Summary
Los ensayos de pirosecuenciación permiten el genotipado robusto y rápido de polimorfismos de nucleótido único de ADN mitocondrial en células o tejidos heteroplásmicos.
Abstract
Las mutaciones en el genoma mitocondrial (ADNmt) se han asociado con enfermedades genéticas hereditarias por la madre. Sin embargo, el interés en los polimorfismos de ADNmt ha aumentado en los últimos años debido a la capacidad recientemente desarrollada para producir modelos mediante mutagénesis de ADNmt y una nueva apreciación de la asociación entre las aberraciones genéticas mitocondriales y las enfermedades comunes relacionadas con la edad, como el cáncer, la diabetes y la demencia. La pirosecuenciación es una técnica de secuenciación por síntesis que se emplea ampliamente en todo el campo mitocondrial para experimentos de genotipado de rutina. Su relativa asequibilidad en comparación con los métodos de secuenciación paralela masiva y su facilidad de implementación la convierten en una técnica invaluable en el campo de la genética mitocondrial, lo que permite la cuantificación rápida de la heteroplasmia con mayor flexibilidad. A pesar de la practicidad de este método, su implementación como medio de genotipado de ADNmt requiere la observación de ciertas pautas, específicamente para evitar ciertos sesgos de origen biológico o técnico. Este protocolo describe los pasos y precauciones necesarios en el diseño e implementación de ensayos de pirosecuenciación para su uso en el contexto de la medición de heteroplasmia.
Introduction
El genoma mitocondrial existe en forma de pequeñas moléculas circulares (ADNmt) (16,5 kb) presentes en el compartimento más interno de las mitocondrias llamado matriz y codifica 13 subunidades de la cadena respiratoria mitocondrial, así como los ARNt y ARNr necesarios para su traducción in situ por el ribosoma mitocondrial1. Este genoma representa aproximadamente el 1% de todas las proteínas necesarias para la función mitocondrial, el resto de las cuales están codificadas por el ADN nuclear (ADNn). Comúnmente se asume que las mitocondrias se derivan de un evento de fusión endosimbiótica entre un ancestro alfa-proteobacteriano y una célula eucariota ancestral. Una vez que tuvo lugar esta simbiosis hipotética, la información genética de las mitocondrias se transfirió gradualmente al núcleo durante eones, lo que explica la compacidad antes mencionada del ADNmt en comparación con los genomas de las cianobacterias modernas2. Tal transferencia de genes se evidencia más fuertemente por la existencia de largos tramos de ADNn que son altamente homólogos a las secuencias que se encuentran en el ADNmt. Estas secuencias mitocondriales nucleares (NMT) son una fuente común de interpretación errónea durante el genotipado, y se deben tomar ciertas precauciones para evitar sesgos nucleares al genotipar el ADNmt3 (Figura 1A).
Otra característica distintiva del ADNmt es que su número de copias varía según el tipo de célula, numerando desde decenas hasta miles de copias por célula4. Debido a esta naturaleza de múltiples copias, el ADNmt puede albergar una amplia gama de genotipos dentro de una sola célula, lo que puede resultar en una distribución más continua de alelos en contraste con los alelos discretos asociados con genes nucleares cuando se considera la cigosidad de los cromosomas. Esta heterogeneidad de alelos mitocondriales se conoce como heteroplasmia mitocondrial, que generalmente se expresa en el porcentaje de prevalencia de una mutación dada como proporción del ADNmt total en una célula dada. La heteroplasmia se puede contrastar con la homoplasmia, que se refiere a una especie única de ADNmt presente en una célula.
La medición de la heteroplasmia mitocondrial es de particular interés cuando se cuantifica la proporción de moléculas de ADNmt que albergan variantes patogénicas. Tales variantes vienen en forma de polimorfismos de nucleótido único (SNP), pequeños indeles o deleciones a gran escala5. La mayoría de los seres humanos son heteroplásmicos para variantes patogénicas; sin embargo, no exhiben fenotipos clínicos, que a menudo sólo se manifiestan a niveles más altos de heteroplasmia de ADNmt patógeno en un fenómeno denominado efecto umbral6. Si bien los valores asociados con la patogenicidad dependen en gran medida de la naturaleza de la mutación patogénica y del tejido en el que ocurre, generalmente se encuentran por encima del 60% de heteroplasmia7.
