Summary
Per l'osservazione dei disturbi del dotto biliare neonatale murino, sono necessari un dotto biliare intatto e una preparazione efficiente. Pertanto, è stato sviluppato con successo un nuovo approccio per isolare l'intero sistema dei dotti biliari extraepatici nei neonati murini mantenendo l'integrità del dotto biliare.
Abstract
La dissezione dei dotti biliari neonatali murini è stata descritta come difficile. L'obiettivo principale della procedura operativa standard descritta è l'isolamento del dotto biliare extraepatico (EBD) nei neonati di topo senza danneggiare il dotto biliare durante la preparazione. A causa della sua preparazione eccezionalmente stretta rispetto alla linea cellulare dei colangiociti e della raccolta dell'intero sistema dei dotti biliari extraepatici (EBDS), l'approccio descritto è estremamente utile nella ricerca di modelli animali di disturbi del dotto biliare neonatale, come l'atresia biliare. Dopo l'eutanasia, si è acceduto alla cavità peritoneale e il sistema del dotto biliare, il duodeno e il fegato sono stati estratti con l'esclusiva resezione in blocco (EbR). Il campione estratto viene posto su un tappetino di schiuma e l'EBD viene sezionato dalle cellule contaminanti in modo atraumatico senza il necessario contatto. La dissezione dell'intero EBDS è un vantaggio significativo di questo metodo. Bisogna fare attenzione a causa delle piccole dimensioni e della quantità di tessuto del dotto biliare. Usando la tecnica descritta, non vi è alcun danno ai colangiociti. Inoltre, la purezza della tecnica è riproducibile (n = 10). Pertanto, è possibile raccogliere campioni comparabili in modo ottimale. Inoltre, nessun tessuto del dotto biliare viene danneggiato, perché qualsiasi contatto con il sistema del dotto biliare può essere evitato durante la preparazione, lasciando il fluido biliare all'interno della cistifellea. Ancora più importante, durante l'esecuzione della dissezione finale della cistifellea e del dotto biliare, sono stati utilizzati microstrumenti atraumatici solo leggermente laterali del dotto biliare senza schiacciarlo. Questa è la chiave per un campione pulito e intatto, ed essenziale per ulteriori indagini istologiche o l'isolamento dei colangiociti. Per riassumere, l'innovativa tecnica di dissezione descritta consente agli operatori particolarmente inesperti con le attrezzature necessarie di isolare l'EBDS nel modo più pulito possibile.
Introduction
La genesi e la progressione delle colangiopatie come l'atresia biliare, la colangite sclerosante primitiva (PSC) e la colangite biliare primitiva (PBC) sono sconosciute o incomplete 1,2. La limitata comprensione dell'origine e della progressione di tali malattie porta ad una scarsità di opzioni terapeutiche3. L'ostacolo più difficile nello studio dei disturbi del dotto biliare neonatale è acquisire una comprensione molecolare della fisiopatologia. Una delle chiavi essenziali per una migliore comprensione della patologia molecolare è la migliore osservazione possibile del tessuto interessato. Per evitare una ridotta comparabilità e discrepanze tra le ricerche, come l'osservazione della potenziale eziologia virale dell'atresia biliare4, sorge la necessità della migliore preparazione e condivisione possibile delle tecniche di dissezione eseguite. Una preparazione pura del tessuto bersaglio è necessaria per successive indagini microscopiche o colture di cellule di riproduzione e organoidi 3D. Tuttavia, nei disturbi neonatali murini, i campioni di tessuto sono rari e si verificano solo in una piccola quantità a causa delle dimensioni molto ridotte. Per quanto riguarda i disturbi del dotto biliare, sono state descritte difficoltà in una preparazione pulita dei dotti biliari nei neonati murini5. A causa della fase neonatale dello sviluppo, la differenziazione tissutale non è eccessivamente avanzata, il che complica la preparazione e aumenta la difficoltà rispetto alla preparazione di campioni adulti. Pertanto, il gruppo di lavoro operativo ha studiato una nuova strategia per preparare l'EBDS in un modello murino neonatale. Nel presente studio, la tecnica consente una dissezione efficiente di ciascun campione.
