Summary
Pirosekans testleri, heteroplazmik hücrelerde veya dokularda mitokondriyal DNA tek nükleotid polimorfizmlerinin sağlam ve hızlı genotiplendirilmesini sağlar.
Abstract
Mitokondriyal genomdaki (mtDNA) mutasyonlar maternal kalıtsal genetik hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bununla birlikte, mtDNA polimorfizmlerine olan ilgi, mtDNA mutagenezi ile model üretme yeteneğinin yakın zamanda geliştirilmesi ve mitokondriyal genetik anormallikler ile kanser, diyabet ve demans gibi yaşa bağlı yaygın hastalıklar arasındaki ilişkinin yeni bir şekilde değerlendirilmesi nedeniyle son yıllarda artmıştır. Pyrosequencing, rutin genotipleme deneyleri için mitokondriyal alanda yaygın olarak kullanılan bir sentez yoluyla sıralama tekniğidir. Masif paralel dizileme yöntemleriyle karşılaştırıldığında göreceli olarak satın alınabilirliği ve uygulama kolaylığı, onu mitokondriyal genetik alanında paha biçilmez bir teknik haline getirmekte ve heteroplazminin artan esneklikle hızlı bir şekilde nicelleştirilmesine izin vermektedir. Bu yöntemin pratikliğine rağmen, mtDNA genotiplemesinin bir aracı olarak uygulanması, özellikle biyolojik veya teknik kökenli belirli önyargılardan kaçınmak için belirli kılavuzların gözlemlenmesini gerektirir. Bu protokol, heteroplazmi ölçümü bağlamında kullanılmak üzere pyrosequencing testlerinin tasarlanması ve uygulanmasında gerekli adımları ve önlemleri özetlemektedir.
Introduction
Mitokondriyal genom, matris olarak adlandırılan mitokondrinin en iç bölmesinde bulunan küçük (16.5 kb) dairesel moleküller (mtDNA) formunda bulunur ve mitokondriyal solunum zincirinin 13 alt birimini ve ayrıca mitokondriyal ribozom1 tarafından yerinde translasyonu için gerekli olan tRNA'ları ve rRNA'ları kodlar. Bu genom, mitokondriyal fonksiyon için gerekli olan tüm proteinlerin yaklaşık% 1'ini temsil eder, geri kalanı nükleer DNA (nDNA) tarafından kodlanır. Mitokondrilerin, alfa-proteobakteriyel bir ata ile atasal bir ökaryotik hücre arasındaki endosimbiyotik füzyon olayından türetildiği varsayılmaktadır. Bu varsayımsal simbiyoz gerçekleştikten sonra, mitokondrinin genetik bilgisi, modernsiyanobakterilerin genomlarıyla karşılaştırıldığında mtDNA'nın yukarıda belirtilen kompaktlığını açıklayan çağlar boyunca çekirdeğe kademeli olarak aktarıldı. Genlerin böyle bir transferi, mtDNA'da bulunan dizilere oldukça homolog olan uzun nDNA uzantılarının varlığı ile en güçlü şekilde kanıtlanmıştır. Bu nükleer mitokondriyal diziler (NUMT'ler), genotipleme sırasında yaygın bir yanlış yorumlama kaynağıdır ve mtDNA3'ü genotiplendirirken nükleer önyargıları önlemek için bazı önlemler alınmalıdır (Şekil 1A).
mtDNA'nın bir diğer ayırt edici özelliği, kopya sayısının hücre tipine bağlı olarak değişmesi vehücre başına on binlerce kopya 4 arasında herhangi bir yerde numaralandırılmasıdır. Bu çok kopyalı doğası nedeniyle, mtDNA, tek bir hücre içinde çok çeşitli genotipleri barındırabilir, bu da kromozomların zigotluğu göz önüne alındığında, nükleer genlerle ilişkili ayrık alellerin aksine, alellerin daha sürekli bir dağılımına neden olabilir. Mitokondriyal alellerin bu heterojenliği, tipik olarak belirli bir mutasyonun yüzde prevalansında belirli bir hücredeki toplam mtDNA'nın bir oranı olarak ifade edilen mitokondriyal heteroplazmi olarak adlandırılır. Heteroplazmi, bir hücrede bulunan benzersiz bir mtDNA türünü ifade eden homoplazmi ile karşılaştırılabilir.
Mitokondriyal heteroplazminin ölçülmesi, patojenik varyantları barındıran mtDNA moleküllerinin oranını ölçerken özellikle ilgi çekicidir. Bu tür varyantlar, tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), küçük indeller veya büyük ölçekli delesyonlar şeklinde gelir5. Çoğu insan patojenik varyantlar için heteroplazmiktir; Bununla birlikte, genellikle eşik etkisi6 olarak adlandırılan bir fenomende patojenik mtDNA'nın daha yüksek heteroplazmi seviyelerinde ortaya çıkan herhangi bir klinik fenotip sergilemezler. Patojenite ile ilişkili değerler, patojenik mutasyonun doğasına ve meydana geldiği dokuya büyük ölçüde bağlı olsa da, tipik olarak% 60 heteroplazmi7'nin üzerindedir.
