Summary
Pour l’observation des troubles des voies biliaires néonatales murines, un canal biliaire intact et une préparation efficace sont nécessaires. Par conséquent, une nouvelle approche pour isoler l’ensemble du système des canaux biliaires extrahépatiques chez les nouveau-nés murins a été développée avec succès tout en maintenant l’intégrité des voies biliaires.
Abstract
La dissection des voies biliaires néonatales murines a été décrite comme difficile. L’objectif principal de la procédure opératoire standard décrite est l’isolement du canal biliaire extrahépatique (EBD) chez les nouveau-nés de souris sans endommager le canal biliaire pendant la préparation. En raison de sa préparation exceptionnellement étroite par rapport à la lignée cellulaire des cholangiocytes et de la récolte de l’ensemble du système des canaux biliaires extrahépatiques (EBDS), l’approche décrite est extrêmement utile dans la recherche de modèles animaux de troubles des voies biliaires chez le nouveau-né, tels que l’atrésie biliaire. Après l’euthanasie, la cavité péritonéale a été consultée et le système des voies biliaires, le duodénum et le foie ont été extraits avec la résection unique En-bloc (EbR). L’échantillon extrait est placé sur un tapis de mousse, et l’EBD est disséqué des cellules contaminantes de manière atraumatique sans contact nécessaire. La dissection de l’ensemble de l’EBDS est un avantage significatif de cette méthode. Des précautions doivent être prises en raison de la petite taille et de la petite quantité de tissu des canaux biliaires. En utilisant la technique décrite, il n’y a pas de dommages aux cholangiocytes. De plus, la pureté de la technique est reproductible (n = 10). Par conséquent, des échantillons comparables de manière optimale peuvent être récoltés. De plus, aucun tissu des canaux biliaires n’est endommagé, car tout contact avec le système des canaux biliaires peut être évité pendant la préparation, laissant le liquide biliaire à l’intérieur de la vésicule biliaire. Plus important encore, lors de la dissection finale de la vésicule biliaire et des voies biliaires, des microinstruments atraumatiques n’ont été utilisés que légèrement latéralement du canal biliaire sans le serrer. C’est la clé d’un échantillon propre et intact, et essentiel pour une investigation histologique plus approfondie ou l’isolement des cholangiocytes. En résumé, la technique de dissection innovante décrite permet aux opérateurs, en particulier inexpérimentés, disposant de l’équipement nécessaire, d’isoler le EBDS aussi proprement que possible.
Introduction
La genèse et la progression des cholangiopathies telles que l’atrésie biliaire, la cholangite sclérosante primitive (CSP) et la cholangite biliaire primitive (CBP) sont inconnues ou incomplètes 1,2. La compréhension limitée de l’origine et de la progression de ces maladies conduit à une pénurie d’options thérapeutiques3. L’obstacle le plus difficile dans l’étude des troubles des voies biliaires néonatales est d’acquérir une compréhension moléculaire de la physiopathologie. L’une des clés essentielles d’une meilleure compréhension de la pathologie moléculaire est la meilleure observation possible des tissus affectés. Pour éviter une comparabilité réduite et des divergences entre les recherches, telles que l’observation de l’étiologie virale potentielle de l’atrésiebiliaire 4, il est nécessaire de préparer et de partager au mieux les techniques de dissection effectuées. Une préparation pure du tissu cible est nécessaire pour des investigations microscopiques ultérieures ou des cultures organoïdes cellulaires et 3D de reproduction. Cependant, dans les troubles néonatals murins, les échantillons de tissus sont rares et ne se produisent qu’en petite quantité en raison de leur très petite taille. En ce qui concerne les troubles des voies biliaires, des difficultés dans une préparation propre des voies biliaires chez les nouveau-nés murins ont été décrites5. En raison du stade néonatal de développement, la différenciation tissulaire n’est pas trop avancée, ce qui complique la préparation et augmente la difficulté par rapport à la préparation d’échantillons adultes. Par conséquent, le groupe de travail opérationnel a étudié une nouvelle stratégie pour préparer l’EBDS dans un modèle murin néonatal. Dans la présente étude, la technique permet une dissection efficace de chaque échantillon.
Le système des canaux biliaires est placé par voie intrapéritonéale dans la partie supérieure droite de l’abdomen, provenant du foie. La vésicule biliaire est située sous la surface viscérale du lobe droit du foie. Le canal biliaire, ainsi que la veine porte et l’artère hépatique, sont intégrés dans le ligament hépatoduodénal. Il relie directement le foie et le duodénum et draine le liquide biliaire dans le duodénum6. Anatomiquement, le canal biliaire est divisé en canaux hépatiques droit et gauche, le canal hépatique commun, le canal kystique et le canal cholédoque, formé par la confluence du canal kystique et du canal hépatique commun7. Celui-ci finit par vider le liquide biliaire et la salive du canal pancréatique dans le duodénum via l’ampoule de Vater.
Les cholangiocytes tapissent les voies biliaires intra- et extra-hépatiques, vivant dans une niche anatomique compliquée où ils aident à la production de bile et à l’homéostasie8. Le liquide biliaire passe quotidiennement ces cellules épithéliales spécialisées à des concentrations élevées. En particulier, l’entretien du parapluie HCO3- est très important pour protéger contre la toxicité des acides biliaires9. Les cholangiocytes sont la première ligne de défense du système hépatobiliaire contre, par exemple, les micro-organismes luminaux10. L’efficacité de défense des cholangiocytes contre les agressions toxiques peut être affaiblie par une prédisposition génétique. Une surcharge toxique provoque des dommages et des destructions et peut donc entraîner des cholangiopathies. De plus, les voies biliaires en développement ne sont pas complètement capables de tous les mécanismes d’autoprotection, ce qui entraîne une plus grande susceptibilité aux toxines environnementales dans les voies biliaires néonatales11.
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Protocol
Suite à l’approbation éthique (N045/2021), des nouveau-nés de souris C57BL/6 mâles et femelles ont été observés jusqu’à l’âge de 9 jours. Les animaux sont nés et fournis à des fins expérimentales par l’animalerie du Centre médical universitaire de Hambourg-Eppendorf, Hambourg, Allemagne. Les nouveau-nés ont été logés dans une cage avec leurs animaux parents. Les conditions environnementales ont été contrôlées en température (20-24 °C), 12:12 h de cycle lumière-obscurité et humidité relative de 40 % à 70 %.
1. Préparation expérimentale
- Préparez l’équipement requis pour l’opération chirurgicale, y compris les ciseaux, les pinces, etc. (voir le tableau des matériaux).
- Placez les instruments désinfectés et autoclavés sur une surface stérile à côté de la table d’opération.
- Euthanasier rapidement une souris néonatale âgée de P9 par décapitation avec un ciseau opératoire. Placez le corps de la souris néonatale euthanasiée sur un champ d’opération stérile. Disséquer les EBDS chez les nouveau-nés de souris âgés de 9 jours (étape 5).
REMARQUE: La procédure de dissection décrite donne à tout scientifique les outils appropriés pour retirer l’EBDS des souris néonatales et plus âgées. Plus la souris est âgée, plus la préparation est facile.
2. Accès à la cavité péritonéale
- Saisissez la peau au-dessus de l’emplacement de la vessie avec une pince. Inciser un trou de 2 mm de diamètre dans la peau à l’aide de ciseaux, sans endommager le péritoine et les structures sous-jacentes. Étendre la coupe à l’emplacement de la décapitation, en suivant la ligne axillaire avant gauche. Retirez la peau de gauche à droite avec les pinces atraumatiques.
- Saisissez le péritoine entourant la rate. Soulevez-le doucement jusqu’à ce que le péritoine ressemble à une structure en forme de tente et coupez un trou de 1 mm de diamètre au centre. Attendez que la « tente péritonéale » se remplisse d’air. Utilisez un grossissement microscopique de 10x pour cette étape et les suivantes.
- Coupez le péritoine dans une fenêtre encadrée par les côtes inférieures, les deux régions abdominales latérales et la région inférieure de la vessie pour assurer un accès complet au foie, au système des voies biliaires, à l’estomac, à l’intestin grêle et au côlon.
REMARQUE: Pour améliorer l’accès au foie, une incision supplémentaire peut être effectuée, en enlevant les trois côtes les plus basses tout en laissant intactes le processus xiphoïde, le ligament falciforme, le foie et les voies biliaires. La vue sur le foie est facile à obtenir.
3. Examen de la vésicule biliaire et des voies biliaires
REMARQUE : Assurez-vous de garder l’échantillon humide régulièrement pendant toutes les étapes suivantes.
- Tirez délicatement le processus xiphoïde en position cranio-ventrale pour examiner la vésicule biliaire.
REMARQUE: La tension sur le ligament falciforme augmente avec ce mouvement, et la vésicule biliaire attachée devient visible.- Ne tirez que légèrement pour éviter une déchirure incontrôlable du ligament falciforme, ce qui pourrait entraîner une déchirure de la vésicule biliaire du système des voies biliaires. Relâchez l’attraction du processus xiphoïde avant l’étape suivante.
- Tirez doucement vers le bas le duodénum pour libérer le système des voies biliaires.
REMARQUE: Lorsque la tension sur le ligament hépatoduodénal augmente, le tissu des canaux biliaires devient visible.
4. Résection en bloc
- Effectuez la mobilisation en-bloc inférieure en suivant les étapes ci-dessous.
- Identifiez la papille duodénale qui relie le système des canaux biliaires au duodénum.
- Couper à travers le duodénum d’environ 2 cm du côté latéral droit de la papille.
- Couper à travers la zone pylorique. Assurez-vous que le contenu de l’estomac est présent dans la région pylorique entre le lieu de coupe et la papille duodénale.
REMARQUE: Il s’agit d’une étape importante pour la sécurité ultérieure de l’orientation pour l’emplacement correct des parties duodénales buccales et aborales.
- Effectuez la mobilisation en-bloc supérieure.
- Tirez doucement sur le processus xiphoïde et accédez au ligament falciforme.
- Effectuer une coupe de 1 cm de long à travers le ligament falciforme, aussi près que possible du processus xiphoïde, entre la vésicule biliaire et le processus xiphoïde. Assurez-vous de ne pas endommager la vésicule biliaire.
- Couper à travers les structures de connexion suivantes entre le foie et le thorax: œsophage, veine cave inférieure, aorte thoracique, tous les ligaments qui entourent la zone nue du foie et toutes les connexions tissulaires restantes dorsalement.
Remarque : L’échantillon en-bloc est complètement disséqué. Il contient le foie, le système des voies biliaires et le corpus duodénal, qui est relié à la région pylorique de l’estomac.
5. Curage final de la vésicule biliaire et des voies biliaires
- Effectuez la préparation brute en suivant les étapes ci-dessous.
- Placez l’échantillon en bloc sur un tampon en mousse habituellement utilisé pour la déshydratation. Utilisez un grossissement microscopique 20x et deux pinces atraumatiques microchirurgicales avec une taille maximale de pointe de 6 mm pour cette étape et les suivantes.
- Assemblez l’échantillon sur le tampon en mousse. Réorganisez l’échantillon dans la bonne position anatomique. Aplatir la partie orale et orale du duodénum, en effectuant un mouvement doux.
- Commencez le mouvement au niveau de la papille duodénale et continuez jusqu’aux bords tranchants à l’aide d’une pince atraumatique. Lissez le contenu pulpeux blanc de l’estomac, qui ne se produira que dans la partie buccale du duodénum. Assurez-vous d’identifier la partie buccale et la partie aborale du duodénum pour exclure une rotation probable des voies biliaires.
- Coupez les gros restes de tissu hépatique pour commencer la dissection du canal biliaire.
- Effectuez l’isolement final.
- Pressez doucement le tissu hépatique restant dans les pores du tapis de mousse. Assurez-vous que les mouvements de grattage commencent à partir du système des canaux biliaires et mènent aux limites du foie.
- Transférer l’échantillon dans une position plus propre sur le tapis de mousse après quelques mouvements de grattage dans différentes directions. Utilisez l’avantage d’un tissu hépatique moins pressé en arrière-plan pour optimiser la vue afin de différencier au mieux possible le EBDS des cellules indésirables. Grattez le tissu hépatique du canal biliaire jusqu’à ce qu’il ne reste rien, ou le moins possible, de tissu hépatique.
- Traiter le ligament hépatoduodénal jusqu’à ce qu’il reste le EBDS isolé. Enlevez les vaisseaux sanguins intraligamentataires comme l’artère hépatique, la veine porte et les petits restes. Retirez ce filament délicat, avec une légère traction et un grand soin, sur le côté latéral gauche. Cette étape de dissection peut avoir déjà commencé involontairement ou partiellement terminée lors de l’ablation préalable du tissu hépatique, ce qui conduit finalement au même résultat.
NOTE: Les vaisseaux sanguins émergent comme un filament blanc et très délicat d’environ 3-5 mm par voie orale de la papille duodénale et rejoignent le ligament hépatoduodénal du côté latéral gauche, s’accumulant avec le canal biliaire à la triade glissonienne. À la fin de cette étape, l’échantillon final est complètement isolé. S’il est nécessaire d’établir un dossier, il est possible de saisir des images après avoir organisé les structures des voies biliaires dans leur position anatomique (Figure 1). Il est recommandé de faire les dernières étapes de préparation sur un tapis de mousse car l’échantillon ne collera pas autant à la surface du champ d’opération. Si les pores sont humides, le canal biliaire lévite ou flotte. Lors du déplacement de l’échantillon, il ne collera pas aussi fermement qu’il le ferait avec la préparation sur le chiffon d’opération, ce qui n’entraînera aucune déchirure lors du déplacement de l’échantillon.
6. Préparation à l’analyse histologique
- Placer l’échantillon isolé dans une solution tamponnée, un milieu spécial ou des fixateurs contenant du formol (voir le tableau des matières) dès que possible après la dissection.
- Choisissez une solution de stockage appropriée en fonction des étapes de traitement prévues.
ATTENTION : Utilisez des fixateurs contenant du formol uniquement sous une bouche d’aération en raison de leur toxicité aiguë, de leur corrosivité et de divers risques pour la santé.
NOTE: Dans l’étude présentée, les échantillons EBDS ont été insérés dans du paraformaldéhyde, déshydratés et incorporés dans de la paraffine. Ils ont été entreposés à température ambiante et refroidis avant le sectionnement. Dans une armoire chauffante, des tranches de 2 μm ont été conservées pendant la nuit et colorées à l’aide d’hématoxyline conventionnelle et d’éosine4 (voir le tableau des matériaux).
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Representative Results
La figure 1A montre l’EBDS d’un nouveau-né murin, qui a été disséqué avec la technique décrite. Au microscope, aucun autre tissu hépatique n’est visible. Le tissu hépatique a été enlevé au cours des dernières étapes d’isolement du protocole et pourrait facilement être distingué du tissu des canaux biliaires en ce qui concerne la couleur et la consistance. La figure 1B montre l’échantillon isolé par rapport à une échelle millimétrique. La longueur de l’EBD (mesurée de la vésicule biliaire à la papille duodénale) est inférieure à 10 mm. Le diamètre du très délicat Ductus choledochus variait de 0,05 à 0,2 mm. La figure 2 représente la coloration à l’hématoxyline-éosine d’une coupe longitudinale de l’EBDS avec une lumière ouverte. Les cholangiocytes peuvent être identifiés entourant la lumière comme une monocouche et teints plus foncés. La microscopie a été réalisée en utilisant un grossissement de 20x. Les figures montrent que l’utilisation du protocole de dissection décrit permet à l’opérateur de disséquer au microscope l’EBDS près des marges du conduit, même chez les souris néonatales. Les échantillons ont été prélevés sur des nouveau-nés murins âgés de 9 jours.
Figure 1 : Dissection EBDS. (A) Échantillon final EBDS d’un nouveau-né murin. (1) vésicule biliaire, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinister, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Duodenum. Barre d’échelle = 500 μm. (B) Dimension de taille de l’EBDS disséqué par rapport à une échelle millimétrique. Barre d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Coupe longitudinale de l’EBDS. La coloration à l’hématoxyline-éosine montre que l’EBDS contient une lumière ouverte. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Développement du poids des nouveau-nés C57BL/6 jusqu’à leur neuvième jour de vie. Les nouveau-nés étaient pesés jusqu’à deux fois par jour. Les données fournies montrent le poids des animaux témoins (n = 5). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Cet article rapportait et discutait de la création et de la validation d’une nouvelle approche chirurgicale pour retirer l’EBDS de souris néonatales euthanasiées. Les résultats microscopiques et histologiques révèlent que l’approche détecte rapidement les EBD et les dissèque près des marges du canal, même chez les souris néonatales. Seuls des instruments chirurgicaux et un microscope avec un grossissement de 20x sont nécessaires pour le protocole décrit. De plus, l’approche permet d’isoler l’ensemble de l’EBDS. La technique est très efficace, directe et simple à reproduire.
Pour l’étude des maladies des voies biliaires telles que l’atrésie biliaire, la CSP et la CBP, l’extraction mécanique de l’ensemble du système des canaux biliaires est fréquemment nécessaire. En raison de la petite taille, en particulier chez les nouveau-nés, il est difficile de disséquer, de traiter et d’analyser. L’isolement des cellules canalaires extrahépatiques de souris nouveau-nées âgées de 1 jour a déjà été établi, mais la méthode a été décrite comme difficile. En général, les personnes qui découvrent cette procédure éprouvent des difficultés en raison de problèmes techniques liés aux techniques de dissection ainsi qu’au nettoyage des petits canaux biliaires5. Par conséquent, le groupe de travail opérationnel a étudié une nouvelle stratégie pour préparer l’EBDS dans un modèle murin néonatal. Dans la présente étude, la technique permet une dissection efficace de chaque échantillon. Les nouveau-nés ont été sacrifiés à l’âge de 9 jours et les voies biliaires ont été récoltées comme décrit dans le protocole. En outre, la technique était également applicable chez les nouveau-nés plus jeunes. Certaines personnes sont mortes ou ont dû être sacrifiées avant d’atteindre le neuvième jour, y compris les nouveau-nés pesant moins de 2 g (figure supplémentaire 1). Les opérateurs doivent envisager une durée opératoire plus longue en raison du stade néonatal de développement. La différenciation tissulaire n’est pas trop avancée, ce qui complique la préparation et augmente la difficulté par rapport à la préparation d’échantillons adultes.
Un autre effet secondaire concernant la difficulté de la préparation est la forte possibilité de cellules indésirables dans l’échantillon, ce qui pourrait entraîner une contamination des cultures cellulaires. En revanche, la nouvelle technique de dissection permet aux opérateurs inexpérimentés disposant de l’équipement nécessaire de retirer l’EBDS aussi propre que possible. Par conséquent, il est encore plus important d’utiliser la meilleure approche possible pour la dissection de l’EBD chez les souris néonatales. S’il est utilisé comme indiqué dans le protocole, l’équipement atraumatique, accompagné d’un tapis en mousse, ne blessera pas, ou très légèrement, le canal biliaire. Le coussinet en mousse va doucement contrer les mouvements de l’opérateur tout en disséquant le tissu indésirable, contenant des cellules telles que les hépatocytes et les fibroblastes de l’EBD sans l’endommager. En fait, même la bile peut être préservée. En outre, le protocole décrit un accès sûr au système de voies biliaires en raison de la progression prudente couche par couche. En conséquence, les anomalies congénitales et les adhérences péritonéales seront visibles avant que tout tissu ne soit endommagé.
Un principe chirurgical majeur pendant l’opération dans le but de l’ablation (par exemple, la résection tumorale ou la cholécystectomie chez les individus vivants) est d’épargner autant de tissu sain que possible. L’applicabilité de ce principe doit être demandée pour l’exécution de la préparation chirurgicale chez la souris euthanatisée. Pour la dissection EBD, il a été décidé de ne pas épargner le tissu hépatique mais plutôt d’effectuer un EBR de l’EBDS, du foie et du corpus duodénal, ce qui s’est avéré être un grand avantage technique et moins difficile que de retirer exclusivement l’EBD de la cavité abdominale. Après l’EbR, l’échantillon en bloc a été transféré sur un tapis de mousse pour le mouvement du tissu hépatique et des restes contaminants.
L’utilisation de techniques chirurgicales alternatives pour enlever le système complet des canaux biliaires extrahépatiques ne peut pas être envisagée pour la préparation de souris après l’euthanasie. La raison en est la séquence des mouvements d’opération; La préparation descendante, comme son nom l’indique, commence au sommet (dans ce cas, la vésicule biliaire) et progresse jusqu’à la jonction du duodénum et du Ductus choledochus. Pour commencer, retirez la vésicule biliaire du tissu hépatique, puis du canal kystique, et enfin du canal hépatique commun et du canal cholédoque jusqu’à la jonction du duodénum et du canal cholédoque. Cette technique d’isolement utilisée en peropératoire dans l’abdomen de souris néonatales a entraîné des lésions des voies biliaires ou un enroulement du canal biliaire isolé. L’enroulement a été causé par une prise trop lâche. Il est extrêmement difficile de localiser le canal biliaire après l’enroulement. En tentant d’éviter l’enroulement lors d’autres dissections, le canal biliaire ou le ligament falciforme lié a été resserré plus fermement, ce qui arrête l’enroulement indésirable, mais peut entraîner des dommages cellulaires avec de mauvais résultats à l’examen histologique ultérieur. Pour la dissection de la vésicule biliaire unique, une dissection descendante est conseillée.
Dans une technique alternative, la préparation ascendante se fait dans l’ordre inverse. La préparation commence à la jonction du duodénum et du Ductus choledochus. Deuxièmement, le duodénum doit être tiré vers le bas caudale à l’aide d’une pince atraumatique avec la main droite, provoquant un étirement du ligament hépatoduodénal et révélant ainsi le canal biliaire. En attendant, utilisez la pince atraumatique de la main gauche pour accéder à la bourse omentale et maintenir la tension sur le ligament hépatoduodénal. En commençant par le duodénum, une préparation précise jusqu’à la confluence du canal kystique et du canal hépatique commun est réalisable. Cependant, tout en disséquant davantage le canal kystique et la vésicule biliaire du foie, la tension peut s’accumuler à un moment donné, entraînant la déchirure et l’enroulement des voies biliaires. Les expériences ont montré que la préparation ascendante n’est conseillée que pour la dissection du Ductus choledochus chez les souris nouveau-nées.
Pour résumer, les préparations descendantes et ascendantes ont montré des inconvénients significatifs dans la préparation des souris nouveau-nées. En conséquence, le nouveau modèle a été développé pour faciliter la dissection de l’EBDS complet, ce qui permet d’identifier et de transférer de manière fiable et efficace les emplacements des voies biliaires vers des contextes histologiques examinés ultérieurement.
En plus des approches mécaniques et chirurgicales, la digestion enzymatique est devenue plus pertinente dans le traitement des tissus au cours des dernières décennies 5,12. Les enzymes hautement purifiées offrent une alternative précise pour cibler des structures spécifiques sans nuire aux cellules sélectionnées pour d’autres expériences.
L’isolement des cholangiocytes extra- et intrahépatiques a été établi avec succès chez la souris et le rat 5,13,14,15,16. Cependant, les deux techniques permettent d’isoler des cellules individuelles lorsqu’un canal biliaire intact est essentiel pour certaines techniques, en particulier les approches histologiques. De plus, même pour les approches de culture cellulaire, toutes les études publiées nécessitent une étape de dissection mécanique avant la digestion enzymatique sans fournir de protocole détaillé étape par étape. La dissection précédente entraîne une réduction de la contamination par culture cellulaire, ce qui prouve que la technique de dissection sera avantageuse pour les approches histologiques et expérimentales diverses.
Au début, la technique peut nécessiter un certain temps pour l’entraînement. La pratique augmentera la vitesse et le résultat. Les opérateurs peuvent être sûrs que le simple fait de suivre l’approche étape par étape conduira à une reproductibilité facile et à une isolation précise.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl et Magdalena Trochimiuk pour leurs contributions. Hans Christian Schmidt a été soutenu financièrement par la bourse Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Hambourg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
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