Il sistema del dotto biliare è posizionato per via intraperitoneale nell'addome superiore destro, derivante dal fegato. La cistifellea si trova sotto la superficie viscerale del lobo destro del fegato. Il dotto biliare, insieme alla vena porta e all'arteria epatica, è incorporato nel legamento epatoduodenale. Si unisce direttamente al fegato e al duodeno e drena il fluido biliare nel duodeno6. Anatomicamente, il dotto biliare è diviso nei dotti epatici destro e sinistro, nel dotto epatico comune, nel dotto cistico e nel dotto choledochus, che è formato dalla confluenza del dotto cistico e del dotto epatico comune7. Questo alla fine svuota il fluido biliare e la saliva dal dotto pancreatico nel duodeno attraverso l'Ampulla di Vater.
I colangiociti rivestono il dotto biliare intra ed extraepaticamente, dimorando in una nicchia anatomica complicata dove aiutano nella produzione di bile e nell'omeostasi8. Il fluido biliare passa queste cellule epiteliali specializzate in alte concentrazioni ogni giorno. In particolare, il mantenimento dell'ombrello HCO3- è molto importante per la protezione contro la tossicità degli acidi biliari9. I colangiociti sono la prima linea di difesa nel sistema epatobiliare contro, ad esempio, i microrganismi luminali10. L'efficacia di difesa dei colangiociti contro gli assalti tossici può essere indebolita dalla predisposizione genetica. Un sovraccarico tossico provoca danni e distruzione e può quindi portare a colangiopatie. Inoltre, il dotto biliare in via di sviluppo non è completamente capace di tutti i meccanismi di autoprotezione, portando ad una maggiore suscettibilità alle tossine ambientali nei dotti biliari neonatali11.
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Protocol
A seguito dell'approvazione etica (N045/2021), sono stati osservati topi maschi e femmine di topi C57BL/6 neonati fino a 9 giorni di età. Gli animali sono nati e forniti a scopo sperimentale dalla struttura per animali del Centro medico universitario di Amburgo-Eppendorf, Amburgo, Germania. I neonati erano alloggiati in una gabbia insieme ai loro animali genitori. Le condizioni ambientali sono state controllate in temperatura (20-24 °C), 12:12 h ciclo luce-buio e umidità relativa del 40%-70%.
1. Preparazione sperimentale
- Preparare l'attrezzatura necessaria per l'operazione chirurgica, comprese forbici, pinze, ecc. (vedi Tabella dei materiali).
- Posizionare gli strumenti disinfettati e autoclavati su una superficie sterile accanto al tavolo operatorio.
- Eutanasia un topo neonatale di età P9 rapidamente per decapitazione con una forbice operativa. Posizionare il corpo del topo neonatale eutanasia su un campo operatorio sterile. Sezionare gli EBDS in neonati di topo di 9 giorni (fase 5).
NOTA: La procedura di dissezione descritta fornisce a qualsiasi scienziato gli strumenti adeguati per rimuovere l'EBDS da topi neonatali e anziani. Più vecchio è il mouse, più facile è la preparazione.
2. Accesso alla cavità peritoneale
- Afferrare la pelle sopra la posizione della vescica urinaria con una pinza. Incidere un foro di 2 mm di diametro nella pelle usando le forbici, senza danneggiare il peritoneo e le strutture sottostanti. Espandi il taglio fino alla posizione della decapitazione, seguendo la linea ascellare anteriore sinistra. Rimuovere la pelle dal lato sinistro a quello destro con la pinza atraumatica.
- Afferrare il peritoneo che circonda la milza. Sollevalo delicatamente fino a quando il peritoneo assomiglia a una struttura simile a una tenda e taglia un foro di 1 mm di diametro al centro. Aspetta che la "tenda peritoneale" si riempia d'aria. Utilizzare un ingrandimento microscopico 10x per questo e i seguenti passaggi.
- Tagliare il peritoneo in una finestra incorniciata dalle costole inferiori, entrambe le regioni addominali laterali e l'area della vescica inferiore per garantire il pieno accesso al fegato, al sistema dei dotti biliari, allo stomaco, all'intestino tenue e al colon.
NOTA: Per migliorare l'accesso al fegato, è possibile eseguire un'incisione aggiuntiva, rimuovendo le tre costole più basse lasciando intatte il processo xifoideo, il legamento falciforme, il fegato e le strutture del dotto biliare. La vista del fegato è facile da ottenere.
3. Esame della cistifellea e dei dotti biliari
NOTA: assicurarsi di mantenere il campione bagnato regolarmente durante tutti i passaggi successivi.
- Tirare con attenzione il processo xifoideo in posizione cranioventrale per esaminare la cistifellea.
NOTA: La tensione sul legamento falciforme aumenta con questo movimento e la cistifellea attaccata diventa visibile.- Eseguire solo una leggera trazione per evitare la lacerazione incontrollabile del legamento falciforme, che potrebbe portare alla rottura della cistifellea dal sistema dei dotti biliari. Rilasciare l'attrazione del processo xifoideo prima del passaggio successivo.
- Tirare delicatamente verso il basso il duodeno per liberare il sistema del dotto biliare.
NOTA: All'aumentare della tensione sul legamento epatoduodenale, il tessuto del dotto biliare diventa visibile.
4. Resezione in blocco
- Eseguire la mobilitazione in blocco inferiore seguendo i passaggi seguenti.
- Identificare la papilla duodenale, che collega il sistema del dotto biliare al duodeno.
- Tagliare il duodeno a circa 2 cm dal lato laterale destro della papilla.
- Tagliare attraverso l'area pilorica. Assicurarsi che il contenuto dello stomaco sia presente nell'area pilorica tra la posizione di taglio e la papilla duodenale.
NOTA: Questo è un passo importante per la successiva sicurezza dell'orientamento per la corretta posizione delle parti duodenali orali e aborali.
- Eseguire la mobilitazione superiore in blocco.
- Tirare delicatamente il processo xifoideo e ottenere l'accesso al legamento falciforme.
- Eseguire un taglio lungo 1 cm attraverso il legamento falciforme, il più vicino possibile al processo xifoideo, tra la cistifellea e il processo xifoideo. Assicurarsi di non danneggiare la cistifellea.
- Tagliare attraverso le seguenti strutture di collegamento tra il fegato e il torace: esofago, vena cava inferiore, aorta toracica, tutti i legamenti che circondano l'area nuda del fegato e tutte le connessioni tissutali dorsalmente rimanenti.
NOTA: il campione in blocco è completamente sezionato. Contiene il fegato, il sistema dei dotti biliari e il corpo duodenale, che è collegato con la regione pilorica dello stomaco.
5. Dissezione finale della cistifellea e del dotto biliare
- Eseguire la preparazione grossolana seguendo i passaggi seguenti.
- Posizionare il campione in blocco su un tampone di schiuma solitamente utilizzato per la disidratazione. Utilizzare un ingrandimento microscopico 20x e due pinze atraumatiche microchirurgiche con una dimensione massima della punta di 6 mm per questo e i seguenti passaggi.
- Assemblare il campione sul tampone di schiuma. Riorganizzare il campione nella corretta posizione anatomica. Appiattire la parte orale e aborale del duodeno, eseguendo un movimento delicato.
- Inizia il movimento dalla papilla duodenale e continua verso i bordi taglienti usando una pinza atraumatica. Levigare il contenuto polposo bianco dello stomaco, che si verificherà solo nella parte orale del duodeno. Assicurarsi di identificare la parte orale e quella aborale del duodeno per escludere la probabile rotazione del dotto biliare.
- Tagliare via grandi resti di tessuto epatico per iniziare la dissezione del dotto biliare.
- Eseguire l'isolamento finale.
- Premere delicatamente il tessuto epatico rimanente nei pori del tappetino di schiuma. Assicurarsi che i movimenti di raschiatura inizino dal sistema del dotto biliare e portino ai confini del fegato.
- Trasferire il campione in una posizione più pulita sul tappetino di schiuma dopo alcuni movimenti di raschiatura in varie direzioni. Utilizzare il vantaggio di meno tessuto epatico schiacciato sullo sfondo per ottimizzare la vista per la migliore differenziazione possibile tra EBDS e cellule indesiderate. Raschiare il tessuto epatico dal dotto biliare fino a quando non rimane nulla, o il meno possibile, del tessuto epatico.
- Elaborare il legamento epatoduodenale fino a quando rimane l'EBDS isolato. Rimuovere i vasi sanguigni intralegamentosi come l'arteria epatica, la vena porta e piccoli resti. Rimuovere questo filamento delicato, con una leggera trazione e molta cura, sul lato laterale sinistro. Questa fase di dissezione potrebbe essere già iniziata involontariamente o parzialmente completata durante la precedente rimozione del tessuto epatico, che alla fine porta allo stesso risultato.
NOTA: I vasi sanguigni stanno emergendo come un filamento bianco e molto delicato a circa 3-5 mm per via orale della papilla duodenale e si uniscono al legamento epatoduodenale dal lato laterale sinistro, accumulandosi con il dotto biliare alla triade glissoniana. Con il completamento di questo passaggio, il campione finale è completamente isolato. Se c'è bisogno di una registrazione, le immagini possono essere catturate dopo aver organizzato le strutture del dotto biliare nella loro posizione anatomica (Figura 1). Si consiglia di eseguire le ultime fasi di preparazione su un tappetino di schiuma perché il campione non si attaccherà tanto alla superficie del campo operativo. Se i pori sono bagnati, il dotto biliare levita o galleggia. Quando si sposta il campione, non si attaccherà saldamente come con la preparazione sul tessuto operatorio, con conseguente assenza di strappi durante lo spostamento del campione.
6. Preparazione per l'analisi istologica
- Mettere il campione isolato in una soluzione tamponata, in un mezzo speciale o in fissativi contenenti formalina (vedere Tabella dei materiali) il più presto possibile dopo la dissezione.
- Scegli una soluzione di archiviazione adatta in base alle ulteriori fasi di elaborazione pianificate.
ATTENZIONE: Utilizzare fissativi contenenti formalina solo sotto una presa d'aria a causa di tossicità acuta, corrosività e diversi rischi per la salute.
NOTA: Nello studio presentato, i campioni EBDS sono stati inseriti in paraformaldeide, disidratati e incorporati in paraffina. Sono stati conservati a temperatura ambiente e raffreddati prima del sezionamento. In un armadio riscaldante, fette di 2 μm sono state conservate durante la notte e colorate con ematossilina convenzionale ed eosina4 (vedi Tabella dei materiali).
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Representative Results
La figura 1A mostra l'EBDS di un neonato murino, che è stato sezionato con la tecnica descritta. Microscopicamente, non è visibile altro tessuto epatico. Il tessuto epatico è stato rimosso durante le fasi finali di isolamento del protocollo e potrebbe essere facilmente distinto dal tessuto del dotto biliare per quanto riguarda il colore e la consistenza. La Figura 1B mostra il campione isolato rispetto a una scala millimetrica. La lunghezza dell'EBD (misurata dalla cistifellea alla papilla duodenale) è inferiore a 10 mm. Il diametro del delicatissimo Ductus choledochus variava da 0,05-0,2 mm. La figura 2 mostra la colorazione dell'ematossina-eosina di una sezione longitudinale dell'EBDS con un lume aperto. I colangiociti possono essere identificati che circondano il lume come un monostrato e tinto più scuro. La microscopia è stata eseguita utilizzando un ingrandimento 20x. Le figure mostrano che l'utilizzo del protocollo di dissezione descritto consente all'operatore di sezionare microscopicamente l'EBDS vicino ai margini del dotto, anche nei topi neonatali. I campioni sono stati prelevati da neonati murini di 9 giorni.
Figura 1: Dissezione EBDS . (A) Campione finale EBDS di un neonato murino. (1) Cistifellea, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinistro, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Duodeno. Barra di scala = 500 μm. (B) Dimensioni dell'EBDS sezionato rispetto a una scala millimetrica. Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Sezione longitudinale dell'EBDS. La colorazione dell'eossina-eosina mostra EBDS contenente un lume aperto. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Sviluppo del peso di C57BL/6-neonati fino al nono giorno di vita. I neonati venivano pesati fino a due volte al giorno. I dati forniti mostrano il peso degli animali di controllo (n = 5). Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo articolo ha riportato e discusso la creazione e la convalida di un nuovo approccio chirurgico per la rimozione dell'EBDS dei topi neonatali eutanasiatici. I risultati microscopici e istologici rivelano che l'approccio rileva rapidamente le EBD e le seziona vicino ai margini del dotto, anche nei topi neonatali. Per il protocollo descritto sono necessari solo strumenti chirurgici e un microscopio con un ingrandimento 20x. Inoltre, l'approccio consente l'isolamento dell'intero EBDS. La tecnica è altamente efficiente, diretta e semplice da replicare.
Per lo studio delle malattie del dotto biliare come l'atresia biliare, PSC e PBC, è spesso richiesta l'estrazione meccanica dell'intero sistema dei dotti biliari. A causa delle piccole dimensioni, specialmente nei neonati, è difficile sezionare, elaborare e analizzare. L'isolamento delle cellule duttali extraepatiche delle EBD di topo appena nato di 1 giorno è già stato stabilito, tuttavia, il metodo è stato descritto come difficile. Generalmente, gli individui nuovi a questa procedura lottano a causa di sfide tecniche con le tecniche di dissezione e la pulizia dei piccoli dotti biliari5. Pertanto, il gruppo di lavoro operativo ha studiato una nuova strategia per preparare l'EBDS in un modello murino neonatale. Nel presente studio, la tecnica consente una dissezione efficiente di ciascun campione. I neonati sono stati sacrificati a 9 giorni di età e i dotti biliari sono stati raccolti come descritto nel protocollo. Inoltre, la tecnica era applicabile anche nei neonati più giovani. Alcuni individui morirono o dovettero essere sacrificati prima di raggiungere il nono giorno, compresi i neonati di peso inferiore a 2 g (Figura supplementare 1). Gli operatori dovrebbero prendere in considerazione un tempo operativo più lungo a causa della fase di sviluppo neonatale. La differenziazione tissutale non è eccessivamente avanzata, il che complica la preparazione e aumenta la difficoltà rispetto alla preparazione di campioni adulti.
Un ulteriore effetto collaterale per quanto riguarda la difficoltà della preparazione è l'elevata possibilità di cellule indesiderate nel campione, che potrebbe portare alla contaminazione nelle colture cellulari. Al contrario, la nuova tecnica di dissezione consente agli operatori inesperti con le attrezzature necessarie di rimuovere l'EBDS nel modo più pulito possibile. Di conseguenza, è ancora più importante utilizzare il miglior approccio possibile per la dissezione EBD nei topi neonatali. Se utilizzata come indicato nel protocollo, l'attrezzatura atraumatica, accompagnata da un tappetino di schiuma, non danneggerà, o solo leggermente, il dotto biliare. Il tampone di schiuma contrasterà delicatamente i movimenti dell'operatore mentre seziona il tessuto indesiderato, contenente cellule come epatociti e fibroblasti dell'EBD senza danneggiarlo. Infatti, anche la bile può essere preservata. Inoltre, il protocollo descrive l'accesso sicuro al sistema dei dotti biliari a causa della cauta progressione strato dopo strato. Di conseguenza, le anomalie congenite e le aderenze peritoneali saranno visibili prima che qualsiasi tessuto venga danneggiato.
Uno dei principali principi chirurgici durante l'operazione con l'obiettivo di rimuovere (ad esempio, resezione del tumore o colecistectomia in individui viventi) è quello di risparmiare quanto più tessuto sano possibile. L'applicabilità di questo principio deve essere richiesta per l'esecuzione della preparazione chirurgica nei topi eutanasiatici. Per la dissezione EBD, si è deciso di non risparmiare il tessuto epatico ma piuttosto di effettuare un EbR dell'EBDS, del fegato e del corpo duodenale, che si è rivelato un grande vantaggio tecnico e meno difficile rispetto alla rimozione esclusiva dell'EBD dalla cavità addominale. Dopo l'EbR, il campione in blocco è stato trasferito su un tappetino di schiuma per il movimento del tessuto epatico e dei residui contaminanti.
L'uso di tecniche chirurgiche alternative per rimuovere il sistema completo del dotto biliare extraepatico non può essere considerato per la preparazione del topo dopo l'eutanasia. La ragione di ciò è la sequenza dei movimenti operativi; La preparazione dall'alto verso il basso, come suggerisce il nome, inizia nella parte superiore (in questo caso, la cistifellea) e progredisce fino alla giunzione del duodeno e del dotto choledochus. Per iniziare, rimuovere la cistifellea dal tessuto epatico, poi il dotto cistico, e infine il comune epatico e dotto choledochus alla giunzione del duodeno e del dotto choledochus. Questa tecnica di isolamento utilizzata intraoperatoriamente nell'addome dei topi neonatali ha provocato lesioni del dotto biliare o avvolgimento del dotto biliare isolato. L'avvolgimento è stato causato dal fatto che la presa era troppo allentata. È estremamente difficile individuare il dotto biliare dopo l'avvolgimento. Nel tentativo di evitare l'avvolgimento in ulteriori dissezioni, il dotto biliare o il legamento falciforme collegato è stato stretto più saldamente, il che blocca l'avvolgimento indesiderato ma può causare danni cellulari con esiti negativi al successivo esame istologico. Per la dissezione della cistifellea singola, si consiglia la dissezione dall'alto verso il basso.
In una tecnica alternativa, la preparazione dal basso verso l'alto viene eseguita nell'ordine opposto. La preparazione inizia alla giunzione del duodeno e del dotto choledochus. In secondo luogo, il duodeno deve essere tirato verso il basso caudalmente usando una pinza atraumatica con la mano destra, causando un allungamento del legamento epatoduodenale e rivelando così il dotto biliare. Nel frattempo, utilizzare la pinza atraumatica nella mano sinistra per accedere alla borsa omentale e mantenere la tensione sul legamento epatoduodenale. Partendo dal duodeno è possibile una preparazione accurata fino alla confluenza del dotto cistico e del dotto epatico comune. Tuttavia, mentre si seziona ulteriormente il dotto cistico del fegato e la cistifellea, la tensione può accumularsi in un punto, con conseguente strappo e avvolgimento del dotto biliare. Gli esperimenti hanno dimostrato che la preparazione dal basso verso l'alto è consigliata solo per la dissezione del Ductus choledochus nei topi appena nati.
Per riassumere, i preparati top-down e bottom-up hanno dimostrato notevoli inconvenienti nella preparazione dei topi appena nati. Di conseguenza, il nuovo modello è stato sviluppato per ottenere più facilmente la dissezione dell'EBDS completo, che consente di identificare e trasferire le posizioni dei dotti biliari in contesti istologici esaminati successivamente in modo affidabile ed efficiente.
Oltre agli approcci meccanici e chirurgici, la digestione enzimatica è diventata più rilevante nella lavorazione dei tessuti negli ultimi decenni 5,12. Gli enzimi altamente purificati forniscono un'alternativa precisa per colpire strutture specifiche senza danneggiare le cellule selezionate per ulteriori esperimenti.
L'isolamento dei colangiociti extra- e intraepatici è stato stabilito con successo nei topi e nei ratti 5,13,14,15,16. Tuttavia, entrambe le tecniche consentono di isolare singole cellule quando un dotto biliare intatto è critico per alcune tecniche, in particolare gli approcci istologici. Inoltre, anche per gli approcci di coltura cellulare, tutti gli studi pubblicati richiedono una fase di dissezione meccanica prima della digestione enzimatica senza fornire un protocollo dettagliato passo-passo. La dissezione precedente comporta una riduzione della contaminazione della coltura cellulare, dimostrando che la tecnica di dissezione sarà vantaggiosa per approcci istologici e vari approcci sperimentali.
All'inizio, la tecnica potrebbe richiedere un po 'di tempo per l'allenamento. La pratica aumenterà la velocità e il risultato. Gli operatori possono essere certi che semplicemente seguendo l'approccio passo-passo porterà a una facile riproducibilità e a un isolamento accurato.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl e Magdalena Trochimiuk per i loro contributi. Hans Christian Schmidt è stato sostenuto finanziariamente dalla borsa di studio Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Amburgo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
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