Mitokondriyal genotiplemenin yaygın olduğu birkaç araştırma alanı vardır. Tıp alanında, mtDNA mutasyonlarının test edilmesi veya ölçülmesi, birçoğu kökenleri olarak mtDNA anormalliklerine sahip olan mitokondriyal hastalıklar için bir tanı kriteri olarak hizmet edebilir5. İnsan patojenik mutasyonlarının incelenmesine ek olarak, mtDNA'da patojenik SNP'leri barındıran hayvan modellerinin prevalansının artması muhtemeldir, mitokondriyal olarak hedeflenmiş DddA kaynaklı sitozin baz editörleri (DdCBE'ler)8 ve adenin baz düzenlemesi için TALE bazlı deaminazlar (TALED'ler) tarafından sağlanan mitokondriyal baz düzenlemesinin son zamanlarda ortaya çıkması göz önüne alındığında9. Bu yaklaşım, anormal mitokondriyal genotipler ile ortaya çıkan işlev bozuklukları arasındaki etkileşimi anlamada etkili olacaktır. Ayrıca, insan mitokondriyal hastalıklarında terapötik bir strateji olarak nihai kullanım için mitokondriyal genomun, heteroplazmi kayması olarak bilinen bir yaklaşımla yeniden şekillendirilmesi için devam eden bilimsel araştırmalar da vardır. Bu araştırma alanı öncelikle mutasyona özgü nükleazların mitokondriyal matrise yönlendirilmesini içerir; bu, patojenik mtDNA'nın tercihli bozulmasına neden olur ve fenotip10,11,12,13'te kurtarmalara yol açar. Mitokondriyal genotipin yeniden şekillendirilmesini içeren herhangi bir deney, heteroplazmi kaymalarını değerlendirmek için sağlam bir nicel yöntem gerektirir.
MtDNA'yı genotiplemek için çok çeşitli yöntemler kullanılır ve bunlar mutasyonun doğasına göre değişir. Yeni nesil dizileme (NGS) yöntemleri, mtDNA'daki SNP'lerin nicelleştirilmesi söz konusu olduğunda daha hassastır; Bununla birlikte, bu yöntemler, özellikle numune sayısı küçükse, mitokondriyal heteroplazminin rutin nicelleştirilmesi için engelleyici derecede pahalı olmaya devam etmektedir. Sanger dizilimi, SNP'lerin algılanmasına da izin verebilir; Bununla birlikte, bu yaklaşım nicel değildir ve genellikle düşük heteroplazmi seviyelerini tespit etmekte başarısız olur veya yüksek heteroplazmileri tahmin ederken yanlış olabilir. Pyrosequencing, minimal hazırlık içeren ve herhangi bir mtDNA örneği için heteroplazminin hızlı bir şekilde nicelleştirilmesini sağlayan bir tahlil olarak, bu iki uç nokta arasında uygun bir uzlaşma olarak önerilmektedir. Bu yöntem, adli analiz 14,15, klinik tanı 16 veya mtDNA'nın tek hücrelerden genotiplenmesi 17 dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda çok sayıda araştırmacı tarafından mitokondriyal SNP'leri ölçmek için rutin olarak kullanılmıştır.
Bu tahlil, mtDNA'da SNP'yi çevreleyen bir bölgenin ilk PCR preamplifikasyon adımını içerir ve bunu daha önce üretilen amplikonun bir ipliğini kullanarak sentez yoluyla bir sıralama testi izler. Ön amplifikasyon adımında kullanılan iki primerden biri, 5' ucunda biyotinillenmelidir, bu da pirozanslama aparatının, dizileme reaksiyonu için şablon olarak kullanılacak tek DNA ipliğini izole etmesini sağlayacaktır. Üçüncü bir dizileme primeri daha sonra tutulan biyotinile iplikçik üzerine tavlanır, bu da deoksinükleotidler olarak ortaya çıkan DNA sentezinin reaksiyon odasına önceden tanımlanmış bir sırayla dağıtılmasına izin verir. Pirosequencer, ışıldayan bir okumaya dayanarak dahil edilen her bir bazın miktarını kaydeder ve DNA sentezi üzerine mutant ve vahşi tip mitokondriyal alellerin nispi nicelleştirilmesine izin verir (Şekil 1B). Lüminesans, ATP varlığında ışık yayan bir lusiferaz enzimi tarafından üretilir, bu da bir ATP sülfürilazın her bir nükleotid tarafından salınan pirofosfatlardan her birleşme olayında de novo sentezlediği ışığı yayar. Bu iki reaksiyon şu şekilde özetlenebilir:
1. PPi (nükleotid birleşmesinden) + APS → ATP + sülfat (ATP sülfürilaz)
2. ATP + lusiferin +O2 → AMP + PPi + oksilüsiferin + CO2 + ışık (lusiferaz)
İkinci reaksiyonda lusiferaz ile çapraz reaksiyona giren ATP olmadan pirosequencer tarafından adenin bazlarının tespit edilmesi bir zorluktur. Bununla birlikte, bu, DNA sentezi için bir adenin analoğu, yani dATPαS kullanılarak çözülür. Lusiferaz için mükemmel bir substrat olmamasına rağmen, pirosequencer tarafından dijital olarak ayarlanan ve 0.9 faktörüne ayarlanan diğer üç nükleotid ile karşılaştırıldığında daha güçlü bir lüminesans üretir. Bu doğal değişkenlik nedeniyle, SNP pozisyonunda adenin diziliminden kaçınılması önerilmektedir (daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakınız).
Aşağıdaki protokol, pirozanslama ile mtDNA heteroplazmi değerlendirme yöntemini detaylandırmakta ve mtDNA'daki SNP'leri genotiplendirirken biyolojik veya teknik önyargıyı önlemek için amplifikasyon primerlerinin tasarımında gerekli önlemleri özetlemektedir. İkincisi, astar setlerinin dijital olarak incelenmesini ve seçilmesini, ön amplifikasyon PCR'sinin optimize edilmesini ve son olarak tahlilin sıralanmasını ve rafine edilmesini içerir. İki uygulamalı örnek tahlil gösterilmiştir: birincisi, en yaygın insan patojenik varyantı m.3243A>G18'in optimizasyonu ve ikincisi, Cambridge 10,11,12,19,20,21,22'deki Minczuk laboratuvarında geliştirilen teknolojiler kullanılarak heteroplazmi kayması geçiren fare embriyonik fibroblast (MEF) hücrelerinin genotiplenmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan insan 3243A>G cybrid hücrelerinin ve ölümsüzleştirilmiş m.5024C>T MEF'lerin kullanımı için bilgilendirilmiş onam verilmiştir. Hasta hücreleri Cambridge Üniversitesi'nde toplanmadığı için bu durumda etik onay gerekli değildi. Bununla birlikte, insan fibroblastlarının kullanımı etik onay gerektirebilir. Pirosekans için örnek DNA'yı hazırlarken PCR kurulumu için en iyi uygulamaları takip etmeniz şiddetle tavsiye edilir. Aynı primerlerin kullanıldığı sık amplifikasyon, amplikon kontaminasyonuna yol açabilir ve PCR öncesi ve PCR sonrası alanlar arasında katı bir ayrım gözlenmezse, sonraki genotiplemeye önyargı getirebilir. Burada sunulan boru hattı, tek bir üreticinin özel ekipmanlarını kullanır; detaylar Malzeme Tablosunda bulunabilir. PCR için astar tasarımı istenirse manuel olarak gerçekleştirilebilir; ancak, bu amaçla mevcut yazılımların kullanılması önerilir ( Malzeme Tablosuna bakınız).
1. Pyrosequencing astar tasarımı ve tahlil seçimi
- Primer adaylarının yazılım ile elde edilmesi
- Genotiplendirilen türler için bir mtDNA dizi dosyası edinin ve SNP'nin konumunu tanımlayın. SNP'nin konumunun kolayca tanımlanabilmesi için kullanılan referans dizisinin, incelenen mutasyon için uygun baz numaralandırmasını kullandığından emin olun.
- SNP sitesinin yukarı ve aşağı yönünde 1.000 baz çiftini kopyalayın ve kesilen diziyi pyrosequencing astar tasarımı için tasarlanan yazılıma yapıştırın ( bkz.
- Analiz edilen SNP tabanını, polimorfik tabanı vurgulayarak ve sağ tıklayıp ardından hedef bölgeyi ayarla'yı seçerek yazılımdaki pyrosequencing testinin hedefi olarak ayarlayın.
- Primer seçimini başlatmak için arayüzün sağ üst köşesindeki oynat simgesine basın.
- Yazılımın şimdi otomatik olarak primer üçlüsü oluşturmasını bekleyin: şablon DNA'nın ön amplifikasyonu için iki primer ve pyrosequencing makinesinde sentez yoluyla dizileme için üçüncü bir astar. Sağ tıklayıp Tüm astar setlerini kopyala'yı seçerek tüm astar setlerini koruyun.
- Oluşturulan listeden en uygun astar setlerinin seçilmesi
- Astarlama kümelerini, kalite puanına göre azalan sırada sağlayan yazılım çıktısına dayalı olarak en yüksek kalite puanına sahip astar kümelerini koruyun. Mümkünse, puanı 80'in altında olan astar setlerini atlayın.
- Tutulan astar setleri için, amplifikasyon primerleri tarafından üretilen amplikonu tanımlayın ve kopyalayın.
- https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi'daki çevrimiçi gönderim portalını kullanarak NCBI Blast kullanılarak genotiplendirilecek organizmanın tüm genomu ile üretilen amplikonları hizalayın. Gönderim sırasında açılır menülerden aşağıdakileri seçin:
- Veritabanı Seçin | Genomik + Transkript veritabanları.
- Analiz edilen SNP'ye bağlı olarak açılır menüden İnsan veya Fare'yi seçin.
- Şunun için optimize et'i seçin | Biraz benzer diziler (Blastn).
- (İsteğe bağlı) Fare veya insan dışında bir organizmayı genotiplendiriyorsanız, gönderim sırasında aşağıdakileri seçin:
- Veritabanı Seçin | Standart veritabanı.
- Açılır menüden RefSeq Temsilcisi genomları'nı seçin
- Şunun için optimize et'i seçin | Biraz benzer diziler (Blastn)
- Mümkün olduğunda, mtDNA amplikonuna mükemmel homolojiye sahip herhangi bir amplikonu atlayın, özellikle de primer bağlanma bölgeleri mükemmel homolog ise (tartışmaya bakınız).
NOT: BLAST hizalama aracı, amplifikasyon öncesi amplikonlara kayda değer homolojiye sahip herhangi bir diziyi döndürecektir. Bu, girişte açıklanan NUMT'lerin tespit edilmesine izin verir; bu, hesaba katılmazsa, mitokondriyal DNA ile birlikte güçlendirildikleri için bir önyargıya neden olabilir. - Bu boru hattı ile elde edilen oligoları sipariş edin. Sentez sırası sırasında doğru amplifikasyon primerine 5' biyotin modifikasyonunun eklendiğinden emin olun, böylece dizileme astarı biyotinile ipliği tamamlayıcı olacaktır.
NOT: Sıralama astarı seçimi, amplifikasyon primerlerinden daha esnektir ve sıralama astarının 3' ucunu ve değişken konumu ayıran en az bir bazın olması önerilir.
2. Preamplifikasyon PCR optimizasyonu
- Uygun bir yöntem kullanarak toplam genomik DNA'yı çıkararak DNA örneklerini hazırlayın.
