Summary
パイロシーケンシングアッセイは、ヘテロプラズマ細胞または組織におけるミトコンドリアDNA一塩基多型の堅牢かつ迅速なジェノタイピングを可能にします。
Abstract
ミトコンドリアゲノム(mtDNA)の変異は、母性遺伝性の遺伝病と関連しています。しかし、近年、mtDNA変異誘発によるモデル作製能力が発達し、ミトコンドリアの遺伝子異常とがん、糖尿病、認知症などの一般的な加齢性疾患との関連が新たに認識されたため、mtDNA多型への関心が高まっています。パイロシーケンシングは、日常的なジェノタイピング実験のためにミトコンドリア分野全体で広く採用されている合成によるシーケンシング技術です。大規模な並列シーケンシング法と比較した場合の比較的手頃な価格と実装の容易さにより、ミトコンドリア遺伝学の分野で非常に貴重な技術となり、柔軟性を高めたヘテロプラスミーの迅速な定量が可能になります。この方法の実用性にもかかわらず、mtDNAジェノタイピングの手段としてのその実施は、特に生物学的または技術的起源の特定のバイアスを回避するために、特定のガイドラインの観察を必要とする。このプロトコルは、ヘテロプラスミー測定のコンテキストで使用するためのパイロシークエンシングアッセイを設計および実装する際に必要な手順と注意事項を概説します。
Introduction
ミトコンドリアゲノムは、マトリックスと呼ばれるミトコンドリアの最も内側のコンパートメントに存在する小さな(16.5kb)環状分子(mtDNA)の形で存在し、ミトコンドリア呼吸鎖の13のサブユニット、およびミトコンドリアリボソーム1によるその場での翻訳に必要なtRNAおよびrRNAをコードします。このゲノムは、ミトコンドリアの機能に必要なすべてのタンパク質の約1%を占め、残りは核DNA(nDNA)によってコードされています。ミトコンドリアは、アルファプロテオバクテリアの祖先と祖先の真核細胞との間の内部共生融合イベントに由来すると一般に考えられています。この仮説的な共生が起こると、ミトコンドリアの遺伝情報は長い年月をかけて徐々に核に移され、現代のシアノバクテリアのゲノムと比較した場合のmtDNAの前述のコンパクトさを説明しています2。このような遺伝子の伝達は、mtDNAに見られる配列と非常に相同なnDNAの長いストレッチの存在によって最も強く証明されます。これらの核ミトコンドリア配列(NMT)は、ジェノタイピング中の誤解の一般的な原因であり、mtDNA3をジェノタイピングする際に核バイアスを回避するために特定の予防措置を講じる必要があります(図1A)。
mtDNAのもう一つの特徴は、そのコピー数が細胞の種類によって異なり、細胞あたり数万コピーから数千のコピー数であることです4。このマルチコピーの性質により、mtDNAは単一細胞内に幅広い遺伝子型を保持することができ、染色体の接合性を考慮すると、核遺伝子に関連する個別の対立遺伝子とは対照的に、対立遺伝子のより連続的な分布をもたらす可能性があります。ミトコンドリア対立遺伝子のこの不均一性はミトコンドリアヘテロプラスミーと呼ばれ、通常、特定の細胞内の全mtDNAの割合としての特定の突然変異の有病率で表されます。ヘテロプラスミーは、細胞全体に存在するmtDNAのユニークな種を指すホモプラスミーとは対照的です。
ミトコンドリアヘテロプラスミーの測定は、病原性多様体を有するmtDNA分子の割合を定量する際に特に興味深い。このような変異体は、一塩基多型(SNP)、小さなインデル、または大規模な欠失の形で提供されます5。ほとんどの人間は病原性多様体に対して異質です。しかし、それらは臨床表現型を示さず、閾値効果6と呼ばれる現象において病原性mtDNAのより高いヘテロプラスミーレベルでのみ現れることがよくあります。病原性に関連する値は、病原性突然変異の性質とそれが発生する組織に大きく依存しますが、通常、60%を超えるヘテロプラスミー7にあります。
ミトコンドリアのジェノタイピングが一般的であるいくつかの研究分野があります。医療分野では、mtDNA変異の検査や定量化は、mtDNA異常を起源とするミトコンドリア病の診断基準となります5。ヒト病原性変異の研究に加えて、ミトコンドリアを標的とするDddA由来シトシン塩基エディター(DdCBE)8およびアデニン塩基編集のためのTALEベースのデアミナーゼ(TARED)9によって可能になったミトコンドリア塩基編集の最近の出現を考えると、mtDNAに病原性SNPを保持する動物モデルの有病率は増加する可能性があります.このアプローチは、異常なミトコンドリア遺伝子型と結果として生じる機能障害との間の相互作用を理解するのに役立ちます。ヘテロプラスミーシフトとして知られるアプローチを介して、ヒトミトコンドリア疾患の治療戦略として最終的に使用するためにミトコンドリアゲノムをリモデリングすることに関する科学的研究も進行中です。この研究分野は、主に突然変異特異的ヌクレアーゼをミトコンドリアマトリックスに向けることを含みます。これは病原性mtDNAの優先的な分解をもたらし、表現型10、11、12、13における救済をもたらす。ミトコンドリア遺伝子型のリモデリングを含む実験には、ヘテロプラスミーシフトを評価するための堅牢な定量的方法が必要です。
