A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Voor de observatie van muizennenatale galwegaandoeningen zijn een intact galkanaal en een efficiënte voorbereiding vereist. Daarom werd met succes een nieuwe aanpak ontwikkeld voor het isoleren van het gehele extrahepatische galkanaalsysteem bij muizenne neonaten met behoud van de integriteit van het galkanaal.

Abstract

De dissectie van murine neonatale galwegen is beschreven als moeilijk. Het belangrijkste doel van de beschreven standaard operatieprocedure is de isolatie van het extrahepatische galkanaal (EBD) bij muizennexanen zonder het galkanaal tijdens de bereiding te beschadigen. Vanwege de uitzonderlijk nauwe voorbereiding in vergelijking met de cellijn van cholangiocyten en het oogsten van het gehele extrahepatische galwegsysteem (EBDS), is de beschreven aanpak uiterst nuttig bij het onderzoeken van diermodellen van pasgeboren galwegaandoeningen, zoals galwegesie. Na euthanasie werd de peritoneale holte ontsloten en werden het galwegsysteem, de twaalfvingerige darm en de lever geëxtraheerd met de unieke En-bloc-Resectie (EbR). Het geëxtraheerde monster wordt op een schuimmat geplaatst en de EBD wordt atraumatisch ontleed van verontreinigende cellen zonder noodzakelijke aanraking. De dissectie van de gehele EBDS is een belangrijk voordeel van deze methode. Voorzichtigheid is geboden vanwege de kleine omvang en hoeveelheid galwegweefsel. Met behulp van de beschreven techniek is er geen schade aan de cholangiocyten. Verder is de zuiverheid van de techniek reproduceerbaar (n = 10). Hierdoor kunnen optimaal vergelijkbare monsters worden geoogst. Bovendien wordt geen galwegweefsel beschadigd, omdat elk contact met het galwegsysteem tijdens de voorbereiding kan worden vermeden, waardoor de galvloeistof in de galblaas achterblijft. Het belangrijkste is dat tijdens het uitvoeren van de uiteindelijke galblaas- en galwegdissectie, atraumatische micro-instrumenten slechts licht lateraal van het galkanaal werden gebruikt zonder erin te knijpen. Dit is de sleutel tot een schoon en intact monster en essentieel voor verder histologisch onderzoek of de isolatie van cholangiocyten. Samenvattend stelt de beschreven innovatieve dissectietechniek vooral onervaren operators met de nodige apparatuur in staat om de EBDS zo schoon mogelijk te isoleren.

Introduction

Het ontstaan en de progressie van cholangiopathieën zoals galatresie, primaire scleroserende cholangitis (PSC) en primaire gal cholangitis (PBC) zijn onbekend of onvolledig ^1,2. Het beperkte begrip van de oorsprong en progressie van die ziekten leidt tot een gebrek aan therapiemogelijkheden³. Het moeilijkste obstakel bij het bestuderen van neonatale galwegaandoeningen is het verkrijgen van een moleculair begrip van de pathofysiologie. Een van de essentiële sleutels tot een beter begrip van moleculaire pathologie is de best mogelijke observatie van aangetast weefsel. Om verminderde vergelijkbaarheid en discrepanties tussen onderzoek te voorkomen, zoals het observeren van potentiële virale etiologie van galatresie⁴, ontstaat de behoefte aan de best mogelijke voorbereiding en het delen van de uitgevoerde dissectietechnieken. Een zuivere voorbereiding van het doelweefsel is noodzakelijk voor latere microscopische onderzoeken of het kweken van cel- en 3D-organoïde culturen. Bij muizennenatale aandoeningen zijn weefselmonsters echter zeldzaam en komen ze slechts in een kleine hoeveelheid voor vanwege de zeer kleine omvang. Met betrekking tot galwegaandoeningen zijn problemen beschreven bij een schone voorbereiding van galwegen bij muizenne neonaten⁵. Vanwege het neonatale stadium van ontwikkeling is weefseldifferentiatie niet overdreven geavanceerd, wat de voorbereiding bemoeilijkt en de moeilijkheid verhoogt in vergelijking met de voorbereiding van volwassen monsters. Daarom onderzocht de operationele werkgroep een nieuwe strategie voor het bereiden van de EBDS in een neonatale muismodel. In deze studie maakt de techniek een efficiënte verdeling van elk monster mogelijk.

Het galwegsysteem wordt intraperitoneaal in de rechter bovenbuik geplaatst, voortkomend uit de lever. De galblaas bevindt zich onder het viscerale oppervlak van de rechterkwab van de lever. Het galkanaal is samen met de poortader en de leverslagader ingebed in het hepatoduodenale ligament. Het verbindt de lever en de twaalfvingerige darm rechtstreeks en voert galvloeistof af naar de twaalfvingerige darm⁶. Anatomisch is het galkanaal verdeeld in de rechter- en linkerhepatische kanalen, het gemeenschappelijke leverkanaal, het cystische kanaal en het Ductus choledochus, dat wordt gevormd door de samenvloeiing van het cystische kanaal en het gemeenschappelijke leverkanaal⁷. Deze leegt uiteindelijk galvocht en speeksel uit het pancreaskanaal in de twaalfvingerige darm via de Ampulla van Vater.

Cholangiocyten bekleden het galkanaal intra- en extrahepatisch en wonen in een gecompliceerde anatomische niche waar ze helpen bij galproductie en homeostase⁸. Galvloeistof passeert deze gespecialiseerde epitheelcellen dagelijks in hoge concentraties. Met name het onderhoud van de HCO3-paraplu is erg belangrijk voor de bescherming tegen galzuurtoxiciteit⁹. Cholangiocyten zijn de eerste verdedigingslinie in het hepatobiliaire systeem tegen bijvoorbeeld luminale micro-organismen¹⁰. De afweereffectiviteit van de cholangiocyten tegen toxische aanvallen kan worden verzwakt door genetische aanleg. Een toxische overbelasting veroorzaakt schade en vernietiging en kan daarom leiden tot cholangiopathieën. Bovendien is het zich ontwikkelende galkanaal niet volledig in staat tot alle zelfbeschermende mechanismen, wat leidt tot een hogere gevoeligheid voor milieutoxines in neonatale galwegen¹¹.

Protocol

Na ethische goedkeuring (N045/2021) werden mannelijke en vrouwelijke C57BL/6-muizen neonaten waargenomen tot 9 dagen oud. De dieren werden geboren en voor experimentele doeleinden verstrekt door de dierenfaciliteit van het Universitair Medisch Centrum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Duitsland. De pasgeborenen werden samen met hun ouderdieren in een kooi gehuisvest. De omgevingsomstandigheden werden gecontroleerd in temperatuur (20-24 °C), 12:12 uur licht-donkercyclus en relatieve vochtigheid van 40% -70%. <p class="jove…

Representative Results

Figuur 1A toont de EBDS van een muizenneaat, die met de beschreven techniek werd ontleed. Microscopisch is er geen verder leverweefsel zichtbaar. Het leverweefsel is verwijderd tijdens de laatste isolatiestappen van het protocol en kon gemakkelijk worden onderscheiden van galwegweefsel met betrekking tot kleur en consistentie. Figuur 1B toont het geïsoleerde monster in vergelijking met een millimeterschaal. De lengte van de EBD (gemeten van galblaas tot duodena…

Discussion

Dit artikel rapporteerde en besprak de creatie en validatie van een nieuwe chirurgische aanpak voor het verwijderen van de EBDS van geëuthanaseerde neonatale muizen. Microscopische en histologische bevindingen onthullen dat de aanpak snel EBD’s detecteert en ze ontleedt in de buurt van de marges van het kanaal, zelfs bij neonatale muizen. Alleen chirurgische instrumenten en een microscoop met een vergroting van 20x zijn vereist voor het beschreven protocol. Bovendien maakt de aanpak de isolatie van de gehele EBDS mogeli…

Materials

2-Propanol	CHEMSOLUTE	11365000	used as a dehydrating agent
30 G canula	B Braun/Sterican, Melsungen Germany	4656300	canula for hydration of the sample
Air vent	C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany	Tec-Ononmic AZ 1200	the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives
Aqua ad injectabilia Braun	B Braun, Melsungen, Germany	2351744	saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile
Bigger microsurgical Forceps	DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland	FD253R	straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum
Camera “SmartCAM 5”	Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom	EVC131A	optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation
Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor	Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany	12612613	used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h)
Dehydration sponge	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	TT56.1	sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of  two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes
Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL
Embedding cassettes	Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany	17990
Eosin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-6660-00	staining solution, ready to use
Fine Scissors CeramaCut	FST, Heidelberg Germany	14959-09	Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window
Graefe Forceps	FST, Heidelberg Germany	11051-10	Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel
Hematoxylin	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	41-5130-00	staining solution, ready to use
Highresolotion microscope	Vision Engineering, Send United Kingdom	EVO503	Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used
Microscope	Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany	BX60F5
Microscope Cover Glases	Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany	101244	60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass
Microscope Slides	R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany	03-0060
Microtome	Leica, Nußloch, Germany	SM2010R	Tool for sectioning (2 µm-slices)
Omnifix-F 1 mL syringe	B Braun, Melsungen, Germany	9161406V	syringe without canula
Paraffin	Sakura Finetec, Torrance, USA	4511	Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machine	MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany	TES 99	The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge
Paraformaldehyde (PFA)	Morphisto	1176201000	Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4
Small Microsurgical Forceps	EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany	(00)165	Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation
Stainless Steel Ruler	Agntho's AB, Lidingö, Sweden	30085-15	150mm With Metric & Inch Graduations
Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation	FST, Heidelberg Germany	14001-14	Device for decapitation
Warming cabinet	Haraeus, Hanau, Germany	T 6060	the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides