Summary
Für die Beobachtung von neonatalen Gallengangsstörungen der Maus sind ein intakter Gallengang und eine effiziente Vorbereitung erforderlich. Daher wurde erfolgreich ein neuer Ansatz zur Isolierung des gesamten extrahepatischen Gallengangsystems bei murinen Neugeborenen unter Beibehaltung der Integrität des Gallengangs entwickelt.
Abstract
Die Dissektion der neonatalen Gallengänge von Mäusen wurde als schwierig beschrieben. Das Hauptziel der beschriebenen Standardarbeitsanweisung ist die Isolierung des extrahepatischen Gallengangs (EBD) bei Mausneugeborenen, ohne den Gallengang während der Präparation zu schädigen. Aufgrund seiner außergewöhnlich engen Präparation im Vergleich zur Cholangiozyten-Zelllinie und der Gewinnung des gesamten extrahepatischen Gallengangssystems (EBDS) ist der beschriebene Ansatz äußerst nützlich bei der Erforschung von Tiermodellen neugeborener Gallengangserkrankungen, wie z.B. der Gallenatresie. Nach der Euthanasie wurde die Peritonealhöhle betreten und Gallengangssystem, Zwölffingerdarm und Leber mit der einzigartigen En-bloc-Resektion (EbR) extrahiert. Die extrahierte Probe wird auf eine Schaumstoffmatte gelegt, und das EBD wird ohne notwendige Berührung atraumatisch von kontaminierenden Zellen seziert. Die Dissektion des gesamten EBDS ist ein wesentlicher Vorteil dieser Methode. Aufgrund der geringen Größe und Menge an Gallengangsgewebe ist Vorsicht geboten. Mit der beschriebenen Technik gibt es keine Schädigung der Cholangiozyten. Weiterhin ist die Reinheit der Technik reproduzierbar (n = 10). So können optimal vergleichbare Proben entnommen werden. Darüber hinaus wird kein Gallengangsgewebe geschädigt, da jeder Kontakt mit dem Gallengangssystem während der Präparation vermieden werden kann und die Gallenflüssigkeit in der Gallenblase verbleibt. Am wichtigsten ist, dass bei der Durchführung der abschließenden Gallenblasen- und Gallengangsdissektion atraumatische Mikroinstrumente nur geringfügig seitlich des Gallengangs verwendet wurden, ohne ihn zu quetschen. Dies ist der Schlüssel zu einer sauberen und intakten Probe und unerlässlich für weitere histologische Untersuchungen oder die Isolierung von Cholangiozyten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beschriebene innovative Dissektionstechnik es besonders unerfahrenen Bedienern ermöglicht, das EBDS möglichst sauber zu isolieren.
Introduction
Die Entstehung und das Fortschreiten von Cholangiopathien wie Gallenatresie, primär sklerosierender Cholangitis (PSC) und primärer biliärer Cholangitis (PBC) sind entweder unbekannt oder unvollständig 1,2. Das begrenzte Verständnis der Entstehung und des Verlaufs dieser Krankheiten führt zu einem Mangel an Therapieoptionen3. Das schwierigste Hindernis bei der Untersuchung neonataler Gallengangserkrankungen ist das molekulare Verständnis der Pathophysiologie. Einer der wesentlichen Schlüssel zum besseren Verständnis der molekularen Pathologie ist die bestmögliche Beobachtung des betroffenen Gewebes. Um eine verminderte Vergleichbarkeit und Diskrepanzen zwischen der Forschung zu vermeiden, wie z.B. die Beobachtung der potenziellen viralen Ätiologie der Gallenatresie4, ergibt sich die Notwendigkeit der bestmöglichen Vorbereitung und des Austauschs der durchgeführten Dissektionstechniken. Eine reine Präparation des Zielgewebes ist für spätere mikroskopische Untersuchungen oder die Züchtung von Zell- und 3D-Organoidkulturen notwendig. Bei neonatalen Erkrankungen der Maus sind Gewebeproben jedoch selten und treten aufgrund der sehr geringen Größe nur in geringer Menge auf. In Bezug auf Gallengangserkrankungen wurden Schwierigkeiten bei einer sauberen Vorbereitung der Gallengänge bei murinen Neugeborenen beschrieben5. Aufgrund des neonatalen Entwicklungsstadiums ist die Gewebedifferenzierung nicht übermäßig fortgeschritten, was die Vorbereitung erschwert und die Schwierigkeit im Vergleich zur Vorbereitung von adulten Proben erhöht. Daher untersuchte die operative Arbeitsgruppe eine neuartige Strategie zur Vorbereitung des EBDS in einem neonatalen Mausmodell. In der vorliegenden Studie ermöglicht die Technik eine effiziente Zerlegung jeder Probe.
Das Gallengangssystem befindet sich intraperitoneal im rechten Oberbauch, der aus der Leber entsteht. Die Gallenblase befindet sich unter der viszeralen Oberfläche des rechten Leberlappens. Der Gallengang ist zusammen mit der Pfortader und der Leberarterie in das Ligamentum hepatoduodenalis eingebettet. Es verbindet die Leber und den Zwölffingerdarm direkt und leitet Gallenflüssigkeit in den Zwölffingerdarm6 ab. Anatomisch ist der Gallengang in die rechten und linken Lebergänge, den gemeinsamen Lebergang, den Zystengang und den Ductus choledochus unterteilt, der durch den Zusammenfluss des zystischen Ganges und des gemeinsamen Lebergangs7 gebildet wird. Dieser entleert schließlich Gallenflüssigkeit und Speichel aus dem Pankreasgang über die Ampulla von Vater in den Zwölffingerdarm.
Cholangiozyten kleiden den Gallengang intra- und extrahepatisch aus und leben in einer komplizierten anatomischen Nische, wo sie die Gallenproduktion und Homöostase unterstützen8. Gallenflüssigkeit passiert diese spezialisierten Epithelzellen täglich in hohen Konzentrationen. Insbesondere die HCO3-Schirmpflege ist sehr wichtig für den Schutz vor Gallensäuretoxizität9. Cholangiozyten sind die erste Verteidigungslinie im hepatobiliären System gegen beispielsweise luminale Mikroorganismen10. Die Abwehrwirksamkeit der Cholangiozyten gegen toxische Angriffe kann durch genetische Veranlagung geschwächt werden. Eine toxische Überlastung verursacht Schäden und Zerstörung und kann daher zu Cholangiopathien führen. Darüber hinaus ist der sich entwickelnde Gallengang nicht vollständig zu allen Selbstschutzmechanismen fähig, was zu einer höheren Anfälligkeit für Umweltgifte in neonatalen Gallengängen führt11.
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Protocol
Nach der ethischen Zulassung (N045/2021) wurden männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse bis zum Alter von 9 Tagen beobachtet. Die Tiere wurden von der Tiereinrichtung des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Deutschland geboren und zu Versuchszwecken zur Verfügung gestellt. Die Neugeborenen wurden zusammen mit ihren Elterntieren in einem Käfig untergebracht. Die Umgebungsbedingungen wurden in Temperatur (20-24 °C), 12:12 h Hell-Dunkel-Zyklus und relativer Luftfeuchtigkeit von 40%-70% kontrolliert.
1. Versuchsvorbereitung
- Bereiten Sie die erforderliche Ausrüstung für den chirurgischen Eingriff vor, einschließlich Schere, Pinzette usw. (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie desinfizierte und autoklavierte Instrumente auf eine sterile Oberfläche neben dem Operationstisch.
- Euthanasieren Sie eine P9-gealterte neonatale Maus schnell durch Enthauptung mit einer Operationsschere. Legen Sie den Körper der euthanasierten Neugeborenenmaus auf ein steriles Operationsfeld. Sezieren Sie die EBDSs bei 9 Tage alten Mausneugeborenen (Schritt 5).
HINWEIS: Das beschriebene Sezierverfahren gibt jedem Wissenschaftler die richtigen Werkzeuge, um das EBDS von neugeborenen und älteren Mäusen zu entfernen. Je älter die Maus, desto einfacher die Vorbereitung.
2. Zugang zur Peritonealhöhle
- Fassen Sie die Haut über der Lage der Harnblase mit einer Pinzette. Schneiden Sie ein Loch mit einem Durchmesser von 2 mm mit einer Schere in die Haut, ohne das Peritoneum und die darunter liegenden Strukturen zu beschädigen. Erweitern Sie den Schnitt bis zur Stelle der Enthauptung, indem Sie der linken vorderen Achsellinie folgen. Entfernen Sie die Haut von links nach rechts mit der schonenden Pinzette.
