Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Genotyping av enkeltnukleotidpolymorfismer i mitokondriegenomet ved pyrosekvensering

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64361
Automatic Translation
1, 1, 1
1Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit, University of Cambridge, Cambridge Biomedical Campus

Summary

Pyrosekvenseringsanalyser muliggjør robust og rask genotyping av mitokondrielle DNA-enkeltnukleotidpolymorfismer i heteroplasmatiske celler eller vev.

Abstract

Mutasjoner i mitokondriegenomet (mtDNA) har vært assosiert med maternelt arvelige genetiske sykdommer. Imidlertid har interessen for mtDNA-polymorfismer økt de siste årene på grunn av den nylig utviklede evnen til å produsere modeller ved mtDNA-mutagenese og en ny forståelse av sammenhengen mellom mitokondrielle genetiske avvik og vanlige aldersrelaterte sykdommer som kreft, diabetes og demens. Pyrosekvensering er en sekvenserings-for-syntese-teknikk som er mye brukt over mitokondriefeltet for rutinemessige genotypingseksperimenter. Dens relative overkommelighet sammenlignet med massive parallelle sekvenseringsmetoder og enkel implementering gjør det til en uvurderlig teknikk innen mitokondriell genetikk, noe som muliggjør rask kvantifisering av heteroplasmy med økt fleksibilitet. Til tross for den praktiske egenskapen til denne metoden, krever implementeringen som et middel til mtDNA-genotyping observasjon av visse retningslinjer, spesielt for å unngå visse forstyrrelser av biologisk eller teknisk opprinnelse. Denne protokollen skisserer de nødvendige trinnene og forholdsreglene ved utforming og implementering av pyrosekvenseringsanalyser for bruk i forbindelse med heteroplasmimåling.

Introduction

Mitokondriegenomet eksisterer i form av små (16, 5 kb) sirkulære molekyler (mtDNA) tilstede i det innerste rommet i mitokondriene kalt matrisen og koder for 13 underenheter av mitokondriell respiratorisk kjede, samt tRNA og rRNA som er nødvendige for deres oversettelse in situ av mitokondriell ribosom1. Dette genomet representerer ca. 1% av alle proteiner som er nødvendige for mitokondriell funksjon, hvorav resten er kodet av nukleært DNA (nDNA). Det antas vanligvis at mitokondrier er avledet fra en endosymbiotisk fusjonshendelse mellom en alfa-proteobakteriell forfader og en forfedre eukaryot celle. Når denne hypotetiske symbiosen fant sted, ble den genetiske informasjonen til mitokondriene gradvis overført til kjernen over eoner, noe som forklarer den nevnte kompaktiteten til mtDNA sammenlignet med genomene til moderne cyanobakterier2. En slik overføring av gener er sterkest bevist av eksistensen av lange strekninger av nDNA som er svært homologe med sekvensene som finnes i mtDNA. Disse nukleære mitokondriesekvensene (NUMT) er en vanlig kilde til feiltolkning under genotyping, og visse forholdsregler må tas for å unngå nukleære skjevheter ved genotyping av mtDNA3 (figur 1A).

Et annet karakteristisk trekk ved mtDNA er at kopinummeret varierer avhengig av celletype, og nummererer alt fra titusenvis til tusenvis av kopier per celle4. På grunn av denne multikopieringsnaturen kan mtDNA ha et bredt spekter av genotyper i en enkelt celle, noe som kan resultere i en mer kontinuerlig fordeling av alleler i motsetning til de diskrete allelene assosiert med nukleære gener når man vurderer zygositeten til kromosomer. Denne heterogeniteten av mitokondrielle alleler blir referert til som mitokondriell heteroplasmi, som vanligvis uttrykkes i prosentvis prevalens av en gitt mutasjon som en andel av det totale mtDNA i en gitt celle. Heteroplasmy kan kontrasteres med homoplasmi, som refererer til at en unik art av mtDNA er tilstede over en celle.

Måling av mitokondriell heteroplasmy er av spesiell interesse når man kvantifiserer andelen mtDNA-molekyler som har patogene varianter. Slike varianter kommer i form av single nucleotide polymorphisms (SNPs), små indels eller store delesjoner5. De fleste mennesker er heteroplasmatiske for patogene varianter; Imidlertid viser de ingen kliniske fenotyper, som ofte bare manifesterer seg ved høyere heteroplasminivåer av patogent mtDNA i et fenomen referert til som terskeleffekten6. Mens verdiene assosiert med patogenisitet er svært avhengige av arten av den patogene mutasjonen og vevet der den forekommer, ligger de vanligvis over 60% heteroplasmy7.

