9日齢マウス新生児における肝外胆管および胆嚢郭清
Summary
マウス新生児胆管障害の観察には、無傷の胆管と効率的な準備が必要です。したがって、マウス新生児の肝外胆管系全体を分離するための新しいアプローチは、胆管の完全性を維持しながら首尾よく開発されました。
Abstract
マウス新生児胆管の解剖は難しいと言われている。記載された標準操作手順の主な目的は、調製中に胆管を損傷することなく、マウス新生児における肝外胆管(EBD)の単離である。胆管細胞細胞株と比較して非常に近い調製および肝外胆管系(EBDS)全体の採取のために、記載されたアプローチは、胆道閉鎖症などの新生児胆管障害の動物モデルの研究において非常に有用である。安楽死後、腹腔にアクセスし、胆管系、十二指腸、肝臓を独自のEn-bloc切除(EbR)で抽出しました。抽出したサンプルをフォームマットの上に置き、EBDを汚染細胞から非外傷的に解剖します。EBDS全体の解剖は、この方法の大きな利点です。胆管組織のサイズと量が小さいため、注意が必要です。記載された技術を使用しても、胆管細胞に損傷はない。また、当該技術の純度は再現性がある(n=10)。したがって、最適に比較可能なサンプルを採取することができます。さらに、胆管系との接触を調製中に回避し、胆嚢内に胆汁液を残すことができるため、胆管組織は損傷を受けません。最も重要なことは、最終的な胆嚢および胆管郭清を行う際に、非外傷性マイクロ器具を絞らずに胆管のわずかに外側にのみ使用したことです。これは、クリーンで無傷のサンプルの鍵であり、さらなる組織学的調査や胆管細胞の単離に不可欠です。要約すると、説明されている革新的な解剖技術により、特に経験の浅いオペレーターは、必要な機器を使用してEBDSを可能な限りきれいに分離できます。
Introduction
胆道閉鎖症、原発性硬化性胆管炎(PSC)、原発性胆汁性胆管炎(PBC)などの胆管障害の発生と進行は不明または不完全です1,2。これらの疾患の起源と進行についての理解が限られているため、治療の選択肢が不足しています3。新生児胆管疾患を研究する上で最も困難な障害は、病態生理学の分子的理解を得ることです。分子病理学をよりよく理解するための重要な鍵の1つは、患部組織の可能な限り最良の観察です。胆道閉鎖症4の潜在的なウイルス病因を観察するなど、研究間の比較可能性の低下や不一致を避けるために、実行された解剖技術の可能な限り最良の準備と共有の必要性が生じます。標的組織の純粋な調製は、後の顕微鏡調査や細胞および3Dオルガノイド培養の繁殖に必要です。しかし、マウス新生児障害では、組織サンプルはまれであり、サイズが非常に小さいため少量しか発生しません。胆管障害に関しては、マウス新生児における胆管のクリーンな調製の難しさが記載されている5。新生児の発達段階のために、組織分化は過度に進行しておらず、これは調製を複雑にし、成人サンプルの調製と比較して困難を増大させる。したがって、手術ワークグループは、新生児マウスモデルでEBDSを準備するための新しい戦略を調査しました。本研究では、この手法により、各サンプルの効率的な解剖が可能になります。
胆管系は、肝臓から生じる右上腹部に腹腔内に配置されます。胆嚢は、肝臓の右葉の内臓表面の下にあります。胆管は、門脈および肝動脈と共に、肝十二指腸靭帯に埋め込まれている。肝臓と十二指腸を直接結合し、十二指腸6に胆汁液を排出します。解剖学的には、胆管は左右の肝管、総肝管、嚢胞管、および嚢胞管と総肝管の合流点によって形成される総胆管7に分けられる。これは最終的に胆汁と唾液を膵管からベイターの膨大部 を介して 十二指腸に空にします。
胆管細胞は胆管を肝内および肝外に並べ、複雑な解剖学的ニッチに住み、胆汁産生と恒常性を助けます8。胆汁は、これらの特殊な上皮細胞を毎日高濃度で通過させます。特に、HCO3-傘の維持は、胆汁酸毒性から保護するために非常に重要です9。胆管細胞は、例えば管腔微生物10に対する肝胆道系における第一の防御線である。胆管細胞の毒性攻撃に対する防御効果は、遺伝的素因によって弱まる可能性があります。.有毒な過負荷は損傷と破壊を引き起こし、したがって胆管障害につながる可能性があります。さらに、発達中の胆管は、すべての自己防衛機構を完全に行うことができるわけではなく、新生児胆管11における環境毒素に対するより高い感受性をもたらす。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、安楽死させた新生児マウスのEBDSを除去するための新しい外科的アプローチの作成と検証について報告し、議論しました。顕微鏡的および組織学的所見により、このアプローチはEBDを迅速に検出し、新生児マウスであっても管の縁の近くでそれらを解剖することが明らかになりました。記載されたプロトコルには、手術器具と20倍の倍率の顕微鏡のみが必要です。さらに、この?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ヨハンナ・ハーゲンス、ポーリーネ・シュパート、クララ・フィリッピ、PD博士クリスチャン・トムシャット、スヴェンヤ・ワーンケ、PDダイアナ・リンドナー博士、ディルク・ウェスターマン教授、ミリアム・トムザック、ニコール・リューダー、ナディーン・クルザワ、ライア・パジェロールス・ラルイ博士、ビルギット・アプル、マグダレーナ・トロチミウクの貢献を認めています。ハンス・クリスチャン・シュミットは、ハンブルクのUKEにあるエルゼ・クローナー・フレゼニウス・シュティフトゥングiPRIME奨学金(2021_EKPK.10)によって財政的に支援されました。
Materials
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
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