NOT: Bu büyük ölçüde genotiplendirilen hücrelerin sayısına ve kökenlerine bağlı olacaktır. DNA, proteinaz K içeren bir lizis tamponu kullanılarak tek hücrelerden izole ediliyorsa, numune, sonraki PCR sırasında polimerazı bozmamak için 10 dakika boyunca 95 ° C'de denatüre edilmelidir. - PCR kurulumu ve termal blok ayarları
- PCR'yi tercih edilen yüksek doğruluklu bir polimeraz ile ayarlayın. Dört reaksiyon için bir Master Mix hazırlayın. Bir pirozezans çalışması için sadece 10 μL PCR reaksiyonu gerektiğinden, 25 μL PCR reaksiyonu hazırlayın (gerekirse teknik bir tekrara izin vermek için). Hem ileri hem de geri primerlerin 1 μM'si ile başlangıç materyali olarak yaklaşık 10 ng genomik DNA içeren 40 döngü PCR kullanın.
- Uzatma süresini, seçilen ön amplifikasyon primerlerinin uzunluğunu dikkate alarak, kullanılan polimeraz için üreticinin spesifikasyonlarına göre ayarlayın.
- Değişken tavlama sıcaklığı ayarlarına sahip bir termal döngüleyici kullanın. Tavlama sıcaklığı astar dizisine, polimeraz tamponunun tuz içeriğine ve diğer faktörlere bağlı olarak farklılık gösterebildiğinden, termal döngü programına dört farklı tavlama sıcaklığı programlayın.
NOT: Temsili sonuçlarda çalışılan örnekte aşağıdaki sıcaklıklar kullanılmıştır: 55 °C, 60 °C, 65 °C ve 70 °C. - Master Mix'i dört adet 200 μL PCR tüpüne bölün ve bunları 40 döngü boyunca termal döngüleyicide seçilen dört tavlama sıcaklığının her birinde çalışacak şekilde ayarlayın.
- Ön amplifikasyon bandı görselleştirme
- PCR çalışması sırasında, görselleştirme maddesi olarak SYBR Safe veya ethidyum bromür ile 1x TBE'de% 2'lik (w / v) bir agaroz jeli hazırlayın.
NOT: Güçlendirilmiş parçalar genellikle kısa, tipik olarak 100 ila 500 baz çifti arasında değiştiğinden, görselleştirme için daha yüksek bir yüzde jeli önerilir. - Adım 2.2'deki PCR tamamlandıktan sonra, reaksiyonun 10 μL'sini uygun miktarda DNA yükleme tamponu ile karıştırın ve yaklaşık 45 dakika boyunca 7 V / cm'de% 2 agaroz jeli üzerinde çalıştırın.
- Elde edilen DNA parçalarını bir UV transilluminatörü üzerinde görselleştirin.
NOT: Ön amplifikasyon adımı için seçilen termal döngü koşulları, beklenen boyutta tek bir temiz bant üretmelidir. Daha düşük tavlama sıcaklıkları bazen hedef dışı amplifikasyona neden olabilir, bu da sonraki pyrosequencing'e önyargılar getirebilir. - Sonraki amplifikasyonlar için doğru boyutta temiz bir bant üreten en düşük tavlama sıcaklığını seçin.
- (İsteğe bağlı) Beklenen boyuttaki bir bandı tüketin, tercih edilen bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın ve numunenin yaklaşık heteroplazmisini referans olarak doğrulamak için Sanger dizilimi ile analiz edin.
- PCR çalışması sırasında, görselleştirme maddesi olarak SYBR Safe veya ethidyum bromür ile 1x TBE'de% 2'lik (w / v) bir agaroz jeli hazırlayın.
3. Cihaz kurulumu ve çalıştırması
NOT: Önceki bölümdeki PCR adımı optimize edildikten sonra, bir sonraki adım, spesifik SNP'yi analiz etmek için pirosequencer'ı doğru nükleotid dizisiyle programlamayı içerir. Bu, sıralama astarının 3' ucunun doğrudan aşağı yönünde 10 baz girmeyi içerir. Bu, aşağıdaki bölümde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Tahlil yapılandırması
- Pirosequencer ile birlikte verilen çalıştırma yazılımını açın ve arayüzün sol üst köşesindeki Yeni Tahlil'i seçin.
- Alel niceleme testi şablonunu seçin.
- Analiz edilecek Sekansı, ilgili SNP'nin yukarı akışı olması gereken dizileme astarının doğrudan aşağı yönünde dahil edilecek nükleotidleri yazarak ilgili kutuya girin. Değişken konum için, eğik çizgiyle ayrılmış iki olası tabanı belirtin (örneğin, A/T).
- Dağıtım sırası oluştur düğmesine basın ve yazılımın sentez yoluyla sıralama reaksiyonunda dağıtılacak nükleotidler için uygun bir sırayı otomatik olarak belirlemesine izin verin.
- Kaydedin ve test için bir ad sağlayın.
- Reaktif hazırlama ve depolama
- Pirosequencer reaktif kitinde sağlanan Tavlama Tamponunda 4 μM'ye sipariş edilen sıralama astarını seyreltin.
NOT: Sıralama astarı önce bir stok çözeltisi olarak suda 100 μM'ye kadar seyreltilebilir ve daha sonra gerektiğinde Tavlama Tamponunda 4 μM'ye kadar seyreltilebilir. - Enzim ve substrat hazırlama ve kullanma
- İlk kutudan çıkarken, liyofilize enzimi ve substratı üreticinin tavsiyelerine göre yeniden çözün. Kullanılmadığında -20 °C'de saklayın.
- Daha sonraki kullanımda, enzim ve substrat şişelerini -20 ° C'den çözün.
NOT: Sağlanan kitteki diğer tüm reaktifler 4 °C'de buzdolabında tutulabilir. Seyreltilmiş dizileme astarları da 4 °C'de tutulabilir.
- Her reaktifin gerekli miktarını buz üzerine yerleştirin.
- Gerekli kalan bileşenleri, yani streptavidin kaplı manyetik boncukları, emici şeritleri ve pyrosequencing disklerini 4 ° C'de tutun.
- Pirosequencer reaktif kitinde sağlanan Tavlama Tamponunda 4 μM'ye sipariş edilen sıralama astarını seyreltin.
- Yürütmeyi çalıştır
NOT: Bir tahlil ilk tasarlandığında, bilinen heteroplazmiye sahip PCR ürünleri kullanılarak kalibre edilmelidir, bu da tahlilin heteroplazmileri doğru bir şekilde ayırt edebilmesini sağlar. Araştırmacılar, bilinen heteroplazmideki PCR ürünlerinin karışımlarını standart olarak kullanabilirler. Örnekler, giriş ve tartışmada belirtilen diğer yöntemlerle, özellikle de NGS ile doğrulanabilir.- Analiz edilecek DNA'yı 5 ng / μL'ye seyreltin. Özellikle ilk çalışmada, bilinen heteroplazmi örneklerini referans olarak ve / veya vahşi tip örnekleri dahil ettiğinizden emin olun.
- Bölüm 1 ve bölüm 2'de tanımlanan amplifikasyon primerlerini ve parametrelerini kullanarak 25 μL reaksiyonlarda 5 μL seyreltilmiş DNA'nın ön sekanslama PCR'sini gerçekleştirin. Her numune için teknik PCR çoğaltmaları gerçekleştirin.
NOT: Ön amplifikasyon PCR, dizilemeye geçmeden önce 4 ° C'de kısa süreli veya -20 ° C'de uzun süreli olarak saklanabilir. - Dosya kurulumunu çalıştırma
- Pyrosequencer yazılımının sol üst köşesindeki Yeni Çalıştır'ı seçin.
- Pirosequencer, aynı anda 48 ayrı önceden güçlendirilmiş reaksiyonu sıralayabilir, boş bir kare bir pirozanslama diskinde tek bir sıralama kuyusunu temsil eder. Bölüm 3.1'de yapılandırılan tahlilleri bir kareye sağ tıklayıp yük tahlilini seçerek yükleyin. Gerekirse, farklı sıralama primerleri ile dört adede kadar ayrı tahlil sıralayın.
- Çalıştırma için kullanılan her sekanslama astarı için otomatik olarak bir enjeksiyon odası atamak üzere astar dağıtım modunu Otomatik olarak ayarlayın.
- Bir sıralama diskinde dört farklı türde tahlil çalıştırmadıkça Çalıştırma modunu Standart olarak ayarlayın.
- Çalıştırma şablonu dosyasındaki tahlil sayısının, yükseltilen PCR reaksiyonlarının sayısıyla eşleştiğinden emin olun.
NOT: 48'den fazla örnek çalıştırıyorsanız, ek çalıştırma dosyalarının ayarlanması gerekir. - Çalıştırma dosyalarını bir USB sürücüsüne kaydedin.
- Pirosequencer'ın astarlanması
- Cihazın ana dokunmatik ekranındaki Temizleme düğmesine basın ve ekrandaki talimatları izleyerek tüm enjektörleri yüksek saflıkta suyla temizleyin. Emici şeridi makineye takarken, uçların "saat 9 yönünde" (merkezin doğrudan solunda) buluştuğundan emin olun.
- Adım 3.3.3'te ayarlanan çalıştırmalarla USB belleği takın ve adım 3.3.3'te tanımlanan çalışma dosyalarını yükleyin.
NOT: Çalıştırma dosyaları USB'deki herhangi bir dizin veya klasörün dışına kaydedilmelidir, aksi takdirde makine tarafından okunamazlar. - Reaktifleri makinedeki ilgili enjektörlere gerektiği gibi yüklemek ve astarlamak için cihazdaki talimatları izleyin.
- Örnek disk hazırlama ve tahlil başlatma
- Streptavidin kaplı manyetik boncukların oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
NOT: Bu boncuklar, cihazın ön amplifikasyon PCR adımından biyotinile ipliği yakalamasını sağlayacaktır. Kitten ayrı olarak satın alınmaları gerekir. - Adım 3.3.3'ten itibaren çalıştırma dosyasında tanımlanan kuyucuklara 3 μL boncuk yükleyin.
- İlgili numuneye dizilenecek her PCR reaksiyonunun 10 μL'sini yükleyin ve numuneyi manyetik boncuklarla karıştırmak için yukarı ve aşağı pipet yapın. Mümkünse kabarcıklardan kaçının.
- Astarlanmış pirosequencer'da diskin makineye yüklenebileceğinin göstergesini arayın. Yüklü numune plakasını disk bölmesindeki metal pimle hizalamadan önce plaka tutma somununu sökün.
- Plaka plaka bölmesine sıkıca vidalandıktan sonra, dokunmatik ekran arayüzündeki başlat düğmesine basarak sıralama işlemini başlatın.
- Streptavidin kaplı manyetik boncukların oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin.
4. Sonuç elde etme
- Çalıştırma tamamlandıktan sonra, USB sürücüsünü makineden çıkarın ve pirosequencer yazılımını çalıştıran bilgisayara tekrar takın. Aşağıdaki adımlarla devam ederken, günün son çalışması ise istemleri izleyerek pirosequencer'ı temizlemeye devam edin.
- Yeni oluşturulan çalıştırma dosyasının USB sürücüsünde görünmesini bekleyin ve çalıştırma sonucu dosyasına çift tıklayın. Bu, nükleotid katılımı üzerine her bir kuyucuğun lusiferaz çıkışını otomatik olarak analiz eder ve bölüm 3.1'deki tahlil konfigürasyonu sırasında tanımlanan mitokondriyal alelini nicelleştirir.
- Okumaların kalitesine bağlı olarak yazılım tarafından gösterilen aşağıdaki renk puanlarını arayın. Mavi en uygun çalıştırmayı, sarı uyarı içeren bir çalıştırmayı ve kırmızı başarısız bir çalıştırmayı gösterir. Sonuçları kaydetmek için üst pencerede Raporlar'ı seçin | Pirogramları ve çalıştırmanın her bir kuyucuğundan elde edilen sonuçları içeren bir .pdf dosyası oluşturmak için tam rapor. Alternatif olarak, sonuçları Raporlar sekmesi altındaki diğer biçimlerde de indirebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölümde, insan patojenik mtDNA mutasyonu için bir pirozanslama testinin örnek optimizasyonunun yanı sıra, mitokondriyal çinko parmak nükleazları (mtZFN'ler) ile tedavi edilen heteroplazmik (m.5024C>T) fare embriyonik fibroblastlarının (MEF'ler) genotiplendirilmesinden elde edilen dizileme verileri sunulmaktadır. Tahlilin insan hücreleri için optimize edilmesi ve iki farklı tahlilin karşılaştırılması, en doğru olanın nasıl seçileceğini gösterirken, ikinci örnekte genetiği değiştirilmiş MEF hücrelerinin genotiplendirilmesi, gen terapisi müdahalesinden sonra heteroplazmi kaymalarını tespit etmenin uygulamalı bir örneği olarak hizmet eder.
İnsan m.3243A>G mutasyonu
Bu örnek, mtDNA-m.3243A>G'nin yaygın bir patojenik varyantının genotiplemesini göstermektedir. Yaygın m.3243A>G mutasyonu, başta mitokondriyal ensefalopati laktik asidoz ve inme benzeri ataklar (MELAS), maternal kalıtsal sağırlık ve diyabet (MIDD) ve ilerleyici eksternal oftalmopleji (PEO)23 olmak üzere birçok klinik hastalığın temelini oluşturur. Bu tahlil, protokolün bölüm 3.1.3'ünde açıklandığı gibi, dahil edilecek nükleotidlerin dizisini yeniden programlayarak daha az yaygın olan m.3243A>T varyantı24'ü genotiplemek için de kullanılabilir.
Bölüm 1'deki astar optimizasyon yönergelerini takiben, her iki iplik için de birer tane olmak üzere aşağıdaki astar setleri seçilmiştir:
Tahlil 1:
İleri: 5' - [Biotin] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Ters: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Sıralama: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'
Amplicon boyutu: 215 bp
Tahlil 2:
İleri: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Ters: 5' - [Biotin] GTTGGCCATGGGTATGTTGTT- 3'
Sıralama: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'
Amplicon boyutu: 182 bp
Tahlil için termal döngü koşullarını belirlemek için, bir Sıcak Başlangıç polimerazı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanan bir termal gradyan PCR, ilk olarak bölüm 2'yi takiben elektroforez ile gerçekleştirilmiş ve analiz edilmiştir. Başlangıç şablonu olarak yaklaşık 10 ng DNA'yı yükseltmek için kırk döngü kullanıldı. Protokolde bölüm 2.3 kapsamındaki adımları takiben, belirli bir tavlama sıcaklığında amplifikasyon protokolünün özgüllüğünü doğrulamak için bir agaroz jel elektroforezi gerçekleştirildi (Şekil 2A). Doğru boyutlarda (215 bp veya 182 bp) başarılı bantlar tüm sıcaklıklarda gözlemlenebilir; Bununla birlikte, tahlil 1'deki daha düşük tavlama sıcaklıkları, hedef dışı amplifikasyona neden olmuştur. Ön amplifikasyon için uygun tavlama sıcaklığı 70 °C olarak belirlenmiştir (Şekil 2A). Her iki tahlilin doğruluğunu belirlemek ve en iyisini seçmek için, bilinen m.3243A>G yüzdesinin molar standartları, uygun hacimlerde saf PCR ürününün çeşitli oranlarda karıştırılmasıyla oluşturulmuştur: sırasıyla% 0,% 10,% 25,% 50,% 75,% 90 ve% 100 m.3243A>G (Şekil 2B, noktalı çizgi). Her iki tahlili de standartlar üzerinde gerçekleştirirken, Tahlil 2'de beklenen sonuçla daha büyük bir korelasyon gözlemledik (Şekil 2B). Daha sonra bir genotipleme deneyinde m.3243A>G cybrid hücreleri üzerinde her iki tahlili de kullandık ve tahlil 1'de, özellikle homoplazmik koşulların yakınında belirgin bir önyargı gözlemledik (Şekil 2C).
Murin m.5024C>T mutasyonu
Bu örnek, m.5024C>T mutasyonu12 seviyesini azaltmak için geliştirilen mtZFN'lerle tedavi edilen MEF hücrelerini, pirozozanslama ile genotiplemenin örnekler arasında nicel bir karşılaştırma olarak yararlı olduğu bir mitokondriyal gen terapisi deneyinin bir örneği olarak içerir. MEF hücreleri, fare mtDNA'sında (m.5024C>T)25 pozisyonunda 5.024 pozisyonunda bir C>T mutasyonu barındıran yayınlanmış bir fare modelinden türetilmiştir. Deney, MEF'lerin mtZFN'leri ve farklı floresan muhabirlerini kodlayan plazmidlerle elektroporasyonunu ve daha sonra plazmidleri eksprese eden hücrelerin 24 saat sonra FACS tarafından sıralanmasını içeriyordu. Hücrelerin daha sonra pirozezans ile heteroplazmi karşılaştırmasından önce 2 hafta boyunca iyileşmelerine izin verildi.
M.5024C>T pozisyonunu sıralamak için kullanılan astar seti aşağıdaki gibidir:
İleri: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Ters: 5' - [Biotin] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
Sıralama: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'
Amplicon boyutu: 267 bp
Örnekler, sonuçların doğruluğunu artırmak için teknik üçlü olarak sıralandı. Deney ayrıca biyolojik kopya olarak da gerçekleştirildi, böylece koşulların her biri için altı ayrı değer üretildi (Şekil 3B). 18 pirogramdan 2'sinden elde edilen veriler Şekil 3B'yi oluşturmak için kullanılmıştır; bu pirogramlar Şekil 3A'da gösterilmiştir.
Şekil 1: Bir hücredeki mitokondriyal dizileri temsil eden şemalar ve pirosekanslamanın genel teknik taslağı. (A) Mitokondriyal DNA ve nükleer mitokondriyal dizilerin şematik gösterimi. Şekil, yüksek homoloji dizilerinin evrimsel kökenini temsil etmektedir. (B) Pirosequencing tahlil boru hattının, yaklaşık% 50 C>G heteroplazmi değerini gösteren son bir örnek dizisi ile şematik gösterimi. Şablon DNA ilk önce seçilmiş amplifikasyon primerleri tarafından büyütülür, bunlardan biri 5' ucunda biyotinile edilir. Amplifikasyon sonrası, pirosequencer, mavi renkle gösterilen streptavidin kaplı manyetik boncukları kullanarak dizileme için şablon olarak tek bir DNA ipliğini tutar. Son olarak, bir dizileme astarı, önceden tanımlanmış bir nükleotid serisinin sentezi ile dizilemeye izin verir ve şematik olarak temsil edilen bir pirogram üretir. Her bir bazın stokiyometrileri, her bir birleşme olayında göreceli tepe yükseklikleri karşılaştırılarak kolayca elde edilir: aynı nükleotid, arka arkaya iki kez, tek bir baza kıyasla çift tepe noktası üretecektir. Analiz edilecek dizideki eğik çizgi, "C" veya "G" olabilen varsayımsal SNP'yi gösterir. Pirogramın x ekseni üzerinde, tipik olarak pirosequencer tarafından negatif bir kontrol olarak gerçekleştirilen sahte bir "G" tabanının ilk dağıtımına dikkat edin. Kısaltmalar: mtDNA = mitokondriyal DNA; NUMT'ler = nükleer mitokondriyal diziler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnsan m.3242A>G mutasyonunda gösterildiği gibi pyrosequencing primer setinin optimizasyonu. (A) m.3242A>G mutasyonu için seçilen her iki setten amplifikasyon primerleri kullanılarak bir PCR amplifikasyonunun agaroz jel elektroforezi (%2 w/v). WT, vahşi tip kontrol DNA'sını ifade ederken, Het analiz edilecek neredeyse homoplazmik m.3243A>G örneğidir. Sıcaklıklar, 40 döngülü bir PCR reaksiyonunda kullanılan tavlama sıcaklığıdır. (B). Kalibrasyon için molar standartlar kullanılarak her iki astar setinin performansının karşılaştırılması, saf vahşi tip ve saf mutant m3243A>G ürününün çeşitli oranlarının karıştırılmasıyla elde edilmiştir. Ölçülen değerler dikey noktalı çizgilerle gösterilir. Test edilen iki tahlilin her birinin ideal bir ölçüme ne kadar yakın olduğunu göstermek için bir X = Y doğrusal fonksiyonu görüntülenir. X eksenindeki hücre çizgilerinin isimleri, bu tahlil kullanılarak genotiplendirilen çeşitli cybrid klonlarının isimleridir. (C) Genotipleme, her iki tahlil kullanılarak bilinmeyen m.3243A>G heteroplazmisinin dört cybrid klonu üzerinde sonuçlanır. Sıralama teknik üçlü olarak yapıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: mtZFN gen düzenleme teknolojisi ile muamele edilen FACS sıralı m.5024C>T MEF'lerde heteroplazmi ölçümü. (A) İki MEF hücresi örneğinden alınan pirogramlar, Şekil 3B'nin yanı sıra vahşi tip genotipleme kontrolünü oluşturmak için kullanılan PCR replikalarıdır. Y eksenindeki lüminesans değerleri, mtZFN ile muamele edilmiş hücrelerin A.U. (B) Genotipleme sonuçlarında, işlenmemiş ve alay ile muamele edilmiş kontrollerle birliktedir. MEF'ler, mtZFN'leri kodlayan plazmidler ve farklı floresan muhabirleri ile elektroporate edildi ve daha sonra 24 saat sonra FACS tarafından sıralandı. Hücrelerin daha sonra pirozezans ile heteroplazmi karşılaştırmasından önce 2 hafta boyunca iyileşmelerine izin verildi. Hata çubukları, her biri teknik üçlü olarak pirozanslama işlemine tabi tutulan biyolojik kopyalarla hesaplandı. Kısaltmalar: FACS = floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama; MEF'ler = fare embriyonik fibroblastları; mtZFN = mitokondriyal çinko parmak nükleazı; A.U. = keyfi birimler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokolün başarısı için kritik bir husus, özellikle düşük miktarda başlangıç malzemesi kullanıldığında kontaminasyondan kaçınmaktır. Numuneleri hazırlarken mümkün olduğunca UV davlumbaz ve filtrelenmiş pipet uçlarının kullanılması, ayrıca ön amplifikasyon ve amplifikasyon sonrası alanların ayrı tutulması önerilir. Boş ölçümler ve bilinen heteroplazmi örnekleri (vahşi tip DNA gibi), teknik veya biyolojik önyargıyı kontrol etmek için kıyaslama ölçütü olarak kullanılmak üzere her zaman dahil edilmelidir.
Tahlile özgü kayda değer bir teknik önyargı, adenin analog birleşmesi tarafından üretilen artan ışıldayan sinyaldir. Adenin değişken bir konumda kullanıldığında, genellikle artık bir floresan tepe noktası üretir (örneğin, Şekil 2C). Bu nedenle, adenin analogunu değişken pozisyonda dahil etmek zorunda kalmamak için mümkün olduğunda, karşı iplikçikte (bir timinin dahil edileceği yerde) pirozanslama testlerinin yapılması tavsiye edilir. Bununla birlikte, A>T veya T>A mutasyonları durumunda, bu imkansızdır. Bununla birlikte, temsili sonuçlarda kanıtlandığı gibi, bir tahlil tasarlarken uygun bir primer seçimi daha büyük önem taşıyabilir. M.3243A>G mutasyonu için tahlil 2, temsili sonuçların ilk bölümünde, T / C oranını ölçen tahlil 1'in aksine, değişken konumdaki A / G oranına dayanan diziler. Adenin birleşme yanlılığına duyarlı olmasına rağmen, tahlil 2, basit bir doğrusal regresyon analizi ile gösterildiği gibi, molar standartlarla karşılaştırmaya dayanarak daha doğru sonuçlar verir (Şekil 2B).
Önyargılar öncelikle NUMT eş-amplifikasyonu3'ün sonucudur. Büyük mitokondriyal kopya sayısı tipik olarak nükleer hedef dışı dizilerin önemli bir önyargı getirmesini önler; Bununla birlikte, mtDNA'nın belirli bölgeleri birçok NUMTS'de bulunur ve bölüm 1 altındaki protokolde belirtilen yöntemler kullanılarak kaçınılmalıdır.
Yukarıda belirtilen önlemleri alırken, bu yöntem mtDNA'daki SNP'leri genotiplemenin son derece modüler, hızlı ve uygun maliyetli bir yoludur. Bununla birlikte, yöntem tüm mitokondriyal genotipleme uygulamaları, özellikle de dijital damlacık PCR'nin önerildiği büyük ölçekli delesyonlar için uygun değildir26. Reaktiflerin sıralayıcı veya farklı primerler / amplifikasyon koşulları tarafından dağıtılmasındaki değişkenlik, küçük önyargıların ortaya çıkmasına neden olabilir. Bu nedenle, genotipleme sonuçlarının doğruluğunu doğrulamak için genellikle teknik üçlü işaretler önerilir. Yaklaşımın bir başka sınırlaması da kapsamdır, çünkü mtDNA'nın sadece kısa, önceden tanımlanmış açıklıkları genotiplendirilebilir. Pirosequencerler, bilinmeyen sekansın yüzlerce baz çiftini dizilemek için programlanabilirken, bu hızlı bir şekilde bir NGS yaklaşımı kullanmaktan daha az uygun maliyetli hale gelir. Araştırmacılar başlangıçta pirozik dizilemeyi kesin bir nicel cevap veren hızlı bir genotipleme yöntemi olarak uygulayabilirler, ancak daha sonra daha fazla hassasiyet ve bağlam için seçilen örnekleri NGS tarafından analiz edebilirler.
Sonuç olarak, bu köklü yöntem, mitokondriyal genetik araştırmalarda temel bir unsur olmaya devam etmekte ve hasta teşhisi, gen terapisi veya hayvan modellerinin genotiplemesi gibi alandaki birçok araştırma bağlamında anahtar olan nicel heteroplazmi ölçümlerine hızlı ve basit erişim sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.M., Pretzel Therapeutics, Inc. PS-P.'nin kurucu ortağı, hissedarı ve Bilimsel Danışma Kurulu üyesidir. ve P.A.N. Pretzel Therapeutics, Inc. için danışmanlık hizmetleri vermektedir.
Acknowledgments
Silvia Marchet ve Constanza Lamperti'ye (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milano) bu protokol için açıklayıcı örnekler olarak kullanılan m.3243A>G cybrid hücrelerini hazırladıkları ve sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Mitokondriyal Genetik Grubu (MRC-MBU, Cambridge Üniversitesi) üyelerine bu araştırma sırasında yararlı tartışmalar için teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma, İngiltere Tıbbi Araştırma Konseyi'nin (MC_UU_00015/4 ve MC_UU_00028/3) çekirdek finansmanı ile desteklenmiştir. P.A.N. ve P.S.-P. ayrıca sırasıyla Lily Vakfı ve Champ Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G. Mitochondrial genetics. British Medical Bulletin. 106 (1), 135-159 (2013).
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Recent advances in mitochondrial disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 18, 257-275 (2017).
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