Det er flere forskningsområder der mitokondriell genotyping er vanlig. På det medisinske området kan testing for eller kvantifisering av mtDNA-mutasjoner tjene som et diagnostisk kriterium for mitokondriesykdommer, hvorav mange har mtDNA-avvik som opprinnelse5. I tillegg til studiet av humanpatogene mutasjoner, vil forekomsten av dyremodeller som inneholder patogene SNPer i mtDNA sannsynligvis øke, gitt den nylige fremkomsten av mitokondriell baseredigering aktivert av mitokondrielt målrettede DddA-avledede cytosinbaseredaktører (DdCBEs)8 og TALE-baserte deaminaser (TALEDs) for adeninbaseredigering9. Denne tilnærmingen vil være medvirkende til å forstå samspillet mellom avvikende mitokondrielle genotyper og de resulterende dysfunksjonene. Det er også pågående vitenskapelig forskning for å omforme mitokondriegenomet til ultimat bruk som en terapeutisk strategi i menneskelige mitokondrielle sykdommer via en tilnærming kjent som heteroplasmi-skifting. Dette forskningsfeltet innebærer primært å lede mutasjonsspesifikke nukleaser til mitokondriematrisen; Dette resulterer i fortrinnsvis nedbrytning av patogent mtDNA, noe som fører til redning i fenotype10,11,12,13. Eventuelle eksperimenter som involverer remodellering av mitokondriell genotype krever en robust kvantitativ metode for å vurdere heteroplasmiskift.

Et bredt spekter av metoder brukes til å genotype mtDNA, og disse varierer i henhold til mutasjonens natur. Neste generasjons sekvenseringsmetoder (NGS) er mer presise når det gjelder kvantifisering av SNP-er i mtDNA; Imidlertid forblir disse metodene uoverkommelig dyre for rutinemessig kvantifisering av mitokondriell heteroplasmi, spesielt hvis antall prøver er små. Sanger-sekvensering kan også tillate deteksjon av SNP-er; Denne tilnærmingen er imidlertid ikke kvantitativ og klarer ofte ikke å oppdage lave nivåer av heteroplasmi eller kan være unøyaktig når man estimerer høye heteroplasmier. Pyrosekvensering, som en analyse som involverer minimal forberedelse og muliggjør rask kvantifisering av heteroplasmy for enhver mtDNA-prøve, foreslås som et passende kompromiss mellom disse to ytterpunktene. Denne metoden har blitt brukt rutinemessig for å kvantifisere mitokondrielle SNPs av mange forskere i ulike sammenhenger, inkludert rettsmedisinsk analyse 14,15, klinisk diagnose16, eller genotyping av mtDNA fra enkeltceller17.

Denne analysen innebærer et første PCR-forsterkningstrinn i en region som flankerer SNP i mtDNA, som etterfølges av en sekvenserings-for-syntese-analyse ved bruk av en streng av den tidligere genererte amplikonen. En av de to primerne som brukes i foramplifiseringstrinnet må biotinyleres på 5'-enden, noe som vil gjøre det mulig for pyrosekvenseringsapparatet å isolere den ene DNA-strengen som skal brukes som mal for sekvenseringsreaksjonen. En tredje sekvenseringsprimer blir deretter glødet på den beholdte biotinylerte strengen, noe som gjør det mulig for begynnende DNA-syntese som deoksynukleotider som skal dispenseres i en forhåndsdefinert rekkefølge i reaksjonskammeret. Pyrosequenceren registrerer mengden av hver base innlemmet basert på en luminescerende avlesning, noe som tillater den relative kvantifiseringen av mutante og villtype mitokondrielle alleler ved DNA-syntese (figur 1B). Luminescensen genereres av et luciferase-enzym, som avgir lys i nærvær av ATP som en ATP-sulfurylase syntetiserer de novo ved hver inkorporeringshendelse fra pyrofosfatene frigjort av hvert nukleotid. Disse to reaksjonene kan oppsummeres som følger:

1. PPi (fra nukleotidinkorporering) + APS → ATP + sulfat (ATP-sulfurylase)

2. ATP + luciferin +O2 → AMP + PPi + oksyluciferin + CO2 + lys (luciferase)

Å oppdage adeninbaser av pyrosequenceren uten at ATP kryssreagerer med luciferase i den andre reaksjonen er en utfordring. Dette løses imidlertid ved å bruke en adeninanalog for DNA-syntese, nemlig dATPαS. Til tross for at det ikke er et perfekt substrat for luciferase, produserer det en sterkere luminescens sammenlignet med de tre andre nukleotidene, som er digitalt justert av pyrosequenceren og satt til en faktor på 0,9. På grunn av denne iboende variasjonen foreslås det å unngå sekvensering av adenin ved SNP-posisjonen (se diskusjonen for ytterligere detaljer).

Følgende protokoll beskriver metoden for mtDNA-heteroplasmivurdering ved pyrosekvensering og skisserer de nødvendige forholdsregler ved utforming av amplifikasjonsprimere for å unngå biologisk eller teknisk skjevhet ved genotyping av SNPer i mtDNA. Sistnevnte innebærer digital kartlegging og valg av primersettene, optimalisering av forforsterker-PCR, og til slutt sekvensering og raffinering av analysen. To anvendte eksempelanalyser er demonstrert: For det første optimalisering av den vanligste humanpatogene varianten m.3243A>G18, og for det andre genotyping av musembryonale fibroblastceller (MEF) som har gjennomgått heteroplasmiskifting ved hjelp av teknologier utviklet ved Minczuk-laboratoriet i Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informert samtykke ble gitt for bruk av humane 3243A>G cybridceller og de udødeliggjorte m.5024C>T MEFene som ble brukt i denne studien. Etisk godkjenning var ikke nødvendig i dette tilfellet, da pasientcellene ikke ble samlet inn ved University of Cambridge. Bruk av humane fibroblaster kan imidlertid kreve etisk godkjenning. Det anbefales sterkt å følge beste praksis for PCR-oppsett når du klargjør prøve-DNA for pyrosekvensering. Hyppig amplifikasjon med identiske primere kan føre til amplikontaminering og introdusere skjevhet i den påfølgende genotypingen hvis streng separasjon mellom pre-PCR- og post-PCR-områdene ikke observeres. Rørledningen som presenteres her bruker spesifikt utstyr fra en eneste produsent; detaljene finner du i materialfortegnelsen. Primerdesignet for PCR kan utføres manuelt hvis ønskelig; Det anbefales imidlertid å bruke eksisterende programvare til dette formålet (se materialfortegnelsen).

1. Pyrosekvensering primer design og analyse valg

  1. Skaffe primerkandidater med programvare
    1. Få en mtDNA-sekvensfil for arten som genotypes, og identifiser posisjonen til SNP. Sørg for at referansesekvensen som brukes bruker riktig basenummerering for mutasjonen som studeres, slik at posisjonen til SNP lett kan identifiseres.
    2. Kopier 1000 basepar oppstrøms og nedstrøms for SNP-området, og lim inn den avkortede sekvensen i programvaren som er beregnet på pyrosekvenseringsprimerdesignet (se materialfortegnelsen).
    3. Sett den analyserte SNP-basen som målet for pyrosekvenseringsanalysen i programvaren ved å markere den polymorfe basen og høyreklikke på og deretter velge angitt målområde.
    4. Trykk på avspillingsikonet øverst til høyre i grensesnittet for å starte primervalg.
    5. Vent til programvaren nå automatisk genererer primertrioer: to primere for foramplifisering av mal-DNA og en tredje primer for sekvensering ved syntese i pyrosekvenseringsmaskinen. Behold alle primersettene ved å høyreklikke på og velge kopier alle primersett.
  2. Velge de optimale primersettene fra den genererte listen
    1. Behold primersettene med de høyeste kvalitetspoengene basert på programvareutdataene, som gir primersett i synkende rekkefølge basert på kvalitetspoengene. Hvis mulig, utelater du primersett med en poengsum under 80.
    2. For de beholdte primersettene, identifiser og kopier amplikonen produsert av forsterkningsprimerne.
    3. Juster amplicons produsert med hele genomet av organismen som skal genotypes ved hjelp av NCBI Blast ved å bruke den elektroniske innsendingsportalen på https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Velg følgende fra rullegardinmenyene under innsending:
      1. Velg database | Genomiske + transkripsjonsdatabaser.
      2. Velg Human eller Mouse i rullegardinmenyen, avhengig av SNP som er analysert.
      3. Velg Optimaliser for | Noe lignende sekvenser (Blastn).
    4. (Valgfritt) Hvis du genotyper en annen organisme enn mus eller menneske, velger du følgende under innsending:
      1. Velg database | Standard database.
      2. Velg RefSeq Representative genomes i nedtrekksmenyen
      3. Velg Optimaliser for | Noe lignende sekvenser (Blastn)
    5. Når det er mulig, utelat eventuelle forsterkere som har perfekt homologi til mtDNA-amplikonen, spesielt hvis primerbindingsregionene er perfekt homologe (se diskusjonen).
      MERK: BLAST-justeringsverktøyet vil returnere enhver sekvens med betydelig homologi til forforsterkeramplikonene. Dette gjør det mulig å oppdage NUMT-ene beskrevet i introduksjonen, som hvis de ikke blir redegjort for, kan indusere en skjevhet ettersom de er samforsterket med mitokondrielt DNA.
    6. Bestill oligoene som er oppnådd via denne rørledningen. Forsikre deg om at 5 'biotinmodifisering legges til riktig amplifikasjonsprimer under synteserekkefølgen, slik at sekvenseringsprimeren vil være komplementær til den biotinylerte strengen.
      MERK: Valget av sekvenseringsprimer er mer fleksibelt enn forsterkningsprimerne, og det anbefales å ha minst en base som skiller 3'-enden av sekvenseringsprimeren og den variable posisjonen.