Hay varias áreas de investigación en las que el genotipado mitocondrial es común. En el campo de la medicina, las pruebas o cuantificaciones de mutaciones en ADNmt pueden servir como criterio diagnóstico para enfermedades mitocondriales, muchas de las cuales tienen como origen las aberraciones del ADNmt5. Además del estudio de las mutaciones patogénicas humanas, es probable que aumente la prevalencia de modelos animales que albergan SNP patógenos en el ADNmt, dado el reciente advenimiento de la edición de bases mitocondriales habilitada por los editores de bases de citosina derivados de DddA (DdCBE)8 y las desaminasas basadas en TALE (TALED) para la edición de bases de adenina9. Este enfoque será fundamental para comprender la interacción entre los genotipos mitocondriales aberrantes y las disfunciones resultantes. También hay investigaciones científicas en curso sobre la remodelación del genoma mitocondrial para su uso final como estrategia terapéutica en enfermedades mitocondriales humanas a través de un enfoque conocido como desplazamiento de heteroplasmia. Este campo de investigación consiste principalmente en dirigir nucleasas específicas de mutación a la matriz mitocondrial; esto resulta en la degradación preferencial del ADNmt patógeno, lo que lleva a rescates en el fenotipo10,11,12,13. Cualquier experimento que implique la remodelación del genotipo mitocondrial requiere un método cuantitativo robusto para evaluar los cambios de heteroplasmia.
Se utiliza una amplia variedad de métodos para genotipar el ADNmt, y estos varían según la naturaleza de la mutación. Los métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) son más precisos cuando se trata de cuantificar SNP en ADNmt; Sin embargo, estos métodos siguen siendo prohibitivamente caros para la cuantificación rutinaria de la heteroplasmia mitocondrial, particularmente si el número de muestras es pequeño. La secuenciación de Sanger también puede permitir la detección de SNP; Sin embargo, este enfoque no es cuantitativo y a menudo no detecta niveles bajos de heteroplasmia o puede ser inexacto al estimar heteroplasmias altas. La pirosecuenciación, como un ensayo que implica una preparación mínima y permite la cuantificación rápida de la heteroplasmia para cualquier muestra de ADNmt, se propone como un compromiso adecuado entre estos dos extremos. Este método ha sido utilizado rutinariamente para cuantificar SNPs mitocondriales por numerosos investigadores en diversos contextos, incluyendo análisis forenses 14,15, diagnóstico clínico16, o el genotipado de ADNmt a partir de células individuales17.
Este ensayo implica un primer paso de preamplificación por PCR de una región que flanquea el SNP en el ADNmt, que es seguido por un ensayo de secuenciación por síntesis utilizando una hebra del amplicón generado previamente. Uno de los dos cebadores utilizados en la etapa de preamplificación debe ser biotinilado en el extremo 5', lo que permitirá que el aparato de pirosecuenciación aísle la cadena única de ADN que se utilizará como plantilla para la reacción de secuenciación. Luego se recocece un tercer cebador de secuenciación en la hebra biotinilada retenida, lo que permite la síntesis de ADN naciente como desoxinucleótidos que se dispensan en un orden predefinido en la cámara de reacción. El pirosecuenciador registra la cantidad de cada base incorporada en base a una lectura luminiscente, permitiendo la cuantificación relativa de alelos mitocondriales mutantes y de tipo salvaje sobre la síntesis de ADN (Figura 1B). La luminiscencia es generada por una enzima luciferasa, que emite luz en presencia de ATP que una ATP sulfurilasa sintetiza de novo en cada evento de incorporación a partir de los pirofosfatos liberados por cada nucleótido. Estas dos reacciones se pueden resumir de la siguiente manera:
1. PPi (de incorporación de nucleótidos) + APS → ATP + sulfato (ATP sulfurilasa)
2. ATP + luciferina +O2 → AMP + PPi + oxiluciferina + CO2 + luz (luciferasa)
La detección de bases de adenina por el pirosecuenciador sin reacción cruzada de ATP con la luciferasa en la segunda reacción es un desafío. Sin embargo, esto se resuelve mediante el uso de un análogo de adenina para la síntesis de ADN, a saber, dATPαS. A pesar de no ser un sustrato perfecto para la luciferasa, produce una luminiscencia más fuerte en comparación con los otros tres nucleótidos, que se ajusta digitalmente mediante el pirosecuenciador y se establece en un factor de 0,9. Debido a esta variabilidad inherente, se sugiere evitar la secuenciación de adenina en la posición SNP (ver la discusión para más detalles).
El siguiente protocolo detalla el método de evaluación de heteroplasmia de ADNmt mediante pirosecuenciación y describe las precauciones necesarias en el diseño de los cebadores de amplificación para evitar sesgos biológicos o técnicos al genotipar SNP en ADNmt. Este último implica inspeccionar digitalmente y seleccionar los conjuntos de cebadores, optimizar la PCR de preamplificación y, finalmente, secuenciar y refinar el ensayo. Se demuestran dos ensayos de ejemplo aplicados: primero, la optimización de la variante patógena humana más común m.3243A>G18, y segundo, el genotipado de células de fibroblastos embrionarios (MEF) de ratón que han sufrido un cambio de heteroplasmia utilizando tecnologías desarrolladas en el laboratorio Minczuk en Cambridge 10,11,12,19,20,21,22.
