это возможно, чтобы избежать необходимости включать аналог аденина в переменное положение. Однако в случае мутаций А>Т или Т>А это невозможно. Тем не менее, как свидетельствуют репрезентативные результаты, правильный выбор праймеров может иметь большее значение при разработке анализа. Анализ 2 для мутации m.3243A>G, в первом разделе репрезентативных результатов, последовательности, основанные на соотношении A/G в переменном положении, в отличие от анализа 1, который измеряет отношение T/C. Несмотря на то, что анализ 2 подвержен смещению включения аденина, он дает более точные результаты, основанные на сравнении с молярными стандартами, как показано простым линейным регрессионным анализом (рис. 2B).
Смещения в первую очередь являются результатом коамплификации NUMT3. Большое число митохондриальных копий обычно не позволяет ядерным внецелевым последовательностям вносить какое-либо значительное смещение; однако определенные участки мтДНК присутствуют во многих NUMTS, и их следует избегать с использованием методов, указанных в протоколе в разделе 1.
При соблюдении вышеупомянутых мер предосторожности этот метод является высокомодульным, быстрым и экономически эффективным средством генотипирования SNP в мтДНК. Однако этот метод подходит не для всех применений генотипирования митохондрий, в частности, для крупномасштабных делеций, для которых рекомендуется цифровая капельная ПЦР26. Вариабельность дозирования реагентов секвенатором или различные условия праймеров/амплификации могут привести к появлению небольших смещений. Именно по этой причине для подтверждения достоверности результатов генотипирования обычно рекомендуются технические трипликации. Еще одним ограничением подхода является охват, поскольку генотипировать можно только короткие, предопределенные промежутки мтДНК. В то время как пиросеквенсоры могут быть запрограммированы на секвенирование сотен пар оснований неизвестной последовательности, это быстро становится менее рентабельным, чем использование подхода NGS. Первоначально исследователи могли бы реализовать пиросеквенирование в качестве метода быстрого генотипирования, который дает точный количественный ответ, но впоследствии могли бы проанализировать выбранные образцы с помощью NGS для дальнейшей точности и контекста.
В заключение, этот хорошо зарекомендовавший себя метод остается основным продуктом в митохондриальных генетических исследованиях, обеспечивая быстрый и простой доступ к количественным измерениям гетероплазмии, которые являются ключевыми во многих исследовательских контекстах в этой области, таких как диагностика пациентов, генная терапия или генотипирование животных моделей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
М.М. является соучредителем, акционером и членом Научно-консультативного совета Pretzel Therapeutics, Inc. P.S.-P. и P.A.N. предоставляют консультационные услуги для Pretzel Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Выражаем благодарность Сильвии Марше (Silvia Marchet) и Констанце Ламперти (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Милан) за подготовку и предоставление цибридных клеток m.3243A>G, используемых в качестве иллюстративных примеров для этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить членов Группы митохондриальной генетики (MRC-MBU, Кембриджский университет) за полезное обсуждение в ходе этого исследования. Эта работа была поддержана основным финансированием Совета по медицинским исследованиям Великобритании (MC_UU_00015/4 и MC_UU_00028/3). .А.Н. и.С.-. дополнительно поддерживаются The Lily Foundation и The Champ Foundation соответственно.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G.
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M.
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