2. Forforsterker PCR-optimalisering

  1. Forbered DNA-prøvene ved å ekstrahere det totale genomiske DNA ved hjelp av en passende metode.
    MERK: Dette vil i stor grad avhenge av antall celler som blir genotypet og deres opprinnelse. Hvis DNA isoleres fra enkeltceller ved hjelp av en lysisbuffer som inneholder proteinase K, må prøven denatureres ved 95 °C i 10 minutter for ikke å forstyrre polymerasen under den påfølgende PCR.
  2. PCR-oppsett og innstillinger for termisk blokk
    1. Sett opp PCR med en valgfri polymerase med høy kvalitet. Forbered en Master Mix for fire reaksjoner. Siden bare 10 μL PCR-reaksjon er nødvendig for en pyrosekvenseringskjøring, må du forberede 25 μL PCR-reaksjoner (for å tillate en teknisk gjentakelse om nødvendig). Bruk 40 sykluser med PCR med ca. 10 ng genomisk DNA som utgangsmateriale med 1 μM av både forover- og reversprimere.
    2. Still inn forlengelsestiden i henhold til produsentens spesifikasjoner for polymerasen som brukes, med tanke på lengden på de valgte forforsterkningsprimerne.
    3. Bruk en termisk syklist med variable glødetemperaturinnstillinger. Siden glødetemperaturen kan variere avhengig av primersekvensen, programmerer saltinnholdet i polymerasebufferen og andre faktorer fire forskjellige glødetemperaturer i det termiske syklusprogrammet.
      MERK: Det bearbeidede eksemplet i de representative resultatene brukte følgende temperaturer: 55 °C, 60 °C, 65 °C og 70 °C.
    4. Del Master Mix i fire 200 μL PCR-rør, og sett dem til å kjøre ved hver av de fire utvalgte glødningstemperaturene i termisk syklist i 40 sykluser.
  3. Visualisering av forforsterkerbånd
    1. Under PCR-kjøringen, lag en 2% (w / v) agarosegel i 1x TBE med SYBR Safe eller ethidiumbromid som visualiseringsmiddel.
      MERK: En høyere prosentandel gel anbefales for visualisering, da de forsterkede fragmentene vanligvis er korte, vanligvis fra 100 til 500 basepar.
    2. Etter at PCR i trinn 2.2 er fullført, bland 10 μL av reaksjonen med en passende mengde DNA-lastbuffer, og kjør på 2% agarosegel ved 7 V / cm i ca. 45 minutter.
    3. Visualiser de resulterende DNA-fragmentene på en UV-transilluminator.
      MERK: De termiske syklusforholdene som er valgt for forforsterkertrinnet, skal produsere ett enkelt rent bånd av forventet størrelse. Lavere glødetemperaturer kan av og til resultere i forsterkning utenfor målet, noe som kan introdusere skjevheter i den påfølgende pyrosekvenseringen.
    4. Velg den laveste glødetemperaturen som gir et rent bånd av riktig størrelse for påfølgende forsterkninger.
    5. (Valgfritt) Excise et bånd av forventet størrelse, rense ved hjelp av en gel ekstraksjon kit av valget, og analyser ved Sanger-sekvensering for å bekrefte omtrentlig heteroplasmy av prøven som referanse.

3. Instrumentoppsett og kjøring

MERK: Når PCR-trinnet i forrige avsnitt er optimalisert, innebærer neste trinn programmering av pyrosequenceren med riktig nukleotidsekvens for å analysere for den spesifikke SNP. Dette innebærer å legge inn 10 baser direkte nedstrøms for 3'-enden av sekvenseringsprimeren. Dette er beskrevet i følgende avsnitt.