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Protocol
Se proporcionó consentimiento informado para el uso de las células cíbridas humanas 3243A>G y las MEF m.5024C>T inmortalizadas utilizadas en este estudio. La aprobación ética no fue requerida en este caso ya que las células del paciente no se recolectaron en la Universidad de Cambridge. Sin embargo, el uso de fibroblastos humanos puede requerir aprobación ética. Se recomienda encarecidamente seguir las mejores prácticas para la configuración de PCR al preparar la muestra de ADN para la pirosecuenciación. La amplificación frecuente con cebadores idénticos puede conducir a la contaminación del amplicón e introducir sesgos en el genotipado posterior si no se observa una separación estricta entre las áreas pre-PCR y post-PCR. La tubería presentada aquí utiliza equipos específicos de un único fabricante; los detalles se pueden encontrar en la Tabla de materiales. El diseño del cebador para la PCR se puede realizar manualmente si así se desea; sin embargo, se recomienda utilizar el software existente para este propósito (consulte la Tabla de materiales).
1. Diseño del cebador de pirosecuenciación y selección de ensayos
- Obtención de candidatos de cartilla con software
- Obtener un archivo de secuencia de ADNmt para la especie que se está genotipando e identificar la posición del SNP. Asegúrese de que la secuencia de referencia utilizada emplea la numeración de base adecuada para la mutación estudiada, de modo que la posición del SNP pueda identificarse fácilmente.
- Copie 1.000 pares de bases aguas arriba y aguas abajo del sitio SNP, y pegue la secuencia truncada en el software destinado al diseño del cebador de pirosecuenciación (consulte la Tabla de materiales).
- Establezca la base SNP analizada como el objetivo del ensayo de pirosecuenciación en el software resaltando la base polimórfica y haciendo clic derecho y luego seleccionando establecer región objetivo.
- Presione el ícono de reproducción en la esquina superior derecha de la interfaz para iniciar la selección de imprimación.
- Espere a que el software genere automáticamente tríos de cebadores: dos cebadores para la preamplificación del ADN de la plantilla y un tercer cebador para la secuenciación por síntesis en la máquina de pirosecuenciación. Conserve todos los juegos de imprimaciones haciendo clic con el botón derecho y seleccionando copiar todos los juegos de imprimación.
- Selección de los juegos de imprimación óptimos de la lista generada
- Conserve los juegos de imprimación con la puntuación de calidad más alta basada en la salida del software, que proporciona conjuntos de imprimación en orden descendente en función de la puntuación de calidad. Si es posible, omita los juegos de imprimación con una puntuación inferior a 80.
- Para los juegos de cebadores retenidos, identifique y copie el amplicón producido por los cebadores de amplificación.
- Alinee los amplicones producidos con el genoma completo del organismo que se va a genotipar utilizando NCBI Blast utilizando el portal de envío en línea en https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. En los menús desplegables durante el envío, seleccione lo siguiente:
- Seleccionar base de datos | Genómica + Bases de datos de transcripción.
- Seleccione Humano o Ratón en el menú desplegable, dependiendo del SNP analizado.
- Seleccione Optimizar para | Secuencias algo similares (Blastn).
- (Opcional) Si genotipa un organismo que no sea un ratón o un ser humano, seleccione lo siguiente durante el envío:
- Seleccionar base de datos | Base de datos estándar.
- Seleccione RefSeq Genomas representativos en el menú desplegable
- Seleccione Optimizar para | Secuencias algo similares (Blastn)
- Cuando sea posible, omita cualquier amplicón que tenga homología perfecta con el amplicón de ADNmt, particularmente si las regiones de unión del cebador son perfectamente homólogas (ver la discusión).
NOTA: La herramienta de alineación BLAST devolverá cualquier secuencia con una homología considerable a los amplicones de preamplificación. Esto permite la detección de los NUMT descritos en la introducción, que si no se tienen en cuenta, pueden inducir un sesgo ya que se coamplifican con el ADN mitocondrial. - Ordene los oligos obtenidos a través de esta tubería. Asegúrese de que la modificación de biotina 5' se agrega al cebador de amplificación correcto durante el orden de síntesis, de modo que el cebador de secuenciación sea complementario a la hebra biotinilada.
NOTA: La elección del cebador de secuenciación es más flexible que los cebadores de amplificación, y se recomienda tener al menos una base que separe el extremo 3' del cebador de secuenciación y la posición variable.
2. Optimización de la PCR de preamplificación
- Preparar las muestras de ADN extrayendo el ADN genómico total utilizando un método apropiado.