mtDNAの遺伝子形成にはさまざまな方法が使用されており、これらは突然変異の性質によって異なります。次世代シーケンシング(NGS)法は、mtDNA中のSNPの定量に関してはより正確です。しかしながら、これらの方法は、特にサンプル数が少ない場合、ミトコンドリアヘテロプラスミーの日常的な定量には法外に高価である。サンガーシーケンシングは、SNPの検出も可能にします。ただし、このアプローチは定量的ではなく、低レベルのヘテロプラスミーを検出できないか、高ヘテロプラスミーを推定するときに不正確になる可能性があります。パイロシーケンシングは、最小限の調製で、あらゆるmtDNAサンプルのヘテロプラスミーの迅速な定量を可能にするアッセイとして、これら2つの両極端の間の適切な妥協点として提案されています。この方法は、法医学的分析14,15、臨床診断16、または単一細胞からのmtDNAのジェノタイピング17など、さまざまな状況で多くの研究者によってミトコンドリアSNPを定量するために日常的に使用されてきました。
このアッセイでは、mtDNA中のSNPに隣接する領域の最初のPCR前増幅ステップが含まれ、その後、以前に生成されたアンプリコンの1本鎖を使用した合成によるシーケンシングアッセイが続きます。前増幅ステップで使用される2つのプライマーのうちの1つは、5'末端でビオチン化されている必要があり、これにより、パイロシーケンシング装置は、シーケンシング反応のテンプレートとして使用するDNAの一本鎖を単離することができます。次に、3番目のシーケンシングプライマーが保持されたビオチン化鎖上にアニーリングされ、デオキシヌクレオチドとしての新生DNA合成を事前定義された順序で反応チャンバーに分注することができます。パイロシーケンサーは、発光読み出しに基づいて組み込まれた各塩基の量を記録し、DNA合成時に変異型および野生型のミトコンドリア対立遺伝子の相対定量を可能にします(図1B)。発光はルシフェラーゼ酵素によって生成され、ATPの存在下で発光し、ATPスルフリラーゼは各ヌクレオチドによって放出されたピロリン酸から各取り込みイベントで de novo を合成します。これら2つの反応は次のように要約できます。
1. PPi (ヌクレオチドの取り込みから)+ APS → ATP +硫酸塩(ATPスルフリラーゼ)
2. ATP +ルシフェリン+ O 2 →AMP + PPi +オキシルシフェリン+ CO2 +光(ルシフェラーゼ)
2番目の反応でATPがルシフェラーゼと交差反応することなく、パイロシーケンサーによってアデニン塩基を検出することは課題です。しかしながら、これはDNA合成のためのアデニン類似体、すなわちdATPαSを使用することによって解決される。ルシフェラーゼの完全な基質ではありませんが、パイロシーケンサーによってデジタル調整され、0.9の係数に設定される他の3つのヌクレオチドと比較して、より強い発光を生成します。この固有の変動性のために、SNP位置でのアデニンの配列決定を避けることが示唆されている(詳細については議論を参照)。
以下のプロトコルは、パイロシーケンシングによるmtDNAヘテロプラスミー評価の方法を詳述し、mtDNA中のSNPをジェノタイピングする際の生物学的または技術的バイアスを回避するために増幅プライマーを設計する際に必要な予防措置を概説します。後者では、プライマーセットのデジタル調査と選択、前増幅PCRの最適化、そして最後にアッセイのシーケンシングと精製が行われます。2つの応用例のアッセイが実証されています:第一に、最も一般的なヒト病原性多様体m.3243A>G18の最適化、第二に、ケンブリッジのMinczuk研究所で開発された技術を使用してヘテロプラスミーシフトを受けたマウス胚性線維芽細胞(MEF)細胞のジェノタイピング10,11,12,19,20,21,22。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この研究で使用されたヒト3243A>Gサイブリッド細胞および不死化m.5024C>T MEFの使用について、インフォームドコンセントが提供されました。この場合、患者の細胞はケンブリッジ大学で収集されなかったため、倫理的承認は必要ありませんでした。しかしながら、ヒト線維芽細胞の使用は倫理的承認を必要とするかもしれない。パイロシーケンシング用のサンプルDNAを調製する際には、PCRセットアップのベストプラクティスに従うことを強くお勧めします。同一のプライマーを使用した頻繁な増幅は、アンプリコン汚染につながり、PCR前領域とPCR後領域の厳密な分離が観察されない場合、その後のジェノタイピングにバイアスをもたらす可能性があります。ここで紹介するパイプラインは、唯一のメーカーの特定の機器を使用しています。詳細は 材料表に記載されています。PCRのプライマー設計は、必要に応じて手動で行うことができます。ただし、この目的のために既存のソフトウェアを使用することをお勧めします( 材料表を参照)。
1. パイロシーケンシングプライマーの設計とアッセイの選択
- ソフトウェアによる入門候補の取得
- 遺伝子型決定される種のmtDNA配列ファイルを取得し、SNPの位置を特定します。使用する参照配列が、SNPの位置を容易に識別できるように、研究された変異に適切な塩基番号付けを採用していることを確認してください。
- SNPサイトの上流および下流に1,000塩基対をコピーし、切捨てた配列をパイロシーケンシングプライマー設計用のソフトウェアに貼り付けます( 材料表を参照)。
- 分析されたSNP塩基をパイロシークエンシングアッセイのターゲットとして設定するには、多型塩基を強調表示し、ターゲット 領域を右クリックして選択します。
- インターフェイスの右上隅にある 再生 アイコンを押して、プライマー選択を開始します。
- ソフトウェアがプライマートリオを自動的に生成するのを待ちます:テンプレートDNAの予備増幅用の2つのプライマーと、パイロシーケンシングマシンでの合成によるシーケンシング用の3番目のプライマー。すべてのプライマーセットを保持するには、プライマーセットを右クリックして[ すべてのプライマーセットをコピー]を選択します。
- 生成されたリストから最適なプライマーセットを選択する
- ソフトウェア出力に基づいて最高の品質スコアを持つプライマーセットを保持し、品質スコアに基づいて降順でプライマーセットを提供します。可能であれば、スコアが80未満のプライマーセットを省略します。
- 保持されたプライマーセットについて、増幅プライマーによって 産生されたアンプリコン を同定し、コピーします。
- https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi のオンライン提出ポータルを使用して、NCBI Blastを使用して遺伝子型決定する生物の全ゲノムで生成されたアンプリコンを整列させます。提出中のドロップダウンメニューから、以下を選択します。
- データベースの選択 |ゲノム+転写産物データベース。
- 分析されたSNPに応じて、ドロップダウンメニューで[ 人間 ]または [マウス] を選択します。
- [ 最適化対象] を選択します。 |やや似たようなシーケンス(ブラストン)。
- (オプション)マウスまたはヒト以外の生物をジェノタイピングする場合は、提出時に以下を選択してください。
- データベースの選択 |標準データベース。
- ドロップダウンメニューで RefSeq代表ゲノム を選択します
- [ 最適化対象] を選択します。 |やや類似したシーケンス(ブラストン)
- 可能であれば、特にプライマー結合領域が完全に相同である場合は、mtDNAアンプリコンと完全に相同性を持つアンプリコンを省略してください(議論を参照)。
注:BLASTアライメントツールは、増幅前のアンプにかなりの相同性を持つシーケンスを返します。これにより、序論に記載されているNUMTの検出が可能になり、説明されていない場合、ミトコンドリアDNAと共増幅されるため、バイアスを誘発する可能性があります。 - このパイプライン を介して 得られたオリゴを注文します。シーケンシングプライマーがビオチン化鎖と相補的になるように、合成順序中に5'ビオチン修飾が正しい増幅プライマーに添加されていることを確認してください。
注:シーケンシングプライマーの選択は増幅プライマーよりも柔軟であり、シーケンシングプライマーの3'末端と可変位置を隔てる少なくとも1つの塩基を有することが推奨されます。
2. プリアンプPCRの最適化
- 適切な方法を用いて全ゲノムDNAを抽出してDNAサンプルを調製する。
注:これは、遺伝子型決定される細胞の数とその起源に大きく依存します。プロテイナーゼKを含む溶解バッファーを使用して単一細胞からDNAを単離する場合、その後のPCR中にポリメラーゼを破壊しないように、サンプルを95°Cで10分間変性させる必要があります。 - PCRセットアップとサーマルブロック設定
- 選択した高忠実度ポリメラーゼを使用してPCRをセットアップします。4つの反応のためのマスターミックスを準備します。パイロシーケンシングの実行に必要なPCR反応はわずか10 μLであるため、25 μLのPCR反応を準備します(必要に応じて技術的な繰り返しを可能にするため)。約 10 ng のゲノム DNA を出発物質として、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方を 1 μM ずつ使用した 40 サイクルの PCR を使用します。
- 選択したプリアンプライフィケーションプライマーの長さを考慮して、使用するポリメラーゼのメーカーの仕様に従って延長時間を設定します。
- アニーリング温度設定が可変のサーマルサイクラーを使用してください。アニーリング温度はプライマー配列、ポリメラーゼバッファーの塩含有量、およびその他の要因によって異なる可能性があるため、4つの異なるアニーリング温度を熱サイクルプログラムにプログラムします。
注:代表的な結果の作業例では、55°C、60°C、65°C、および70°Cの温度を使用しました。 - マスターミックスを4本の200 μL PCRチューブに分割し、サーマルサイクラーで選択した4つのアニーリング温度のそれぞれで40サイクル稼働するように設定します。
- プリアンプバンドの可視化
- PCRの実行中に、視覚化剤としてSYBR Safeまたは臭化エチジウムを含む1x TBE中の2%(w/v)アガロースゲルを調製します。
注:増幅されたフラグメントは通常短く、通常は100〜500塩基対の範囲であるため、視覚化にはより高い割合のゲルが推奨されます。 - ステップ2.2のPCRが完了したら、10 μLの反応液を適量のDNAローディングバッファーと混合し、2%アガロースゲル上で7 V/cmで約45分間分析します。
- 得られたDNA断片をUVトランスイルミネーターで視覚化します。
注:プリアンプステップ用に選択したサーマルサイクル条件は、予想されるサイズの単一のクリーンバンドを生成する必要があります。アニーリング温度が低いと、オフターゲット増幅が発生することがあり、その後のパイロシークエンシングにバイアスが生じる可能性があります。 - その後の増幅に適したサイズのクリーンなバンドを生成する最低アニーリング温度を選択します。
- (オプション)予想されるサイズのバンドを切り出し、選択したゲル抽出キットを使用して精製し、サンガーシーケンシングで分析して、サンプルのおおよそのヘテロプラスミーを基準として確認します。
- PCRの実行中に、視覚化剤としてSYBR Safeまたは臭化エチジウムを含む1x TBE中の2%(w/v)アガロースゲルを調製します。
3. 機器のセットアップと実行