  1. Konfigurasjon av analyse:
    1. Åpne kjøreprogramvaren som følger med pyrosequenceren, og velg Ny analyse øverst til venstre i grensesnittet.
    2. Velg malen for allelkvantifiseringsanalyse .
    3. Skriv inn sekvensen som skal analyseres i den tilsvarende boksen ved å skrive inn nukleotidene som skal innlemmes direkte nedstrøms for sekvenseringsprimeren, som skal være oppstrøms for SNP av interesse. For den variable posisjonen angir du de to mulige basene atskilt med en skråstrek (f.eks.
    4. Trykk på Generer dispensasjonsrekkefølge, og la programvaren automatisk bestemme en passende rekkefølge for nukleotidene som skal dispenseres i sekvens-for-syntese-reaksjonen.
    5. Lagre og angi et navn for analysen.
  2. Reagensforberedelse og lagring
    1. Fortynn sekvenseringsprimeren som er bestilt til 4 μM i glødebufferen som følger med i pyrosequencer-reagenssettet.
      MERK: Sekvenseringsprimeren kan først fortynnes i vann til 100 μM som en stamløsning og deretter fortynnes ytterligere i glødebuffer til 4 μM etter behov.
    2. Forberedelse og håndtering av enzym og substrat
      1. Når du først unboxing, oppløs det lyofiliserte enzymet og substratet i henhold til produsentens anbefalinger. Oppbevares ved -20 °C når den ikke er i bruk.
      2. Ved senere bruk, tine hetteglassene med enzym og substrat fra −20 °C.
        MERK: Alle andre reagenser i det medfølgende settet kan oppbevares i kjøleskap ved 4 °C. Fortynnede sekvenseringsprimere kan også oppbevares ved 4 °C.
    3. Legg ønsket mengde av hvert reagens på is.
    4. Hold de resterende komponentene, nemlig streptapavidinbelagte magnetiske perler, absorberstrimler og pyrosekvenseringsskiver, ved 4 °C.
  3. Kjør kjøring
    MERK: Når en analyse først er designet, må den kalibreres ved hjelp av PCR-produkter med kjent heteroplasmi, noe som sikrer at analysen nøyaktig kan skille heteroplasmier. Forskere kan bruke blandinger av PCR-produkter med kjent heteroplasmi som standarder. Prøver kan også verifiseres med andre metoder som er nevnt i innledningen og diskusjonen, spesielt NGS.
    1. Fortynn DNA som skal analyseres til 5 ng / μL. Spesielt i første run, sørg for å inkludere prøver av kjent heteroplasmy som referanse og / eller villtypeprøver.
    2. Utfør en presekvenserings-PCR på 5 μL fortynnet DNA i 25 μL-reaksjoner ved bruk av amplifikasjonsprimere og parametere identifisert i avsnitt 1 og seksjon 2. Utfør tekniske PCR-replikater for hver prøve.
      MERK: Forforsterker-PCR kan lagres kortvarig ved 4 °C eller lang sikt ved -20 °C før du går videre til sekvensering.
    3. Kjør filoppsett
      1. Velg Nytt løp øverst til venstre i pyrosequencer-programvaren.
      2. Pyrosequenceren kan samtidig sekvensere 48 separate forforsterkede reaksjoner, med en tom firkant som representerer en enkelt sekvenseringsbrønn på en pyrosekvenseringsdisk. Last inn analysene som er konfigurert i seksjon 3.1 ved å høyreklikke på en firkant og velge lastanalyse. Om nødvendig, sekvenser opptil fire separate analyser med forskjellige sekvenseringsprimere.
      3. Sett primerdispenseringsmodus til Automatisk for automatisk å tilordne et injeksjonskammer for hver sekvenseringsprimer som brukes til kjøringen.
      4. Sett kjøremodus til Standard med mindre du kjører fire forskjellige typer analyser på én sekvenseringsdisk.
      5. Kontroller at antall analyser på kjøremalfilen samsvarer med antall PCR-reaksjoner som forsterkes.
        MERK: Hvis du kjører mer enn 48 prøver, må du konfigurere flere kjørefiler.
      6. Lagre kjørefilene på en USB-stasjon.
    4. Priming av pyrosequenceren
      1. Trykk på rengjøringsknappen på enhetens hovedberøringsskjerm, og rengjør alle injektorer med vann med høy renhet i henhold til instruksjonene på skjermen. Når du setter absorberstrimmelen inn i maskinen, må du sørge for at endene møtes i "klokka 9" -posisjon (rett til venstre for midten).
      2. Koble til USB-pinnen med løpene som ble satt opp i trinn 3.3.3, og last inn kjørefilene som er definert i trinn 3.3.3.
        MERK: Kjørefilene må lagres utenfor en katalog eller mappe på USB-en, ellers kan de ikke leses av maskinen.
      3. Følg instruksjonene på enheten for å laste inn og klargjøre reagensene etter behov i de tilsvarende injektorene på maskinen.
    5. Eksempel på diskforberedelse og analyselansering
      1. La de streptapavidinbelagte magnetkulene balansere til romtemperatur.
        MERK: Disse perlene vil gjøre det mulig for enheten å fange den biotinylerte strengen fra forforsterker-PCR-trinnet. De må kjøpes separat fra settet.
      2. Legg 3 μL perler inn i brønnene som er definert i kjørefilen fra trinn 3.3.3.
      3. Last 10 μL av hver PCR-reaksjon som skal sekvenseres i den tilsvarende prøven, og pipett opp og ned for å blande prøven med magnetkulene. Unngå bobler hvis mulig.
      4. Se etter indikasjonen i den primede pyrosequenceren om at disken kan lastes inn i maskinen. Skru av platens holdemutter før du justerer den lastede prøveplaten med metallpinnen i diskrommet.
      5. Når platen er godt skrudd inn i platerommet, starter du sekvenseringskjøringen ved å trykke på startknappen på berøringsskjermgrensesnittet.