NOTA: Esto dependerá en gran medida del número de células que se genotipen y su origen. Si se aísla ADN de células individuales utilizando un tampón de lisis que contiene proteinasa K, la muestra debe desnaturalizarse a 95 °C durante 10 minutos para no interrumpir la polimerasa durante la PCR posterior. - Configuración de PCR y configuración del bloque térmico
- Configure la PCR con una polimerasa de alta fidelidad de su elección. Prepara un Master Mix para cuatro reacciones. Como solo se requieren 10 μL de reacción de PCR para una ejecución de pirosecuenciación, prepare 25 μL de reacciones de PCR (para permitir una repetición técnica si es necesario). Utilice 40 ciclos de PCR con aproximadamente 10 ng de ADN genómico como material de partida con 1 μM de cebadores directos e inversos.
- Establezca el tiempo de extensión de acuerdo con las especificaciones del fabricante para la polimerasa utilizada, teniendo en cuenta la longitud de los cebadores de preamplificación elegidos.
- Utilice un termociclador con ajustes variables de temperatura de recocido. Como la temperatura de recocido puede diferir dependiendo de la secuencia del cebador, el contenido de sal del tampón de la polimerasa y otros factores, programan cuatro temperaturas de recocido diferentes en el programa de ciclo térmico.
NOTA: El ejemplo trabajado en los resultados representativos utilizó las siguientes temperaturas: 55 °C, 60 °C, 65 °C y 70 °C. - Divida la mezcla maestra en cuatro tubos de PCR de 200 μL y configúrelos para que funcionen a cada una de las cuatro temperaturas de recocido seleccionadas en el termociclador durante 40 ciclos.
- Visualización de banda de preamplificación
- Durante la ejecución de PCR, prepare un gel de agarosa al 2% (p/v) en 1x TBE con SYBR Safe o bromuro de etidio como agente visualizador.
NOTA: Se recomienda un gel de mayor porcentaje para la visualización, ya que los fragmentos amplificados suelen ser cortos, por lo general oscilan entre 100 y 500 pares de bases. - Una vez completada la PCR en el paso 2.2, mezcle 10 μL de la reacción con una cantidad adecuada de tampón de carga de ADN y ejecute el gel de agarosa al 2% a 7 V/cm durante aproximadamente 45 min.
- Visualice los fragmentos de ADN resultantes en un transiluminador UV.
NOTA: Las condiciones de ciclo térmico seleccionadas para el paso de preamplificación deben producir una sola banda limpia del tamaño esperado. Las temperaturas de recocido más bajas ocasionalmente pueden resultar en una amplificación fuera del objetivo, lo que puede introducir sesgos en la pirosecuenciación posterior. - Seleccione la temperatura de recocido más baja que produzca una banda limpia del tamaño correcto para amplificaciones posteriores.
- (Opcional) Extirpar una banda del tamaño esperado, purificar utilizando un kit de extracción en gel de su elección, y analizar mediante secuenciación de Sanger para confirmar la heteroplasmia aproximada de la muestra como referencia.
- Durante la ejecución de PCR, prepare un gel de agarosa al 2% (p/v) en 1x TBE con SYBR Safe o bromuro de etidio como agente visualizador.
3. Configuración y funcionamiento del instrumento
NOTA: Una vez optimizado el paso de PCR en la sección anterior, el siguiente paso consiste en programar el pirosecuenciador con la secuencia de nucleótidos correcta para analizar el SNP específico. Esto implica ingresar 10 bases directamente aguas abajo del extremo 3' del cebador de secuenciación. Esto se detalla en la siguiente sección.
- Configuración del ensayo
- Abra el software de ejecución proporcionado con el pirosecuenciador y seleccione Nuevo ensayo en la esquina superior izquierda de la interfaz.
- Seleccione la plantilla de ensayo de cuantificación de alelos .
- Ingrese la secuencia a analizar en el cuadro correspondiente escribiendo los nucleótidos que se incorporarán directamente aguas abajo del cebador de secuenciación, que debe estar aguas arriba del SNP de interés. Para la posición variable, denote las dos bases posibles separadas por una barra diagonal (por ejemplo, A/T).
- Presione Generar orden de dispensación y deje que el software determine automáticamente un orden adecuado para que los nucleótidos se dispensen en la reacción de secuenciación por síntesis.
- Guarde y proporcione un nombre para el ensayo.
- Preparación y almacenamiento de reactivos
- Diluir el cebador de secuenciación ordenado a 4 μM en el tampón de recocido proporcionado en el kit de reactivo pirosecuenciador.
NOTA: El cebador de secuenciación puede diluirse primero en agua a 100 μM como solución madre y posteriormente diluirse en tampón de recocido a 4 μM según sea necesario. - Preparación y manipulación de enzimas y sustratos
- Cuando desempaquete por primera vez, vuelva a disolver la enzima liofilizada y el sustrato según las recomendaciones del fabricante. Conservar a -20 °C cuando no esté en uso.
- Tras su uso posterior, descongelar los viales de enzima y sustrato a partir de -20 °C.
NOTA: Todos los demás reactivos del kit suministrado pueden mantenerse refrigerados a 4 °C. Los cebadores de secuenciación diluidos también se pueden mantener a 4 °C.
- Coloque la cantidad requerida de cada reactivo en hielo.
- Mantenga los componentes restantes necesarios, a saber, las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, las tiras absorbentes y los discos de pirosecuenciación, a 4 °C.
- Diluir el cebador de secuenciación ordenado a 4 μM en el tampón de recocido proporcionado en el kit de reactivo pirosecuenciador.
- Ejecutar ejecución
NOTA: Cuando se diseña un ensayo por primera vez, debe calibrarse utilizando productos de PCR de heteroplasmia conocida, lo que garantiza que el ensayo pueda distinguir con precisión las heteroplasmias. Los investigadores pueden utilizar mezclas de productos de PCR de heteroplasmia conocida como estándares. Las muestras también pueden verificarse mediante otros métodos mencionados en la introducción y la discusión, en particular NGS.- Diluir el ADN a analizar a 5 ng/μL. Particularmente en la primera ejecución, asegúrese de incluir muestras de heteroplasmia conocida como referencia y / o muestras de tipo salvaje.
- Realizar una PCR de presecuenciación de 5 μL de ADN diluido en reacciones de 25 μL utilizando los cebadores de amplificación y los parámetros identificados en la sección 1 y la sección 2. Realizar réplicas técnicas de PCR para cada muestra.
NOTA: La PCR de preamplificación puede almacenarse a corto plazo a 4 °C o a largo plazo a -20 °C antes de proceder a la secuenciación. - Ejecutar la configuración de archivos
- Seleccione Nueva ejecución en la esquina superior izquierda del software del pirosecuenciador.
- El pirosecuenciador puede secuenciar simultáneamente 48 reacciones preamplificadas separadas, con un cuadrado vacío que representa un solo pozo de secuenciación en un disco de pirosecuenciación. Cargue los ensayos configurados en la sección 3.1 haciendo clic con el botón derecho en un cuadrado y seleccionando cargar ensayo. Si es necesario, secuencie hasta cuatro ensayos separados con diferentes cebadores de secuenciación.
- Establezca el modo de dispensación de cebador en Automático para asignar automáticamente una cámara de inyección para cada cebador de secuenciación utilizado para la ejecución.
- Establezca el modo de ejecución en Estándar a menos que se ejecuten cuatro tipos diferentes de ensayos en un disco de secuenciación.
- Asegúrese de que el número de ensayos en el archivo de plantilla de ejecución coincida con el número de reacciones de PCR que se amplifican.
NOTA: Si se ejecutan más de 48 ejemplos, será necesario configurar archivos de ejecución adicionales. - Guarde los archivos de ejecución en una unidad USB.
- Cebado del pirosecuenciador
- Pulse el botón Limpieza en la pantalla táctil principal del dispositivo, y limpie todos los inyectores con agua de alta pureza siguiendo las instrucciones de la pantalla. Al insertar la tira absorbente en la máquina, asegúrese de que los extremos se encuentren en la posición "9 en punto" (directamente a la izquierda del centro).
- Conecte la memoria USB con las ejecuciones configuradas en el paso 3.3.3 y cargue los archivos de ejecución definidos en el paso 3.3.3.
NOTA: Los archivos de ejecución deben guardarse fuera de cualquier directorio o carpeta en el USB o no pueden ser leídos por la máquina. - Siga las instrucciones del dispositivo para cargar y cebar los reactivos según sea necesario en los inyectores correspondientes de la máquina.
- Preparación del disco de muestra e inicio del ensayo
- Permita que las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina se equilibren a temperatura ambiente.
NOTA: Estas perlas permitirán que el dispositivo capture la hebra biotinilada desde el paso de PCR de preamplificación. Deben comprarse por separado del kit. - Cargue 3 μL de perlas en los pocillos definidos en el archivo de ejecución del paso 3.3.3.
- Cargue 10 μL de cada reacción de PCR a secuenciar en la muestra correspondiente, y pipete hacia arriba y hacia abajo para mezclar la muestra con las perlas magnéticas. Evite las burbujas si es posible.
- Busque la indicación en el pirosecuenciador cebado de que el disco se puede cargar en la máquina. Desenrosque la tuerca de sujeción de la placa antes de alinear la placa de muestra cargada con el pasador metálico en el compartimento del disco.
- Una vez que la placa esté firmemente atornillada en el compartimento de la placa, inicie la ejecución de secuenciación presionando el botón de inicio en la interfaz de la pantalla táctil.
- Permita que las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina se equilibren a temperatura ambiente.
4. Adquisición de resultados
- Una vez completada la ejecución, retire la unidad USB de la máquina y vuelva a conectarla a la computadora que ejecuta el software del pirosecuenciador. Mientras continúa con los siguientes pasos, proceda con la limpieza del pirosecuenciador siguiendo las indicaciones si es la última ejecución del día.
- Espere a que aparezca el archivo de ejecución recién generado en la unidad USB y haga doble clic en el archivo de resultados de ejecución. Esto analiza automáticamente la salida de luciferasa de cada pocillo tras la incorporación de nucleótidos y cuantifica el alelo mitocondrial de interés definido durante la configuración del ensayo en la sección 3.1.
- Busque las siguientes puntuaciones de color mostradas por el software en función de la calidad de las lecturas. El azul indica una ejecución óptima, el amarillo una carrera con una advertencia y el rojo una ejecución fallida. Para guardar los resultados, seleccione Informes en la ventana superior | Informe completo para generar un archivo de .pdf que contiene los pirogramas y los resultados de cada pozo de la carrera. Como alternativa, descargue los resultados en otros formatos en la pestaña Informes .
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Representative Results
Esta sección presenta un ejemplo de optimización de un ensayo de pirosecuenciación para una mutación patógena humana de ADNmt, así como datos de secuenciación del genotipado de fibroblastos embrionarios (MEF) de ratón heteroplásmicos (m.5024C>T) tratados con nucleasas mitocondriales de dedos de zinc (mtZFN). La optimización del ensayo para células humanas y la comparación de dos ensayos diferentes demuestra cómo seleccionar el más preciso, mientras que el genotipado de células MEF modificadas genéticamente en el segundo ejemplo sirve como un ejemplo aplicado de detección de cambios de heteroplasmia después de la intervención de terapia génica.
Mutación humana m.3243A>G
Este ejemplo ilustra el genotipado de una variante patogénica común de mtDNA-m.3243A>G. La mutación común m.3243A>G subyace a varias enfermedades clínicas, en particular la encefalopatía mitocondrial, la acidosis láctica y los episodios similares al accidente cerebrovascular (MELAS), la sordera hereditaria materna y la diabetes (MIDD) y la oftalmoplejía externa progresiva (PEO)23. Este ensayo también se puede utilizar para genotipar la variante24 menos común m.3243A>T mediante la reprogramación de la secuencia de nucleótidos que se incorporarán, como se describe en la sección 3.1.3 del protocolo.
Siguiendo las directrices de optimización de cebadores de la sección 1, se seleccionaron los siguientes conjuntos de cebadores, uno para cada hebra:
Ensayo 1:
Adelante: 5' - [Biotina] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Reverso: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
Secuenciación: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'
Tamaño del amplicón: 215 bp
Ensayo 2:
Delantero: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
Reverso: 5' - [Biotina] GTTGGCCATGGGTATGTTGTT- 3'
Secuenciación: 5' -GGGTTTGTTAAGATGG- 3'
Tamaño del amplicón: 182 bp
Para determinar las condiciones de ciclo térmico para el ensayo, primero se realizó una PCR de gradiente térmico utilizando una polimerasa de arranque en caliente (consulte la Tabla de materiales) y se analizó mediante electroforesis, siguiendo la sección 2. Se utilizaron cuarenta ciclos para amplificar aproximadamente 10 ng de ADN como plantilla inicial. Siguiendo los pasos de la sección 2.3 del protocolo, se realizó una electroforesis en gel de agarosa para verificar la especificidad del protocolo de amplificación a una temperatura de recocido dada (Figura 2A). Se pudieron observar bandas exitosas de los tamaños correctos (ya sea 215 pb o 182 pb) a todas las temperaturas; Sin embargo, las temperaturas de recocido más bajas en el ensayo 1 dieron lugar a una amplificación fuera del objetivo. Se estableció que la temperatura de recocido adecuada para la preamplificación era de 70 °C (Figura 2A). Para determinar la precisión de ambos ensayos y elegir el mejor, se generaron patrones molares del porcentaje conocido de m.3243A>G mezclando volúmenes apropiados de producto de PCR puro en varias proporciones: 0%, 10%, 25%, 50%, 75%, 90% y 100% de m.3243A>G, respectivamente (Figura 2B, línea punteada). Al realizar ambos ensayos sobre los estándares, observamos una mayor correlación con el resultado esperado en el Ensayo 2 (Figura 2B). Luego utilizamos ambos ensayos en células cíbridas m.3243A>G en un experimento de genotipado y observamos un sesgo pronunciado en el ensayo 1, particularmente cerca de condiciones homoplásmicas (Figura 2C).
Mutación murina m.5024C>T
Este ejemplo involucra células MEF tratadas con mtZFN desarrolladas para disminuir el nivel de la mutación m.5024C>T12 como ejemplo de un experimento de terapia génica mitocondrial donde el genotipado por pirosecuenciación es útil como comparación cuantitativa entre muestras. Las células MEF se derivan de un modelo de ratón publicado que alberga una mutación C>T en la posición 5.024 en el ADNmt del ratón (m.5024C>T)25. El experimento consistió en electroporar los MEF con plásmidos que codifican mtZFN y diferentes reporteros fluorescentes y posteriormente clasificar las células que expresan los plásmidos por FACS después de 24 h. Luego se permitió que las células se recuperaran durante 2 semanas antes de la comparación de heteroplasmia mediante pirosecuenciación.
El conjunto de cebadores utilizado para secuenciar la posición m.5024C>T fue el siguiente:
Delantero: 5' - ATACTAGTCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
Reverso: 5' - [Biotina] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
Secuenciación: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'
Tamaño del amplicón: 267 bp
Las muestras se secuenciaron por triplicado técnico para aumentar la fidelidad de los resultados. El experimento también se realizó en duplicado biológico, produciendo así seis valores separados para cada una de las condiciones (Figura 3B). Los datos de 2 de los 18 pirogramos se utilizaron para construir la Figura 3B; estos pirogramas se muestran en la Figura 3A.
Figura 1: Esquemas que representan secuencias mitocondriales en una célula y el esquema técnico general de la pirosecuenciación . (A) Representación esquemática del ADN mitocondrial y secuencias mitocondriales nucleares. La figura representa el origen evolutivo de las secuencias de alta homología. (B) Representación esquemática de la tubería del ensayo de pirosecuenciación con una secuencia de ejemplo final que representa un valor aproximado de heteroplasmia C>G del 50%. El ADN de la plantilla se amplifica primero mediante cebadores de amplificación seleccionados, uno de los cuales está biotinilado en el extremo 5'. Después de la amplificación, el pirosecuenciador retiene una sola hebra de ADN como plantilla para la secuenciación utilizando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, que se muestran en azul. Por último, un cebador de secuenciación permite la secuenciación por síntesis de una serie predefinida de nucleótidos, generando un pirograma que se representa esquemáticamente. Las estequiometrías de cada base se obtienen fácilmente comparando las alturas relativas de los picos en cada evento de incorporación: el mismo nucleótido dos veces seguidas generará un pico doble en comparación con una sola base. La barra diagonal en la secuencia a analizar denota el SNP hipotético, que podría ser "C" o "G". Tenga en cuenta la dispensación inicial de una base "G" simulada en el eje x del pirograma, que generalmente realiza el pirosecuenciador como un control negativo. Abreviaturas: ADNmt = ADN mitocondrial; NUMTs = secuencias mitocondriales nucleares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Optimización del conjunto de cebadores de pirosecuenciación como se ilustra en la mutación humana m.3242A>G. (A) Electroforesis en gel de agarosa (2% p/v) de una amplificación por PCR utilizando los cebadores de amplificación de ambos conjuntos seleccionados para la mutación m.3242A>G. WT denota ADN de control de tipo salvaje, mientras que Het es la muestra m.3243A>G casi homoplásmica que se analizará. Las temperaturas son la temperatura de recocido utilizada en una reacción de PCR de 40 ciclos. (B). Una comparación del rendimiento de ambos juegos de cebadores utilizando estándares molares para la calibración, que se obtuvieron mezclando varias proporciones de producto m3243A>G puro de tipo salvaje y mutante puro. Los valores medidos se denotan mediante las líneas punteadas verticales. Se muestra una función lineal X = Y para ilustrar qué tan cerca está cada uno de los dos ensayos probados de una medición ideal. Los nombres de las líneas celulares en el eje x son los nombres de los diversos clones cíbridos que fueron genotipados usando este ensayo. (C) Resultados de genotipado en cuatro clones cíbridos de heteroplasmia m.3243A>G desconocida utilizando ambos ensayos. La secuenciación se realizó por triplicado técnico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Medición de heteroplasmia en MEF m.5024C>T clasificados por FACS tratados con tecnología de edición de genes mtZFN. (A) Pirogramas de dos réplicas de PCR de muestras de células MEF utilizadas para generar la Figura 3B, así como el control de genotipado de tipo salvaje. Los valores de luminiscencia en el eje Y están en A.U. (B) Resultados de genotipado de células tratadas con mtZFN junto con controles no tratados y tratados simuladamente. Los MEFs fueron electroporados con plásmidos que codifican mtZFNs y diferentes reporteros fluorescentes y posteriormente clasificados por FACS después de 24 h. Luego se permitió que las células se recuperaran durante 2 semanas antes de la comparación de heteroplasmia mediante pirosecuenciación. Las barras de error se calcularon con duplicados biológicos, cada uno de los cuales se sometió a pirosecuenciación por triplicado técnico. Abreviaturas: FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; MEFs = fibroblastos embrionarios de ratón; mtZFN = nucleasa mitocondrial de los dedos de zinc; U.A. = unidades arbitrarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un aspecto crítico para el éxito del protocolo es evitar contaminaciones, particularmente cuando se utilizan bajas cantidades de material de partida. Se recomienda utilizar una campana UV y puntas de pipeta filtradas al preparar las muestras siempre que sea posible, así como mantener separadas las áreas de preamplificación y postamplificación. Siempre deben incluirse mediciones en blanco y muestras de heteroplasmia conocida (como ADN de tipo salvaje) para ser utilizadas como puntos de referencia para verificar el sesgo técnico o biológico.
Un sesgo técnico notable inherente al ensayo es el aumento de la señal luminiscente producida por la incorporación analógica de adenina. Cuando la adenina se usa en una posición variable, a menudo produce un pico fluorescente residual (por ejemplo, Figura 2C). Es por esta razón que se recomienda ejecutar ensayos de pirosecuenciación en la hebra opuesta (donde se incorporará una timina), cuando sea posible para evitar tener que incorporar el análogo de adenina en la posición variable. Sin embargo, en el caso de mutaciones A>T o T>A, esto es imposible. Sin embargo, como se evidencia en los resultados representativos, una elección adecuada de cebadores puede ser de mayor importancia al diseñar un ensayo. Ensayo 2 para la mutación m.3243A>G, en la primera sección de los resultados representativos, secuencias basadas en la relación A/G en la posición variable en contraste con el ensayo 1, que mide la relación T/C. A pesar de ser susceptible al sesgo de incorporación de adenina, el ensayo 2 ofrece resultados más precisos basados en la comparación con los patrones molares, como lo muestra un análisis de regresión lineal simple (Figura 2B).
Los sesgos son principalmente el resultado de la coamplificación de NUMT3. El gran número de copias mitocondriales generalmente evita que las secuencias nucleares fuera del objetivo introduzcan un sesgo significativo; sin embargo, ciertas regiones de ADNmt están presentes en muchos NUMTS y deben evitarse utilizando los métodos indicados en el protocolo en la sección 1.
Al tomar las precauciones antes mencionadas, este método es un medio altamente modular, rápido y rentable para genotipar SNP en ADNmt. Sin embargo, el método no es adecuado para todas las aplicaciones de genotipado mitocondrial, en particular, deleciones a gran escala para las cuales se recomienda la PCR digital de gotitas26. La variabilidad en la dispensación de reactivos por el secuenciador o diferentes cebadores/condiciones de amplificación puede conducir a la introducción de pequeños sesgos. Es por esta razón que generalmente se recomiendan triplicados técnicos para confirmar la veracidad de los resultados del genotipado. Otra limitación del enfoque es el alcance, ya que solo se pueden genotipar tramos cortos y predefinidos de ADNmt. Si bien los pirosecuenciadores se pueden programar para secuenciar cientos de pares de bases de secuencia desconocida, esto rápidamente se vuelve menos rentable que usar un enfoque NGS. Los investigadores podrían implementar inicialmente la pirosecuenciación como un método de genotipado rápido que produce una respuesta cuantitativa precisa, pero posteriormente podrían analizar las muestras elegidas por NGS para una mayor precisión y contexto.
En conclusión, este método bien establecido sigue siendo un elemento básico en la investigación genética mitocondrial, proporcionando un acceso rápido y simple a las mediciones cuantitativas de heteroplasmia que son clave en muchos contextos de investigación en el campo, como el diagnóstico de pacientes, la terapia génica o el genotipado de modelos animales.
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Disclosures
M.M. es cofundador, accionista y miembro del Consejo Asesor Científico de Pretzel Therapeutics, Inc. P.S.-P. y P.A.N. proporcionan servicios de consultoría para Pretzel Therapeutics, Inc.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Silvia Marchet y Constanza Lamperti (Istituto Neurologico "Carlo Besta", Fondazione IRCCS, Milán) por preparar y proporcionar las células cíbridas m.3243A>G utilizadas como ejemplos ilustrativos para este protocolo. También nos gustaría agradecer a los miembros del Grupo de Genética Mitocondrial (MRC-MBU, Universidad de Cambridge) por su útil discusión durante el curso de esta investigación. Este trabajo fue apoyado por fondos básicos del Consejo de Investigación Médica del Reino Unido (MC_UU_00015/4 y MC_UU_00028/3). P.A.N. y P.S.-P. cuentan además con el apoyo de The Lily Foundation y The Champ Foundation, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G.
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M.
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