注:前のセクションのPCRステップが最適化されたら、次のステップでは、特定のSNPを分析するための正しいヌクレオチド配列を使用してパイロシーケンサーをプログラミングします。これには、シーケンシングプライマーの3'末端のすぐ下流に10塩基を入力することが含まれます。これについては、次のセクションで詳しく説明します。
- アッセイ構成
- パイロシーケンサーに付属のランソフトウェアを開き、インターフェースの左上隅にある 新規アッセイ を選択します。
- 対立遺伝子定量アッセイテンプレートを選択します。
- 目的のSNPの上流にあるはずのシーケンシングプライマーの直接下流に組み込まれるヌクレオチドを入力して、 分析する配列 を対応するボックスに入力します。可変位置については、スラッシュで区切られた2つの可能な基数を示します(例:A / T)。
- 分注 次数の生成を押すと、合成によるシーケンシング反応で分注するヌクレオチドの適切な順序がソフトウェアによって自動的に決定されます。
- アッセイの名前を保存して指定します。
- 試薬の調製と保管
- 4 μMに配列したシーケンシングプライマーを、パイロシーケンサー試薬キットに付属のアニーリングバッファーで希釈します。
注:シーケンシングプライマーは、まずストック溶液として水中で100 μMに希釈し、その後、必要に応じてアニーリングバッファーでさらに4 μMに希釈することができます。 - 酵素および基質の調製と取り扱い
- 最初に箱を開けるときは、メーカーの推奨に従って凍結乾燥酵素と基質を再溶解してください。使用しないときは-20°Cで保管してください。
- その後の使用時に、酵素および基質バイアルを-20°Cから解凍します。
注:付属のキットに含まれる他のすべての試薬は、4°Cで冷蔵保存できます。 希釈シーケンシングプライマーは、4°Cに保つこともできます。
- 必要量の各試薬を氷の上に置きます。
- 必要な残りのコンポーネント、すなわちストレプトアビジンコーティングされた磁気ビーズ、吸収ストリップ、およびパイロシークエンシングディスクを4°Cに保ちます。
- 4 μMに配列したシーケンシングプライマーを、パイロシーケンサー試薬キットに付属のアニーリングバッファーで希釈します。
- 実行の実行
注:アッセイを最初に設計するときは、既知のヘテロプラスミーのPCR産物を使用してキャリブレーションする必要があり、これによりアッセイがヘテロプラスミーを正確に区別できるようになります。研究者は、既知のヘテロプラスミーのPCR産物の混合物を標準として使用できます。サンプルは、序論と議論で言及された他の方法、特にNGSによっても検証できます。- 分析するDNAを5 ng/μLに希釈します。 特に最初の実行では、既知のヘテロプラスミーのサンプルをリファレンスおよび/または野生型サンプルとして必ず含めてください。
- セクション1およびセクション2で特定した増幅プライマーとパラメーターを使用して、25 μLの反応で5 μLの希釈DNAのプレシーケンシングPCRを実行します。各サンプルに対してテクニカルPCR複製を実行します。
注:前増幅PCRは、シーケンシングに進む前に、4°Cで短期保存するか、-20°Cで長期間保存できます。 - ファイルのセットアップを実行する
- パイロシーケンサー ソフトウェアの左上隅にある [ 新しい実行 ] を選択します。
- パイロシーケンサーは、48の別々のプリアンプ反応を同時にシーケンスすることができ、空の正方形はパイロシーケンシングディスク上の単一のシーケンシングウェルを表します。セクション3.1で設定したアッセイをロードするには、四角形を右クリックして ロードアッセイを選択します。必要に応じて、異なるシーケンシングプライマーで最大4つのアッセイをシーケンシングできます。
- プライマーディスペンセーションモードを 自動 に設定すると、ランに使用するシーケンシングプライマーごとにインジェクションチャンバーが自動的に割り当てられます。
- 1つのシーケンシングディスクで4つの異なるタイプのアッセイを実行しない限り、 ランモード を スタンダード に設定します。
- ランテンプレートファイルのアッセイ数が、増幅されるPCR反応の数と一致していることを確認します。
注: 48 を超えるサンプルを実行する場合は、追加の実行ファイルを設定する必要があります。 - 実行ファイルを USB ドライブに保存します。
- パイロシーケンサーのプライミング
- デバイスのメインタッチスクリーンにあるクリーニングボタンを押し、画面の指示に従ってすべてのインジェクターを高純度水で クリーニング します。アブソーバーストリップを機械に挿入するときは、両端が「9時」の位置(中央のすぐ左)で出会うことを確認してください。
- 手順 3.3.3 で設定した実行を使用して USB スティックを接続し、手順 3.3.3 で定義した実行ファイルをロードします。
注意: 実行ファイルは、USB上のディレクトリまたはフォルダの外部に保存する必要があり、保存しないとマシンで読み取ることができません。 - デバイスの指示に従って、必要に応じて試薬をマシンの対応するインジェクターにロードしてプライミングします。
- サンプルディスク調製とアッセイの立ち上げ
- ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを室温まで平衡化させます。
注:これらのビーズにより、デバイスは前増幅PCRステップからビオチン化鎖を捕捉できます。キットとは別に購入する必要があります。 - ステップ3.3.3のランファイルで定義されたウェルに3 μLのビーズをロードします。
- シーケンスする各PCR反応を10 μL対応するサンプルにロードし、上下にピペットでサンプルを磁気ビーズと混合します。可能であれば気泡を避けてください。
- プライミングされたパイロシーケンサーで、ディスクをマシンにロードできることを示す表示を探します。ロードされたサンプルプレートをディスクコンパートメントの金属ピンに合わせる前に、プレート保持ナットを緩めます。
- プレートがプレートコンパートメントにしっかりとねじ込まれたら、タッチスクリーンインターフェイスの スタート ボタンを押してシーケンスランを開始します。
- ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを室温まで平衡化させます。
4. 成果取得
- 実行が完了したら、マシンからUSBドライブを取り外し、パイロシーケンサーソフトウェアを実行しているコンピューターに接続し直します。次の手順を続行しながら、その日の最後の実行である場合は、プロンプトに従ってパイロシーケンサーのクリーニングに進みます。
- 新しく生成された実行ファイルがUSBドライブに表示されるのを待ち、実行結果ファイルをダブルクリックします。これにより、ヌクレオチドの取り込み時に各ウェルのルシフェラーゼ出力が自動的に分析され、セクション3.1のアッセイ構成中に定義された目的のミトコンドリア対立遺伝子が定量化されます。
- 読み取りの品質に基づいてソフトウェアによって表示される次のカラースコアを探します。青は最適な実行を示し、黄色は警告のある実行を示し、赤は失敗した実行を示します。結果を保存するには、上部のウィンドウで [ レポート ] | 実行の各ウェルからのパイログラムと結果を含む.pdfファイルを生成するための完全なレポート。または、[ レポート ] タブで他の形式で結果をダウンロードします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
このセクションでは、ヒト病原性mtDNA変異に対するパイロシーケンシングアッセイの最適化例と、ミトコンドリアジンクフィンガーヌクレアーゼ(mtZFN)で処理したヘテロプラズマ(m.5024C>T)マウス胚性線維芽細胞(MEF)のジェノタイピングデータを紹介します。ヒト細胞のアッセイを最適化し、2つの異なるアッセイを比較すると、最も正確なアッセイを選択する方法が示されますが、2番目の例の遺伝子組み換えMEF細胞のジェノタイピングは、遺伝子治療介入後のヘテロプラスミーシフトを検出する応用例として機能します。
ヒト m.3243A>G 変異
この例は、mtDNA-m.3243A>Gの一般的な病原性多様体のジェノタイピングを示しています。一般的なm.3243A>G変異は、いくつかの臨床疾患、特にミトコンドリア脳症の乳酸アシドーシスおよび脳卒中様エピソード(MELAS)、母体遺伝性の難聴および糖尿病(MIDD)、および進行性外眼筋麻痺(PEO)の根底にあります23。このアッセイは、プロトコルのセクション3.1.3に記載されているように、組み込まれるヌクレオチドの配列を再プログラムすることによって、あまり一般的ではないm.3243A>Tバリアント24 を遺伝子型決定するためにも使用できます。
セクション1のプライマー最適化ガイドラインに従い、以下のプライマーセットをいずれかの鎖に1つずつ選択しました。
アッセイ1:
フォワード: 5' - [ビオチン] AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
リバース: 5' - TGCGATTAGAATGGGTACAATGAG - 3'
シーケンシング: 5' - GTTTTATGCGATTACC- 3'
アンプリコンサイズ: 215 bp
アッセイ2:
フォワード: 5' - AAATAAGGCCTACTTCACAAAGCG - 3'
リバース: 5' - [ビオチン] GTTGGCCATGGGTATGTGTT- 3'
シーケンシング: 5' -GGGTTTTTTAAGATGG- 3'
アンプリコンサイズ: 182 bp
アッセイの熱サイクル条件を決定するために、ホットスタートポリメラーゼ( 材料表を参照)を使用した熱勾配PCRを最初に実行し、セクション2に続く電気泳動によって分析しました。開始テンプレートとして約10 ngのDNAを増幅するために40サイクルを使用しました。プロトコルのセクション2.3の手順に従って、アガロースゲル電気泳動を実行して、所定のアニーリング温度での増幅プロトコルの特異性を検証しました(図2A)。正しいサイズ(215 bpまたは182 bp)の正常なバンドは、すべての温度で観察できます。しかし、アッセイ1のアニーリング温度が低いと、オフターゲット増幅が起こりました。プリアンプの適切なアニーリング温度は70°Cに確立されました(図2A)。両方のアッセイの精度を確認し、最良のアッセイを選択するために、適切な量の純粋なPCR産物をさまざまな比率(それぞれ0%、10%、25%、50%、75%、90%、および100%)で混合することにより、既知のm.3243A>Gパーセンテージのモル標準を生成しました:m.3243A>G(点線)。標準に対して両方のアッセイを実行した場合、アッセイ2で期待される結果とより大きな相関が観察されました(図2B)。次に、ジェノタイピング実験でm.3243A>Gサイブリッド細胞で両方のアッセイを使用し、アッセイ1、特にホモプラズム条件に近い顕著なバイアスを観察しました(図2C)。
マウスm.5024C>T変異
この例は、ミトコンドリア遺伝子治療実験の例として、m.5024C>T変異12 のレベルを低下させるように開発されたmtZFNで処理されたMEF細胞を含み、パイロシークエンシングによるジェノタイピングはサンプル間の定量的比較として有用です。MEF細胞は、マウスmtDNA(m.5024C>T)25の5,024位にC>T変異を有する公表されたマウスモデルに由来します。実験では、mtZFNをコードするプラスミドと異なる蛍光レポーターでMEFをエレクトロポレーションし、その後、24時間後にFACSによってプラスミドを発現する細胞を選別しました。次いで、細胞をパイロシークエンシングによるヘテロプラスミー比較の前に2週間回復させた。
m.5024C>T位置のシーケンシングに用いたプライマーセットは以下の通りである:
フォワード: 5' - アタクタグトCCGCGAGCCTTCAAAG - 3'
リバース: 5' - [ビオチン] GCAAATTCGAAGGTGTAGAGAAA - 3'
シーケンシング: 5' - CAAGTTTAACTTCTGATAAGG - 3'
アンプリコンサイズ: 267 bp
サンプルは、結果の忠実度を高めるために技術的な三重で配列決定されました。実験も生物学的重複で行われたため、各条件に対して6つの別々の値が生成されました(図3B)。18個のパイログラムのうち2個のデータを使用して、 図3Bを作成しました。これらのパイログラムを 図3Aに示します。
図1:細胞内のミトコンドリア配列を表す概略図とパイロシークエンシングの一般的な技術概要。 (A)ミトコンドリアDNAおよび核ミトコンドリア配列の模式図。この図は、高い相同性配列の進化的起源を表しています。(B)約50%のC>Gヘテロプラスミー値を描写する最終サンプル配列を含むパイロシークエンシングアッセイパイプラインの概略図。鋳型DNAは、選択された増幅プライマーによって最初に増幅され、そのうちの1つは5'末端でビオチン化されます。増幅後、パイロシーケンサーは、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを使用したシーケンシングのテンプレートとしてDNAの一本鎖を保持します(青色で表示)。最後に、シーケンシングプライマーは、事前定義された一連のヌクレオチドの合成によるシーケンシングを可能にし、概略的に表されるパイログラムを生成する。各塩基の化学量論は、各組み込みイベントでの相対的なピーク高さを比較することによって容易に得られます:同じヌクレオチドを2回連続してすると、単一の塩基と比較して二重のピークが生成されます。分析されるシーケンス内のスラッシュは、仮想的なSNPを示し、「C」または「G」である可能性があります。パイログラムのx軸上の模擬「G」ベースの最初の分配に注意してください。これは通常、ネガティブコントロールとしてパイロシーケンサーによって実行されます。略語:mtDNA =ミトコンドリアDNA;NUMTs =核ミトコンドリア配列。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ヒトm.3242A>G変異に例示されるパイロシークエンシングプライマーセットの最適化。 (A)m.3242A>G変異に対して選択された両方のセットの増幅プライマーを用いたPCR増幅のアガロースゲル電気泳動(2%w/v)。WTは野生型のコントロールDNAを示し、Hetは分析されるほぼ同種のm.3243A>Gサンプルです。温度は、40サイクルPCR反応で使用したアニーリング温度です。純粋な野生型と純粋な変異型m3243A>G生成物の様々な比率を混合することによって得られた、較正のためのモル標準を用いた両方のプライマーセットの性能の比較。測定値は縦の点線で示しています。X = Y線形関数が表示され、テストされた2つのアッセイのそれぞれが理想的な測定値にどれだけ近いかを示します。x軸上の細胞株の名前は、このアッセイを用いて遺伝子型決定された様々なサイブリッドクローンの名前である。(C)両方のアッセイを使用した未知のm.3243A>Gヘテロプラスミーの4つのサイブリッドクローンのジェノタイピング結果。配列決定は、技術的なトリプリケートで行った。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:mtZFN遺伝子編集技術で処理したFACSソートm.5024C>T MEFのヘテロプラスミー測定 。 (A) 図3B および野生型ジェノタイピングコントロールの生成に使用した2つのMEF細胞サンプルPCR複製からのパイログラム。Y軸の発光値はA.U.(B)mtZFN処理細胞と未処理および模擬処理コントロールのジェノタイピング結果です。MEFをmtZFNおよび異なる蛍光レポーターをコードするプラスミドでエレクトロポレーションし、続いて24時間後にFACSで分類した。次いで、細胞をパイロシークエンシングによるヘテロプラスミー比較の前に2週間回復させた。エラーバーは生物学的重複で計算され、それぞれが技術的な三重でパイロシークエンシングを受けました。略語:FACS =蛍光活性化細胞ソーティング;MEFs =マウス胚性線維芽細胞;mtZFN =ミトコンドリア亜鉛フィンガーヌクレアーゼ;A.U. = 任意の単位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
プロトコルの成功のための重要な側面は、特に少量の出発物質を使用する場合に、汚染を回避することです。サンプルを調製する際には、可能な限りUVフードとフィルター付きピペットチップを使用し、プリアンプとポストアンプの領域を分離することをお勧めします。ブランク測定値および既知のヘテロプラスミー(野生型DNAなど)のサンプルは、技術的または生物学的バイアスをチェックするためのベンチマークとして使用するために常に含める必要があります。
アッセイに固有の注目すべき技術的バイアスは、アデニンアナログの取り込みによって生成される発光シグナルの増加です。アデニンを可変位置で使用すると、残留蛍光ピークが生じることが多い(例えば、 図2C)。このため、可変位置にアデニン類似体を組み込む必要がないように、可能であれば、反対側の鎖(チミンが組み込まれる場所)でパイロシークエンシングアッセイを実行することが推奨されます。しかし、A>TやT>Aの変異の場合、これは不可能です。それにもかかわらず、代表的な結果で証明されているように、プライマーの適切な選択は、アッセイを設計する際により重要になり得る。m.3243A>G変異のアッセイ2は、代表的な結果の最初のセクションで、T/C比を測定するアッセイ1とは対照的に、可変位置のA/G比に基づく配列である。アッセイ2は、アデニン取り込みバイアスの影響を受けやすいにもかかわらず、単純な線形回帰分析によって示されるように、モル標準との比較に基づいてより正確な結果を提供します(図2B)。
バイアスは主にNUMT共増幅の結果です3。ミトコンドリアのコピー数が多いため、通常、核オフターゲット配列が有意なバイアスを導入するのを防ぎます。ただし、mtDNAの特定の領域は多くのNUMTSに存在するため、セクション1のプロトコルに示されている方法を使用して避ける必要があります。
前述の予防措置を講じる場合、この方法は、mtDNA中のSNPをジェノタイピングするための高度にモジュール化された、迅速で費用効果の高い手段です。ただし、この方法は、すべてのミトコンドリアジェノタイピングアプリケーション、特にデジタルドロップレットPCRが推奨される大規模な欠失に適しているわけではありません26。シーケンサーによる試薬の分注のばらつきや、プライマー/増幅条件の違いにより、小さなバイアスが生じる可能性があります。このため、ジェノタイピング結果の信憑性を確認するために、通常、技術的なトリプリケートが推奨されます。このアプローチの別の制限は、mtDNAの短い事前定義されたスパンのみを遺伝子型決定できるため、範囲です。パイロシーケンサーは、未知の配列の数百の塩基対をシーケンスするようにプログラムできますが、これはNGSアプローチを使用するよりもすぐに費用対効果が低くなります。研究者は当初、正確な定量的回答をもたらす迅速なジェノタイピング方法としてパイロシークエンシングを実装することができましたが、その後、NGSによって選択されたサンプルを分析して、さらなる精度とコンテキストを得ることができます。
結論として、この確立された方法は、ミトコンドリア遺伝子研究の定番であり続け、患者の診断、遺伝子治療、動物モデルのジェノタイピングなど、この分野の多くの研究コンテキストで重要な定量的ヘテロプラスミー測定への迅速かつ簡単なアクセスを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.M.は、Pretzel Therapeutics, Inc. P.S.-P.の共同創設者、株主、および科学諮問委員会のメンバーです。P.A.N.はプレッツェル・セラピューティクス社にコンサルティングサービスを提供しています。
Acknowledgments
このプロトコルの実例として使用されるm.3243A>Gサイブリッド細胞を調製および提供してくれたSilvia MarchetとConstanza Lamperti(Istituto Neurologico "Carlo Besta"、Fondazione IRCCS、ミラノ)に感謝します。また、ミトコンドリア遺伝学グループ(MRC-MBU、ケンブリッジ大学)のメンバーに、この研究の過程で有益な議論をしていただき、感謝したいと思います。この研究は、英国医学研究評議会(MC_UU_00015/4およびMC_UU_00028/3)からのコア資金によってサポートされました。P.A.N. および P.S.-P.さらに、それぞれリリー財団とチャンプ財団によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD Hot Start DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | 71086 | |
| PyroMark Assay Design 2.0 | QIAGEN | ||
| Pyromark Q48 Absorber Strips | QIAGEN | 974912 | |
| PyroMark Q48 Advanced CpG Reagents (4 x 48) | QIAGEN | 974022 | |
| Pyromark Q48 Autoprep | QIAGEN | 9002470 | |
| PyroMark Q48 Cartridge Set | QIAGEN | 9024321 | |
| Pyromark Q48 Disks | QIAGEN | 974901 | |
| Pyromark Q48 Magnetic beads | QIAGEN | 974203 | |
| PyroMark Q48 Software License (1) | QIAGEN | 9024325 |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: Structure, transcription, translation and replication. Biochimica et Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491, 374-383 (2012).
- Wei, W., et al. Nuclear-embedded mitochondrial DNA sequences in 66,083 human genomes. Nature. 611, 105-114 (2022).
- Chinnery, P. F., Hudson, G.
- Ryzhkova, A. I., et al. Mitochondrial diseases caused by mtDNA mutations: A mini-review. Therapeutics and Clinical Risk Management. 14, 1933-1942 (2018).
- Payne, B. A. I., et al. Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Human Molecular Genetics. 22 (2), 384-390 (2013).
- Craven, L., Alston, C. L., Taylor, R. W., Turnbull, D. M.
- Mok, B. Y., et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature. 583, 631-637 (2020).
- Cho, S. -I., et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell. 185 (10), 1764-1776 (2022).
- Gammage, P. A., Rorbach, J., Vincent, A. I., Rebar, E. J., Minczuk, M. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Molecular Medicine. 6 (4), 458-466 (2014).
- Gammage, P. A., et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs. Nucleic Acids Research. 44 (16), 7804-7816 (2016).
- Gammage, P. A., et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nature Medicine. 24, 1691-1695 (2018).
- Bacman, S. R., et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nature Medicine. 24 (11), 1696-1700 (2018).
- Ren, Z., et al. Screening of mtDNA SNPs in Chinese Han population using pyrosequencing. Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 4 (1), 316-317 (2013).
- Andréasson, H., Asp, A., Alderborn, A., Gyllensten, U., Allen, M. Mitochondrial sequence analysis for forensic identification using pyrosequencing technology. BioTechniques. 32 (1), 124-133 (2002).
- Yan, J., et al. Pyrosequencing is an accurate and reliable method for the analysis of heteroplasmy of the A3243G mutation in patients with mitochondrial diabetes. Journal of Molecular Diagnostics. 16 (4), 431-439 (2014).
- Song, Q., et al. Improvement of LATE-PCR to allow single-cell analysis by pyrosequencing. Analyst. 138 (17), 4991-4997 (2013).
- El-Hattab, A. W., Adesina, A. M., Jones, J., Scaglia, F. MELAS syndrome: Clinical manifestations, pathogenesis, and treatment options. Molecular Genetics and Metabolism. 116 (1-2), 4-12 (2015).
- Minczuk, M., Papworth, M. A., Miller, J. C., Murphy, M. P., Klug, A. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), 3926-3938 (2008).
- Minczuk, M., Kolasinska-Zwierz, P., Murphy, M. P., Papworth, M. A. Construction and testing of engineered zinc-finger proteins for sequence-specific modification of mtDNA. Nature Protocols. 5, 342-356 (2010).
- Bacman, S. R., Gammage, P. A., Minczuk, M., Moraes, C. T. Manipulation of mitochondrial genes and mtDNA heteroplasmy. Methods in Cell Biology. 155, 441-487 (2020).
- Gammage, P. A., Minczuk, M. Enhanced manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy in vitro using tunable mtZFN technology. Methods in Molecular Biology. 1867, 43-56 (2018).
- Pickett, S. J., et al. Phenotypic heterogeneity in m.3243A>G mitochondrial disease: The role of nuclear factors. Annals of Clinical and Translational Neurology. 5 (3), 333-345 (2018).
- Nunes, J. B., et al. OXPHOS dysfunction regulates integrin-β1 modifications and enhances cell motility and migration. Human Molecular Genetics. 24 (7), 1977-1990 (2015).
- Kauppila, J. H. K., et al. A phenotype-driven approach to generate mouse models with pathogenic mtDNA mutations causing mitochondrial disease. Cell Reports. 16 (11), 2980-2990 (2016).
- Burr, S. P., Chinnery, P. F. Measuring single-cell mitochondrial DNA copy number and heteroplasmy using digital droplet polymerase chain reaction. Journal of Visualized Experiments. (185), e63870 (2022).