4. Resultat oppkjøp

  1. Når kjøringen er fullført, fjerner du USB-stasjonen fra maskinen og kobler den tilbake til datamaskinen som kjører pyrosequencer-programvaren. Mens du fortsetter med følgende trinn, fortsett med å rengjøre pyrosequenceren ved å følge instruksjonene hvis det er dagens siste løp.
  2. Vent til den nylig genererte kjørefilen vises på USB-stasjonen, og dobbeltklikk på kjøreresultatfilen. Dette analyserer automatisk luciferaseutgangen for hver brønn ved nukleotidinkorporering og kvantifiserer mitokondrieallelen av interesse definert under analysekonfigurasjonen i pkt. 3.1.
  3. Se etter følgende fargepoeng vist av programvaren basert på kvaliteten på lesingene. Blått indikerer et optimalt løp, gult et løp med en advarsel og rødt et mislykket løp. Hvis du vil lagre resultatene, velger du Rapporter i det øverste vinduet | Full rapport for å generere en .pdf fil som inneholder pyrogrammer og resultater fra hver brønn i løpet. Du kan også laste ned resultatene i andre formater under Rapporter-fanen .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne delen presenterer et eksempel på optimalisering av en pyrosekvenseringsanalyse for en human patogen mtDNA-mutasjon, samt sekvenseringsdata fra genotyping av heteroplasmatiske (m.5024C>T) embryonale fibroblaster (m.5024CT) fra mus (MEF) behandlet med mitokondrielle sinkfingernukleaser (mtZFNs). Optimalisering av analysen for humane celler og sammenligning av to forskjellige analyser demonstrerer hvordan man velger den mest nøyaktige, mens genotyping av genetisk modifiserte MEF-celler i det andre eksemplet tjener som et anvendt eksempel på å oppdage heteroplasmiskift etter genterapiintervensjon.

Human m.3243A>G mutasjon
Dette eksemplet illustrerer genotyping av en vanlig patogen variant av mtDNA-m.3243A>G. Den vanlige m.3243A>G-mutasjonen ligger til grunn for flere kliniske sykdommer, spesielt mitokondriell encefalopati, melkesyreacidose og slaglignende episoder (MELAS), mors arvelig døvhet og diabetes (MIDD) og progressiv ekstern oftalmoplegi (PEO)23. Denne analysen kan også brukes til å genotype den mindre vanlige m.3243A>T variant24 ved å omprogrammere sekvensen av nukleotider som skal inkorporeres, som beskrevet i pkt. 3.1.3 i protokollen.

Etter retningslinjene for primeroptimalisering i seksjon 1 ble følgende primersett valgt, ett for hver streng:

Analyse 1:

Fremover: 5' - [Biotin] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Bakside: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Sekvensering: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'

Amplicon størrelse: 215 bp

Analyse 2:

Fremover: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Bakside: 5' - [Biotin] GTTGGCCATGGGTGTTGTTGT- 3'
Sekvensering: 5' -GGGTTTTTTAAGATGG- 3'

Amplicon størrelse: 182 bp

For å bestemme de termiske syklusforholdene for analysen, ble en termisk gradient-PCR ved bruk av en Hot Start-polymerase (se materialtabellen) først utført og analysert ved elektroforese, etter avsnitt 2. Førti sykluser ble brukt til å amplifisere ca. 10 ng DNA som startmal. Etter trinnene under pkt. 2.3 i protokollen ble det utført en agarosegelelektroforese for å verifisere amplifikasjonsprotokollens spesifisitet ved en gitt glødningstemperatur (figur 2A). Vellykkede bånd av riktig størrelse (enten 215 bp eller 182 bp) kunne observeres ved alle temperaturer; Imidlertid resulterte de lavere glødetemperaturene i analyse 1 i forsterkning utenfor målet. Riktig glødetemperatur for foramplifisering ble fastsatt til 70 °C (figur 2A). For å fastslå nøyaktigheten av både analysene og velge den beste, ble molare standarder for kjent m.3243A>G prosentandel generert ved å blande passende volumer av rent PCR-produkt i forskjellige forhold: henholdsvis 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% og 100% av m.3243A >G (figur 2B, stiplet linje). Når vi utførte begge analysene på standardene, observerte vi en større korrelasjon med forventet utfall i analyse 2 (figur 2B). Vi brukte deretter begge analysene på m.3243A>G cybridceller i et genotypingseksperiment og observerte en uttalt skjevhet i analyse 1, spesielt nær homoplasmatiske forhold (figur 2C).

Murine m.5024C>T mutasjon
Dette eksemplet involverer MEF-celler behandlet med mtZFNs utviklet for å redusere nivået av m.5024C>T-mutasjonen12 som et eksempel på et mitokondrielt genterapieksperiment der genotyping ved pyrosekvensering er nyttig som en kvantitativ sammenligning mellom prøver. MEF-cellene er avledet fra en publisert musemodell som har en C>T-mutasjon i posisjon 5,024 i musens mtDNA (m.5024C>T) 25. Eksperimentet involverte elektroporering av MEF-ene med plasmider som koder for mtZFN-er og forskjellige fluorescerende reportere og deretter sortering av cellene som uttrykker plasmidene ved FACS etter 24 timer. Cellene fikk deretter komme seg i 2 uker før heteroplasmi-sammenligning ved pyrosekvensering.

Primersettet som ble brukt til sekvensering av m.5024C>T-posisjonen var som følger:

Fremover: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Bakside: 5' - [Biotin] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
Sekvensering: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'

Amplicon størrelse: 267 bp

Prøvene ble sekvensert i teknisk triplikat for å øke påliteligheten av resultatene. Forsøket ble også utført i biologisk duplikat, og produserte dermed seks separate verdier for hver av betingelsene (figur 3B). Dataene fra 2 av de 18 pyrogrammene ble brukt til å konstruere figur 3B; disse pyrogrammene er vist i figur 3A.

Figure 1
Figur 1: Skjemaer som representerer mitokondriesekvenser i en celle og det generelle tekniske omrisset av pyrosekvensering. (A) Skjematisk fremstilling av mitokondrielt DNA og nukleære mitokondriesekvenser. Figuren representerer den evolusjonære opprinnelsen til høye homologisekvenser. (B) Skjematisk fremstilling av pyrosekvenseringsanalyserørledningen med en endelig eksempelsekvens som viser en omtrentlig 50% C>G heteroplasmiverdi. Mal-DNA forsterkes først av utvalgte amplifikasjonsprimere, hvorav den ene biotinyleres på 5'-enden. Etter forsterkning beholder pyrosequenceren en enkelt DNA-streng som mal for sekvensering ved hjelp av streptapavidinbelagte magnetiske perler, vist i blått. Til slutt tillater en sekvenseringsprimer sekvensering ved syntese av en forhåndsdefinert serie nukleotider, og genererer et pyrogram som er skjematisk representert. Støkiometriene til hver base oppnås enkelt ved å sammenligne de relative topphøydene ved hver inkorporeringshendelse: det samme nukleotidet to ganger på rad vil generere en dobbel topp sammenlignet med en enkelt base. Skråstreken i sekvensen som skal analyseres betegner den hypotetiske SNP, som kan være "C" eller "G". Legg merke til den første dispensasjonen av en hånlig "G" -base på pyrogrammets x-akse, som vanligvis utføres av pyrosequenceren som en negativ kontroll. Forkortelser: mtDNA = mitokondrielt DNA; NUMT = nukleære mitokondriesekvenser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Optimalisering av pyrosekvenseringsprimersettet som illustrert på den humane m.3242A>G-mutasjonen. (A) Agarosegelelektroforese (2 % w/v) av en PCR-amplifikasjon ved bruk av amplifikasjonsprimere fra begge settene valgt for m.3242A>G-mutasjonen. WT betegner villtypekontroll-DNA, mens Het er den nesten homoplasmatiske m.3243A>G-prøven som skal analyseres. Temperaturene er glødetemperaturen som brukes i en 40-syklus PCR-reaksjon. (B). En sammenligning av ytelsen til begge primersettene ved bruk av molare standarder for kalibrering, som ble oppnådd ved å blande forskjellige forhold mellom ren villtype og ren mutant m3243A > G-produkt. De målte verdiene er betegnet med de vertikale stiplede linjene. En X = Y lineær funksjon vises for å illustrere hvor nær hver av de to testede analysene er til en ideell måling. Navnene på cellelinjene på x-aksen er navnene på de forskjellige cybridklonene som ble genotypet ved hjelp av denne analysen. (C) Genotypingsresultater på fire cybridkloner av ukjent m.3243A>G heteroplasmy ved bruk av begge analysene. Sekvensering ble utført i teknisk triplikat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Heteroplasmimåling på FACS-sorterte m.5024C>T MEFs behandlet med mtZFN-genredigeringsteknologi . (A) Pyrogrammer fra to MEF-celleprøve-PCR-replikater brukt til å generere figur 3B , samt genotypingskontrollen av villtype. Luminescensverdiene på Y-aksen er i A.U. (B) Genotypingsresultater fra mtZFN-behandlede celler sammen med ubehandlede og mock-behandlede kontroller. MEF-ene ble elektroporert med plasmider som koder for mtZFN-er og forskjellige fluorescerende reportere og deretter sortert etter FACS etter 24 timer. Cellene fikk deretter komme seg i 2 uker før heteroplasmi-sammenligning ved pyrosekvensering. Feilstengene ble beregnet med biologiske duplikater, som hver og en gjennomgikk pyrosekvensering i teknisk triplikat. Forkortelser: FACS = fluorescensaktivert cellesortering; MEFs = musembryonale fibroblaster; mtZFN = mitokondriell sinkfingernuklease; A.U. = vilkårlige enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Et kritisk aspekt for protokollens suksess er å unngå forurensninger, spesielt ved bruk av lave mengder utgangsmateriale. Det anbefales å bruke en UV-hette og filtrerte pipettespisser når prøvene tilberedes der det er mulig, samt å holde forforsterker- og etterforsterkningsområdene atskilt. Blanke målinger og prøver av kjent heteroplasmi (som villtype-DNA) bør alltid inkluderes for å brukes som målestokk for å kontrollere for teknisk eller biologisk skjevhet.

En bemerkelsesverdig teknisk bias som er iboende i analysen er det økte luminescerende signalet produsert av adeninanalog innlemmelse. Når adenin brukes i variabel posisjon, produserer det ofte en gjenværende fluorescerende topp ( f.eks. figur 2C). Det er av denne grunn at det anbefales å kjøre pyrosekvenseringsanalyser på motsatt streng (hvor en tymin vil bli innlemmet), når det er mulig for å unngå å måtte innlemme adeninanalogen i variabel posisjon. Men i tilfelle av A>T eller T>A mutasjoner, er dette umulig. Likevel, som det fremgår av de representative resultatene, kan et passende valg av primere være av større betydning når man designer en analyse. Analyse 2 for m.3243A>G-mutasjonen, i den første delen av de representative resultatene, sekvenser basert på A / G-forholdet ved variabel posisjon i motsetning til analyse 1, som måler T / C-forholdet. Til tross for å være utsatt for adeninininkorporeringsskjevheten, gir analyse 2 mer nøyaktige resultater basert på sammenligningen med molarstandardene, som vist ved en enkel lineær regresjonsanalyse (figur 2B).

Biaser er primært et resultat av NUMT-koforsterkning3. Det store mitokondriekopinummeret forhindrer vanligvis kjernefysiske off-target-sekvenser fra å introdusere noen signifikant skjevhet; Imidlertid er visse regioner av mtDNA tilstede i mange NUMTS og bør unngås ved å bruke metodene angitt i protokollen under avsnitt 1.

Når du tar de nevnte forholdsreglene, er denne metoden et svært modulært, raskt og kostnadseffektivt middel for genotyping av SNPer i mtDNA. Metoden er imidlertid ikke egnet for alle mitokondrielle genotypingsapplikasjoner, spesielt storskala delesjoner der digital dråpe-PCR anbefales26. Variasjon i dispensasjon av reagenser fra sequenceren eller forskjellige primere/amplifikasjonsbetingelser kan føre til at små skjevheter introduseres. Det er av denne grunn at tekniske triplikater vanligvis anbefales for å bekrefte sannheten av genotypingsresultatene. En annen begrensning av tilnærmingen er omfanget, siden bare korte, forhåndsdefinerte spenn av mtDNA kan genotypes. Mens pyrosequencere kan programmeres til å sekvensere hundrevis av basepar av ukjent sekvens, blir dette raskt mindre kostnadseffektivt enn å bruke en NGS-tilnærming. Forskere kan i utgangspunktet implementere pyrosekvensering som en rask genotypingsmetode som gir et presist kvantitativt svar, men kan senere analysere utvalgte prøver av NGS for ytterligere presisjon og kontekst.

Avslutningsvis forblir denne veletablerte metoden en stift i mitokondriell genetisk forskning, og gir rask og enkel tilgang til kvantitative heteroplasmimålinger som er sentrale i mange forskningssammenhenger på feltet, for eksempel pasientdiagnose, genterapi eller genotyping av dyremodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.M. er medstifter, aksjonær og medlem av Scientific Advisory Board of Pretzel Therapeutics, Inc. PSP. og P.A.N. tilbyr konsulenttjenester for Pretzel Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Vi takker Silvia Marchet og Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milano) for å forberede og levere m.3243A>G cybridceller som brukes som illustrerende eksempler for denne protokollen. Vi ønsker også å anerkjenne medlemmene av Mitochondrial Genetics Group (MRC-MBU, University of Cambridge) for nyttig diskusjon i løpet av denne forskningen. Dette arbeidet ble støttet av kjernefinansiering fra Medical Research Council UK (MC_UU_00015/4 og MC_UU_00028/3). P.A.N. og P.S.-P. støttes i tillegg av henholdsvis The Lily Foundation og The Champ Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD Hot Start DNA Polymerase Sigma-Aldrich 71086
PyroMark Assay Design 2.0 QIAGEN
Pyromark Q48 Absorber Strips  QIAGEN 974912
PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) QIAGEN 974022
Pyromark Q48 Autoprep  QIAGEN 9002470
PyroMark Q48 Cartridge Set QIAGEN 9024321
Pyromark Q48 Disks QIAGEN 974901
Pyromark Q48 Magnetic beads  QIAGEN 974203
PyroMark Q48 Software License (1) QIAGEN 9024325

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
  2. Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
  3. Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
  4. Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
  5. Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
  6. Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
  7. Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
  8. Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
  9. Cho, S. -I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
  10. Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
  11. Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
  12. Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
  13. Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
  14. Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
  15. Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
  16. Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
  17. Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
  18. El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
  19. Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
  20. Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
  21. Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
  22. Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
  23. Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
  24. Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
  25. Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
  26. Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).

Tags

Tilbaketrekking utgave 192
Genotyping av enkeltnukleotidpolymorfismer i mitokondriegenomet ved pyrosekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nash, P. A., Silva-Pinheiro, P.,… More

Nash, P. A., Silva-Pinheiro, P., Minczuk, M. A. Genotyping Single Nucleotide Polymorphisms in the Mitochondrial Genome by Pyrosequencing. J. Vis. Exp. (192), e64361, doi:10.3791/64361 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter