Summary
לתצפית על הפרעות בצינור המרה של מורין, נדרש צינור מרה שלם והכנה יעילה. לכן, גישה חדשה לבידוד כל מערכת צינורות המרה החוץ-כבדיים ביילודים מורין פותחה בהצלחה תוך שמירה על שלמות צינור המרה.
Abstract
כריתה של צינורות מרה ילודים מורין תוארה כקשה. המטרה העיקרית של הליך ההפעלה הסטנדרטי המתואר היא בידוד של צינור המרה החוץ-כבד (EBD) ביילודים של עכברים מבלי לפגוע בצינור המרה במהלך ההכנה. בגלל ההכנה הקרובה במיוחד שלה בהשוואה לקו התאים של כולנגיוציטים וקציר של כל מערכת צינורות המרה החוץ-כבדיים (EBDS), הגישה המתוארת שימושית ביותר בחקר מודלים של בעלי חיים של הפרעות בצינור המרה של יילודים, כגון אטרזיה של המרה. לאחר המתת חסד, חלל הצפק היה גישה, ואת מערכת צינור המרה, התריסריון, ואת הכבד חולצו עם הייחודי En-bloc-Reduct (EbR). הדגימה המופקת מונחת על מחצלת קצף, וה- EBD מנותח מתאים מזהמים באופן אטראומטי ללא מגע הכרחי. ניתוח של EBDS כולו הוא יתרון משמעותי של שיטה זו. יש לנקוט משנה זהירות בשל הגודל הקטן והכמות של רקמת צינור המרה. באמצעות הטכניקה המתוארת, אין נזק cholangiocytes. יתר על כן, טוהר הטכניקה ניתן לשחזור (n = 10). לכן, ניתן לקצור דגימות דומות באופן אופטימלי. יתר על כן, אף רקמת צינור המרה אינה נפגעת, מכיוון שניתן להימנע מכל מגע עם מערכת צינור המרה במהלך ההכנה, ולהשאיר את נוזל המרה בתוך כיס המרה. והכי חשוב, בעת ביצוע כיס המרה הסופי ודיסקציה של צינור המרה, מיקרו-מכשירים א-טראומטיים שימשו רק מעט לרוחב צינור המרה מבלי לסחוט אותו. זהו המפתח למדגם נקי ושלם, וחיוני לחקירה היסטולוגית נוספת או לבידוד של כולנגיוציטים. לסיכום, טכניקת הדיסקציה החדשנית המתוארת מאפשרת למפעילים חסרי ניסיון במיוחד עם הציוד הדרוש לבודד את ה- EBDS בצורה נקייה ככל האפשר.
Introduction
ההתחלה וההתקדמות של כולנגיופתיות כגון אטרזיה מרה, כולנגיטיס סקלרוזית ראשונית (PSC), וכולנגיטיס מרה ראשונית (PBC) אינן ידועות או לא שלמות 1,2. ההבנה המוגבלת של מקורן והתקדמותן של מחלות אלה מובילה למיעוט אפשרויות הטיפול3. המכשול הקשה ביותר בחקר הפרעות בצינור המרה של ילודים הוא השגת הבנה מולקולרית של הפתופיזיולוגיה. אחד המפתחות החיוניים להבנה טובה יותר של הפתולוגיה המולקולרית הוא התצפית הטובה ביותר האפשרית על רקמות מושפעות. כדי למנוע השוואה מופחתת ופערים בין מחקרים, כגון התבוננות באטיולוגיה ויראלית פוטנציאלית של אטרזיה מרה4, מתעורר הצורך בהכנה הטובה ביותר האפשרית ושיתוף של טכניקות הדיסקציה שבוצעו. הכנה טהורה של רקמת המטרה נחוצה למחקרים מיקרוסקופיים מאוחרים יותר או לגידול תרביות אורגנואידיות תלת-ממדיות ותלת-ממדיות. עם זאת, בהפרעות ילודים מורין, דגימות רקמות הן נדירות ומתרחשות רק בכמות קטנה בשל גודל קטן מאוד. לגבי הפרעות בצינור המרה, תוארו קשיים בהכנה נקייה של צינורות המרה בילודים מורין5. בשל שלב ההתפתחות של היילודים, התמיינות הרקמות אינה מתקדמת יתר על המידה, מה שמסבך את ההכנה ומגביר את הקושי בהשוואה להכנת דגימות בוגרות. לכן, קבוצת העבודה התפעולית חקרה אסטרטגיה חדשנית להכנת ה- EBDS במודל עכבר יילודים. במחקר הנוכחי, הטכניקה מאפשרת ניתוח יעיל של כל דגימה.
מערכת צינור המרה ממוקמת באופן תוך-צפקי בבטן העליונה הימנית, הנובעת מהכבד. כיס המרה ממוקם מתחת לפני השטח הקרביים של האונה הימנית של הכבד. צינור המרה, יחד עם וריד הפורטל ועורק הכבד, מוטבע ברצועת ההפטודודנל. הוא מחבר את הכבד ואת התריסריון ישירות ומנקז נוזל מרה לתוך התריסריון6. מבחינה אנטומית, צינור המרה מחולק לצינורות הכבד הימניים והשמאליים, צינור הכבד המשותף, הצינור הציסטי, ודוקטוס choledochus, אשר נוצר על ידי מפגש של צינור ציסטי ואת צינור הכבד המשותף7. זה בסופו של דבר מרוקן נוזל מרה ורוק מצינור הלבלב לתוך התריסריון דרך אמפולה של Vater.
כולנגיוציטים מרפדים את צינור המרה באופן תוך-הפטי וחוץ-הפטי, ושוכנים בנישה אנטומית מסובכת שבה הם מסייעים בייצור מרה ובהומאוסטזיס8. נוזל המרה עובר את תאי האפיתל המתמחים האלה בריכוזים גבוהים מדי יום. בפרט, תחזוקת מטריית HCO3 חשובה מאוד להגנה מפני רעילות חומצת מרה9. Cholangiocytes הם קו ההגנה הראשון במערכת hepatobiliary נגד, למשל, מיקרואורגניזמים luminal10. יעילות ההגנה של כולנגיוציטים מפני התקפות רעילות עלולה להיחלש על ידי נטייה גנטית. עומס יתר רעיל גורם לנזק והרס ולכן יכול להוביל לכולנגיופתיות. יתר על כן, צינור המרה המתפתח אינו מסוגל לחלוטין לכל מנגנוני ההגנה העצמית, מה שמוביל לרגישות גבוהה יותר לרעלנים סביבתיים בצינורות המרה היילודים11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
לאחר אישור אתי (N045/2021), נצפו יילודים של עכברים זכרים ונקבות C57BL/6 עד גיל 9 ימים. בעלי החיים נולדו וסופקו למטרות ניסוי על ידי מתקן החיות של המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף, המבורג, גרמניה. היילודים שוכנו בכלוב יחד עם חיות האם שלהם. התנאים הסביבתיים היו מבוקרים בטמפרטורה (20-24 מעלות צלזיוס), מחזור אור-חושך של 12:12, ולחות יחסית של 40%-70%.
1. הכנה ניסיונית
- הכינו את הציוד הנדרש לפעולה כירורגית, כולל מספריים, מלקחיים וכו' (ראו טבלת חומרים).
- הניחו מכשירים מחוטאים ואוטומטיים על משטח סטרילי ליד שולחן הניתוחים.
- הרדימו עכבר יילודים בגיל P9 במהירות על ידי עריפת ראשו באמצעות מספריים פועלים. מניחים את גופו של עכבר היילוד המומת על שדה ניתוח סטרילי. נתחו את ה-EBDS בפגי עכברים בני 9 ימים (שלב 5).
הערה: הליך הנתיחה המתואר נותן לכל מדען את הכלים המתאימים להסרת ה- EBDS מעכברים ילודים ומבוגרים יותר. ככל שהעכבר ישן יותר, כך ההכנה קלה יותר.
2. גישה לחלל הצפק
- לתפוס את העור מעל המיקום של שלפוחית השתן עם מלקחיים. חותכים חור בקוטר 2 מ"מ לתוך העור באמצעות מספריים, מבלי לפגוע בצפק ובמבנים שמתחתיו. הרחב את החתך למיקום העריפה, בעקבות קו בית השחי הקדמי השמאלי. הסר את העור מצד שמאל לצד ימין עם מלקחיים atraumatic.
- תפסו את הצפק המקיף את הטחול. מרימים אותו בעדינות עד שהצפק דומה למבנה דמוי אוהל וחותכים חור בקוטר 1 מ"מ במרכז. המתן עד ש"אוהל הצפק "יתמלא באוויר. השתמש בהגדלה מיקרוסקופית של 10x עבור שלב זה והשלבים הבאים.
- חותכים את הצפק בחלון הממוסגר על ידי הצלעות התחתונות, הן אזורי הבטן הצדדיים והן אזור שלפוחית השתן התחתונה כדי להבטיח גישה מלאה לכבד, למערכת צינורות המרה, לקיבה, למעי הדק ולמעי הגס.
הערה: כדי לשפר את הגישה לכבד, ניתן לבצע חתך נוסף, הסרת שלוש הצלעות הנמוכות ביותר תוך השארת התהליך הקסיפואידי, הרצועה הזיפית, הכבד ומבני צינור המרה ללא פגע. קל להשיג את הנוף של הכבד.
3. בדיקת כיס המרה וצינורות המרה
הערה: הקפידו לשמור על הדגימה רטובה על בסיס קבוע במהלך כל השלבים הבאים.
- בזהירות למשוך את תהליך xiphoid במצב cranioventral כדי לבחון את כיס המרה.
הערה: המתח על הרצועה המזויפת עולה עם תנועה זו, וכיס המרה המחובר הופך גלוי.- בצע רק משיכה קלה כדי למנוע קריעה בלתי נשלטת של הרצועה falciform, אשר עלול להוביל לקרע כיס המרה ממערכת צינור המרה. שחרר את המשיכה של תהליך xiphoid לפני השלב הבא.
- משכו בעדינות את התריסריון כלפי מטה כדי לשחרר את מערכת צינורות המרה.
הערה: ככל שהמתח ברצועה הפטודואודנלית עולה, רקמת צינור המרה הופכת לגלויה.
4. כריתה של גוש
- בצע את ההתגייסות הנמוכה יותר בגוש בהתאם לשלבים הבאים.
- זהה את הפפילה של התריסריון, המחברת את מערכת צינורות המרה לתריסריון.
- חותכים דרך התריסריון כ -2 ס"מ מהצד הימני הצדדי של הפפילה.
- חותכים דרך האזור הפילורי. ודא כי תוכן הקיבה נמצאים באזור פילורי בין מיקום החיתוך לבין פפילה התריסריון.
הערה: זהו צעד חשוב לאבטחת התמצאות מאוחרת יותר עבור המיקום הנכון של חלקי התריסריון האוראליים והאוראליים.
- בצע את גיוס הגוש העליון.
- משכו בעדינות את התהליך הקסיפואידי וקבלו גישה לרצועה המזויפת.
- בצע חתך באורך 1 ס"מ דרך הרצועה falciform, קרוב ככל האפשר לתהליך xiphoid, בין כיס המרה לבין תהליך xiphoid. הקפד לא לפגוע בכיס המרה.
- חותכים את המבנים המקשרים הבאים בין הכבד לבית החזה: הוושט, הווריד הנבוב התחתון, אבי העורקים החזי, כל הרצועות המקיפות את האזור החשוף של הכבד, וכל קשרי הרקמות שנותרו באופן דורסלי.
הערה: דגימת en-bloc מנותחת לחלוטין. הוא מכיל את הכבד, מערכת צינור המרה, ואת קורפוס התריסריון, אשר מחובר עם האזור הפילורי של הבטן.
5. דיסקציה סופית של כיס המרה וצינור המרה
- בצע את ההכנה ברוטו לפי השלבים הבאים.
- הניחו את דגימת הגוש על כרית קצף המשמשת בדרך כלל להתייבשות. השתמש בהגדלה מיקרוסקופית של 20x ובשני מלקחיים א-טראומטיים מיקרו-כירורגיים עם גודל קצה מרבי של 6 מ"מ עבור שלב זה והשלבים הבאים.
- הרכיבו את הדגימה על כרית הקצף. ארגן מחדש את הדגימה במיקום האנטומי הנכון. משטחים את החלק האוראלי והאבראלי של התריסריון, מבצעים תנועה עדינה.
- התחל את התנועה בפפילה התריסריון והמשיך לקצוות החיתוך באמצעות מלקחיים א-טראומטיים. להחליק את התוכן עיסתי לבן של הבטן, אשר יתרחש רק בחלק האוראלי של התריסריון. הקפידו לזהות את החלק האוראלי ואת החלק האבראלי של התריסריון כדי לשלול סיבוב סביר של צינור המרה.
- חותכים שרידים גדולים של רקמת הכבד כדי להתחיל דיסקציה של צינור המרה.
- בצע את הבידוד הסופי.
- לחצו בעדינות את רקמת הכבד הנותרת לתוך הנקבוביות של מחצלת הקצף. ודא שתנועות הגירוד מתחילות ממערכת צינורות המרה ומובילות לגבולות הכבד.
- העבירו את הדגימה למצב נקי יותר על שטיחון הקצף לאחר מספר תנועות גירוד בכיוונים שונים. השתמש ביתרון של רקמת כבד פחות דחוסה ברקע כדי למטב את התצוגה להבחנה הטובה ביותר האפשרית בין EBDS לתאים לא רצויים. מגרדים את רקמת הכבד מצינור המרה עד שלא נותר דבר, או מעט ככל האפשר, של רקמת הכבד.
- מעבדים את הרצועה ההפטודואודנלית עד שנשאר ה-EBDS המבודד. הסר כלי דם תוך ליגמנטליים כמו עורק הכבד, וריד הפורטל ושרידים קטנים. הסר נימה עדינה זו, עם משיכה עדינה וטיפול גבוה, לצד שמאל לרוחב. ייתכן ששלב זה של דיסקציה כבר החל שלא במתכוון או בחלקו במהלך ההסרה הקודמת של רקמת הכבד, מה שבסופו של דבר מוביל לאותה תוצאה.
הערה: כלי הדם מתגלים כחוט לבן ועדין מאוד כ-3-5 מ"מ דרך הפה של הפפילה בתריסריון ומצטרפים לרצועה ההפטודואודנלית מצד שמאל לרוחב, המצטברים עם צינור המרה לשלישייה הגליסונית. עם השלמת שלב זה, המדגם הסופי מבודד לחלוטין. אם יש צורך ברשומה, ניתן לצלם תמונות לאחר ארגון מבני צינורות המרה למקומם האנטומי (איור 1). מומלץ לבצע את שלבי ההכנה האחרונים על מחצלת קצף מכיוון שהדגימה לא תידבק כל כך לפני השטח של שדה הניתוח. אם הנקבוביות רטובות, צינור המרה מרחף או צף. בעת הזזת הדגימה, היא לא תידבק בחוזקה כפי שהייתה עושה עם הכנה על בד הניתוח, וכתוצאה מכך לא תיקרע בעת הזזת הדגימה.
6. הכנה לניתוח היסטולוגי
- שים את הדגימה המבודדת בתמיסה חצויה, מדיום מיוחד או קיבועים המכילים פורמלין (ראה טבלת חומרים) בהקדם האפשרי לאחר הנתיחה.
- בחר פתרון אחסון מתאים בהתאם לשלבי עיבוד מתוכננים נוספים.
אזהרה: יש להשתמש בחומרים מקבעים המכילים פורמלין רק מתחת לפתח האוורור בגלל רעילות חריפה, קורוזיביות וסכנות בריאותיות מגוונות.
הערה: במחקר המוצג, דגימות ה-EBDS הוכנסו לפרפורמלדהיד, התייבשו והוטמעו בפרפין. הם אוחסנו בטמפרטורת החדר והתקררו לפני החתך. בארון חימום, פרוסות 2 מיקרומטר נשמרו למשך הלילה והוכתמו באמצעות המטוקסילין קונבנציונאלי ואאוזין4 (ראו טבלת חומרים).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1A מראה את ה-EBDS של יילוד מורין, אשר נותח בטכניקה המתוארת. מבחינה מיקרוסקופית, לא נראית רקמת כבד נוספת. רקמת הכבד הוסרה בשלבי הבידוד הסופיים של הפרוטוקול וניתן היה להבחין בה בקלות מרקמת צינור המרה לגבי צבע ועקביות. איור 1B מציג את הדגימה המבודדת בהשוואה לקנה מידה מילימטרי. אורך ה-EBD (הנמדד מכיס המרה ועד פפילה בתריסריון) הוא פחות מ-10 מ"מ. הקוטר של דוקטוס choledochus עדין מאוד נע בין 0.05-0.2 מ"מ. איור 2 מתאר צביעה המטוקסילין-אוזין של חתך אורך של EBDS עם לומן פתוח. ניתן לזהות את כולנגיוציטים המקיפים את הלומן כמונו-שכבתי וצבועים כהים יותר. המיקרוסקופיה בוצעה באמצעות הגדלה של פי 20. הנתונים מראים כי השימוש בפרוטוקול הדיסקציה המתואר מאפשר למפעיל לנתח באופן מיקרוסקופי את ה-EBDS בסמוך לשולי הצינור, אפילו בעכברים ילודים. הדגימות נלקחו מילודים בני 9 ימים.
איור 1: דיסקציה של EBDS . (A) דגימת EBDS סופית של יילוד מורין. (1) כיס המרה, (2) דוקטוס ציסטיקוס, (3) דוקטוס הפטיקוס דקסטר, (4) דוקטוס הפטיקוס סיניסטר, (5) דוקטוס הפטיקוס קומוניס, (6) דוקטוס כולדוכוס, (7) תריסריון. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) ממד הגודל של ה- EBDS המנותח בהשוואה לקנה מידה מילימטרי. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: חתך אורך של ה-EBDS. צביעת המטוקסילין-אאוזין מראה EBDS המכיל לומן פתוח. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: התפתחות משקל של C57BL/6-ילודים עד ליום התשיעי לחייהם. יילודים נשקלו עד פעמיים ביום. הנתונים המסופקים מראים את משקלן של חיות הבקרה (n = 5). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה דיווח ודן ביצירה ואימות של גישה כירורגית חדשה להסרת EBDS של עכברי ילודים מורדמים. ממצאים מיקרוסקופיים והיסטולוגיים מגלים כי הגישה מזהה במהירות EBDs ומנתחת אותם בסמוך לשולי הצינור, אפילו בעכברים ילודים. רק כלי ניתוח ומיקרוסקופ עם הגדלה של 20x נדרשים לפרוטוקול המתואר. יתר על כן, הגישה מאפשרת בידוד של כל ה- EBDS. הטכניקה יעילה ביותר, פשוטה ופשוטה לשכפול.
עבור המחקר של מחלות צינור המרה כגון אטרזיה המרה, PSC, ו PBC, מיצוי מכני של כל מערכת צינור המרה נדרש לעתים קרובות. בגלל הגודל הקטן, במיוחד בילודים, קשה לנתח, לעבד ולנתח. הבידוד של תאים צינוריים חוץ-כבדיים של EBDs של עכבר בן יום אחד כבר נקבע, עם זאת, השיטה תוארה כקשה. בדרך כלל, אנשים חדשים בהליך זה מתקשים בשל אתגרים טכניים עם טכניקות הנתיחה, כמו גם ניקוי של צינורות המרה הקטנים5. לכן, קבוצת העבודה התפעולית חקרה אסטרטגיה חדשנית להכנת ה- EBDS במודל עכבר יילודים. במחקר הנוכחי, הטכניקה מאפשרת ניתוח יעיל של כל דגימה. יילודים הוקרבו בגיל 9 ימים וצינורות מרה נקטפו כמתואר בפרוטוקול. יתר על כן, הטכניקה הייתה ישימה גם בילודים צעירים יותר. חלק מהאנשים מתו או נאלצו להקריב לפני שהגיעו ליום התשיעי, כולל ילודים במשקל של פחות מ-2 גרם (איור משלים 1). המפעילים צריכים לשקול זמן פעולה ארוך יותר בשל שלב היילודים של הפיתוח. התמיינות הרקמות אינה מתקדמת יתר על המידה, מה שמסבך את ההכנה ומגביר את הקושי בהשוואה להכנת דגימות למבוגרים.
תופעת לוואי נוספת לגבי הקושי בתכשיר היא האפשרות הגבוהה של תאים לא רצויים בדגימה, מה שעלול להוביל לזיהום בתרביות תאים. לעומת זאת, טכניקת הדיסקציה החדשנית מאפשרת למפעילים חסרי ניסיון עם הציוד הדרוש להסיר את ה- EBDS נקי ככל האפשר. כתוצאה מכך, זה אפילו יותר קריטי להשתמש בגישה הטובה ביותר האפשרית עבור דיסקציה EBD בעכברים ילודים. אם נעשה שימוש כאמור בפרוטוקול, הציוד הא-טראומטי, המלווה במחצלת קצף, לא יפצע, או רק במעט מאוד, את צינור המרה. כרית הקצף תנטרל ברכות את תנועות המפעיל תוך ניתוח הרקמה הלא רצויה, המכילה תאים כגון הפטוציטים ופיברובלסטים של ה- EBD מבלי לפגוע בו. למעשה, אפילו מרה ניתן לשמר. בנוסף, הפרוטוקול מתאר גישה בטוחה למערכת צינורות המרה עקב התקדמות זהירה שכבה אחר שכבה. כתוצאה מכך, מומים מולדים והידבקויות הצפק יהיו גלויים לפני כל רקמה ניזוקה.
עיקרון ניתוחי מרכזי אחד במהלך הניתוח במטרה להסיר (למשל, כריתת גידול או כריתת כריתת רחם אצל אנשים חיים) הוא לחסוך כמה שיותר רקמות בריאות. יש לבקש את תחולתו של עיקרון זה לביצוע הכנה כירורגית בעכברים שעברו המתת חסד. עבור דיסקציה EBD, הוחלט לא לחסוך את רקמת הכבד אלא לבצע EbR של EBDS, כבד, קורפוס התריסריון, אשר הוכיח להיות יתרון טכני גדול להיות פחות קשה מאשר להסיר באופן בלעדי את ה- EBD מחלל הבטן. לאחר ה- EbR, דגימת הגוש הועברה למחצלת קצף לתנועה של רקמת כבד ושרידי מזהמים.
השימוש בטכניקות כירורגיות חלופיות להסרת מערכת צינור המרה החוץ-כבדית המלאה אינו יכול להיחשב להכנת עכבר לאחר המתת חסד. הסיבה לכך היא רצף תנועות הפעולה; הכנה מלמעלה למטה, כפי שהשם מרמז, מתחילה בחלק העליון (במקרה זה, כיס המרה) ומתקדמת לצומת התריסריון והדוקטוס choledochus. כדי להתחיל, להסיר את כיס המרה מרקמת הכבד, ולאחר מכן את הצינור הציסטי, ולבסוף את הכבד המשותף ואת ductus choledochus לצומת של התריסריון ו ductus choledochus. טכניקת בידוד זו שנעשה בה שימוש תוך-ניתוחי בבטנם של עכברים ילודים גרמה לפגיעה בצינור המרה או לסליל של צינור המרה המבודד. הסליל נגרם כתוצאה מכך שהאחיזה הייתה רופפת מדי. קשה מאוד לאתר את צינור המרה לאחר סליל. בניסיון להימנע מהסליל בנתיחות נוספות, צינור המרה או הרצועה המזויפת המקושרת התהדקו בצורה איתנה יותר, מה שעוצר סלילים לא רצויים אך עלול לגרום לנזק תאי עם תוצאות גרועות בבדיקה ההיסטולוגית שלאחר מכן. עבור דיסקציה של כיס המרה יחיד, מומלץ דיסקציה מלמעלה למטה.
בטכניקה חלופית, ההכנה מלמטה למעלה נעשית בסדר הפוך. ההכנה מתחילה בצומת התריסריון והדוקטוס choledochus. שנית, יש למשוך את התריסריון כלפי מטה באמצעות מלקחיים א-טראומטיים ביד ימין, מה שגורם למתיחה של רצועת ההפטודודנל ובכך חושף את צינור המרה. בינתיים, השתמש במלקחיים הא-טראומטיים ביד שמאל כדי לגשת לבורסה האומנטלית ולשמור על מתח ברצועה ההפטודואודנלית. החל מהתריסריון, הכנה מדויקת עד למפגש של ציסטי ואת צינור הכבד הנפוץ הוא בר השגה. עם זאת, תוך כדי ניתוח נוסף של צינור הכבד הציסטי וכיס המרה, המתח עלול להצטבר בשלב מסוים, וכתוצאה מכך צינור המרה ייקרע ויתפתל. הניסויים הראו כי הכנה מלמטה למעלה מומלצת רק לנתיחה של Ductus choledochus בעכברים שזה עתה נולדו.
לסיכום, תכשירים מלמעלה למטה ומלמטה למעלה הדגימו חסרונות משמעותיים בהכנת עכברים שזה עתה נולדו. כתוצאה מכך, המודל החדש פותח כדי להשיג את ניתוח ה- EBDS השלם ביתר קלות, המאפשר זיהוי והעברה של מיקומי צינורות המרה להקשרים היסטולוגיים שנבחנו מאוחר יותר באופן אמין ויעיל.
בנוסף לגישות מכניות וכירורגיות, עיכול אנזימטי הפך לרלוונטי יותר בעיבוד רקמות בעשורים האחרונים 5,12. אנזימים מטוהרים מאוד מספקים חלופה מדויקת להתמקד במבנים ספציפיים מבלי לפגוע בתאים שנבחרו לניסויים נוספים.
הבידוד של כולנגיוציטים חוץ-גופיים ותוך-כבדיים התבסס בהצלחה בעכברים ובחולדות 5,13,14,15,16. עם זאת, שתי הטכניקות מאפשרות לבודד תאים בודדים כאשר צינור מרה שלם הוא קריטי עבור טכניקות מסוימות - בפרט גישות היסטולוגיות. בנוסף, אפילו עבור גישות של תרביות תאים, כל המחקרים שפורסמו דורשים שלב ניתוח מכני לפני עיכול אנזימטי מבלי לספק פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב. דיסקציה קודמת מביאה להפחתה של זיהום תרביות תאים, מה שמוכיח שטכניקת הדיסקציה תהיה יתרון עבור גישות היסטולוגיות וניסיוניות שונות.
בהתחלה, הטכניקה עשויה לדרוש קצת זמן לאימון. תרגול יגביר את המהירות והתוצאה. המפעילים יכולים להיות בטוחים שפשוט ביצוע הגישה שלב אחר שלב יוביל לשכפול קל ולבידוד מדויק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
המחברים מודים ליוהנה האגנס, פאולין שופרט, קלרה פיליפי, PD ד"ר כריסטיאן טומושאט, סווניה וורנקה, PD ד"ר דיאנה לינדנר, פרופ' ד"ר דירק וסטרמן, מרים טומצ'אק, ניקול לודר, נדין קורזאווה, ד"ר לאיה פייג'רולס רלוי, בירגיט אפל ומגדלנה טרוצ'ימיוק על תרומתם. הנס כריסטיאן שמידט נתמך כספית על ידי מלגת iPRIME של קרן אלזה קרנר פרסניוס (2021_EKPK.10), UKE, המבורג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C.
- Kobayashi, H., Stringer, M. D.
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G.
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al.
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