- Ergreife das Peritoneum, das die Milz umgibt. Heben Sie es vorsichtig an, bis das Peritoneum einer zeltartigen Struktur ähnelt, und schneiden Sie ein Loch von 1 mm Durchmesser in die Mitte. Warten Sie, bis sich das "Peritonealzelt" mit Luft gefüllt hat. Verwenden Sie für diesen und die folgenden Schritte eine 10-fache mikroskopische Vergrößerung.
- Schneiden Sie das Peritoneum in einem Fenster ab, das von den unteren Rippen, beiden seitlichen Bauchregionen und dem unteren Blasenbereich eingerahmt wird, um den vollen Zugang zu Leber, Gallengangssystem, Magen, Dünndarm und Dickkopf zu gewährleisten.
HINWEIS: Um den Zugang zur Leber zu verbessern, kann ein zusätzlicher Schnitt durchgeführt werden, bei dem die drei untersten Rippen entfernt werden, während der Xiphoidfortsatz, das falciforme Band, die Leber und die Gallengangsstrukturen intakt bleiben. Der Blick auf die Leber ist leicht zu erhalten.
3. Untersuchung der Gallenblase und der Gallenwege
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Probe während aller folgenden Schritte regelmäßig nass bleibt.
- Ziehen Sie den Xiphoid-Prozess vorsichtig in eine kranioventrale Position, um die Gallenblase zu untersuchen.
HINWEIS: Die Spannung am falciformen Band nimmt mit dieser Bewegung zu und die angeschlossene Gallenblase wird sichtbar.- Führen Sie nur einen leichten Zug durch, um ein unkontrollierbares Reißen des falciformen Bandes zu vermeiden, das dazu führen könnte, dass die Gallenblase aus dem Gallengangssystem reißt. Lassen Sie den Zug des Xiphoid-Prozesses vor dem nächsten Schritt los.
- Ziehen Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig nach unten, um das Gallengangssystem zu befreien.
HINWEIS: Wenn die Spannung am hepatoduodenalen Band zunimmt, wird das Gallengangsgewebe sichtbar.
4. En-bloc-Resektion
- Führen Sie die untere en-bloc-Mobilisierung durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Identifizieren Sie die Zwölffingerdarmpapille, die das Gallengangssystem mit dem Zwölffingerdarm verbindet.
- Schneiden Sie durch den Zwölffingerdarm etwa 2 cm von der rechten seitlichen Seite der Papille.
- Schneiden Sie durch den Pylorusbereich. Stellen Sie sicher, dass der Mageninhalt im Pylorusbereich zwischen der Schnittstelle und der Zwölffingerdarmpapille vorhanden ist.
HINWEIS: Dies ist ein wichtiger Schritt für die spätere Orientierungssicherheit für die korrekte Lokalisierung von oralen und aboralen Zwölffingerdarmteilen.
- Führen Sie die obere en-bloc-Mobilisierung durch.
- Ziehen Sie vorsichtig am Xiphoidfortsatz und erhalten Sie Zugang zum falciformen Band.
- Führen Sie einen 1 cm langen Schnitt durch das falciforme Band durch, so nah wie möglich am Xiphoidfortsatz, zwischen der Gallenblase und dem Xiphoidfortsatz. Achten Sie darauf, die Gallenblase nicht zu beschädigen.
- Durchschneiden Sie die folgenden Verbindungsstrukturen zwischen Leber und Thorax: Speiseröhre, Vena cava inferior, thorakale Aorta, alle Bänder, die den nackten Bereich der Leber umgeben, und alle dorsal verbleibenden Gewebeverbindungen.
HINWEIS: Die en-bloc-Probe ist vollständig seziert. Es enthält die Leber, das Gallengangssystem und den Zwölffingerdarmkorpus, der mit der Pylorusregion des Magens verbunden ist.
5. Abschließende Gallenblasen- und Gallengangsdissektion
- Führen Sie die grobe Vorbereitung mit den folgenden Schritten durch.
- Legen Sie die en-bloc-Probe auf ein Schaumstoffpolster, das normalerweise zur Dehydratisierung verwendet wird. Verwenden Sie für diesen und die folgenden Schritte eine 20-fache mikroskopische Vergrößerung und zwei mikrochirurgische atraumatische Pinzetten mit einer maximalen Spitzengröße von 6 mm.
- Montieren Sie die Probe auf dem Schaumstoffpolster. Reorganisieren Sie die Probe in der richtigen anatomischen Position. Flachen Sie den oralen und aboralen Teil des Zwölffingerdarms ab und führen Sie eine sanfte Bewegung aus.
- Beginnen Sie die Bewegung an der Zwölffingerdarmpapille und fahren Sie mit einer traumatischen Pinzette zu den Schneidkanten fort. Glätten Sie den weißen breiigen Inhalt des Magens, der nur im oralen Teil des Zwölffingerdarms auftritt. Stellen Sie sicher, dass Sie den oralen und den aboralen Teil des Zwölffingerdarms identifizieren, um eine wahrscheinliche Gallengangsrotation auszuschließen.
- Schneiden Sie große Reste von Lebergewebe weg, um mit der Dissektion des Gallengangs zu beginnen.
- Führen Sie die abschließende Isolierung durch.
- Drücken Sie das restliche Lebergewebe vorsichtig in die Poren der Schaummatte. Stellen Sie sicher, dass die Schabenbewegungen vom Gallengangssystem ausgehen und zu den Lebergrenzen führen.
- Überführen Sie die Probe nach einigen Schabenbewegungen in verschiedene Richtungen in eine sauberere Position auf der Schaummatte. Nutzen Sie den Vorteil von weniger gequetschtem Lebergewebe im Hintergrund, um die Sicht für die bestmögliche Unterscheidung zwischen EBDS und unerwünschten Zellen zu optimieren. Kratzen Sie das Lebergewebe aus dem Gallengang, bis nichts oder so wenig wie möglich vom Lebergewebe übrig bleibt.
- Verarbeiten Sie das hepatoduodenale Band, bis das isolierte EBDS verbleibt. Entfernen Sie intraligamentöse Blutgefäße wie die Leberarterie, die Pfortader und kleine Reste. Entfernen Sie dieses empfindliche Filament mit einem sanften Zug und hoher Sorgfalt auf die linke seitliche Seite. Dieser Dissektionsschritt kann bereits während der vorherigen Entfernung von Lebergewebe unbeabsichtigt oder teilweise abgeschlossen begonnen haben, was letztendlich zum gleichen Ergebnis führt.
HINWEIS: Die Blutgefäße treten als weißes und sehr empfindliches Filament etwa 3-5 mm oral der Zwölffingerdarmpapille auf und verbinden das Hepatoduodenalband von der linken lateralen Seite und sammeln sich mit dem Gallengang zur Glisson-Triade. Nach Abschluss dieses Schritts wird die endgültige Probe vollständig isoliert. Wenn eine Aufzeichnung erforderlich ist, können Bilder aufgenommen werden, nachdem die Gallengangsstrukturen in ihre anatomische Position gebracht wurden (Abbildung 1). Es wird empfohlen, die letzten Vorbereitungsschritte auf einer Schaumstoffmatte durchzuführen, da die Probe nicht so stark an der Oberfläche des Operationsfeldes haftet. Wenn die Poren nass sind, schwebt oder schwimmt der Gallengang. Beim Bewegen der Probe haftet sie nicht so fest wie bei der Vorbereitung auf dem Operationstuch, was zu keinem Reißen beim Bewegen der Probe führt.
6. Vorbereitung für die histologische Analyse
- Die isolierte Probe wird so bald wie möglich nach der Dissektion in eine gepufferte Lösung, ein spezielles Medium oder formalinhaltige Fixiermittel (siehe Materialtabelle) gegeben.
- Wählen Sie eine geeignete Lagerlösung in Abhängigkeit von weiteren geplanten Verarbeitungsschritten.
VORSICHT: Verwenden Sie formalinhaltige Fixiermittel wegen akuter Toxizität, Korrosivität und verschiedener Gesundheitsgefahren nur unter einer Lüftungsöffnung.
HINWEIS: In der vorgestellten Studie wurden die EBDS-Proben in Paraformaldehyd eingefügt, dehydriert und in Paraffin eingebettet. Sie wurden bei Raumtemperatur gelagert und vor dem Schneiden abgekühlt. In einem Wärmeschrank wurden 2 μm Scheiben über Nacht aufbewahrt und mit herkömmlichem Hämatoxylin und Eosin4 gefärbt (siehe Materialtabelle).
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Representative Results
Abbildung 1A zeigt das EBDS eines murinen Neugeborenen, das mit der beschriebenen Technik seziert wurde. Mikroskopisch ist kein weiteres Lebergewebe sichtbar. Das Lebergewebe wurde während der letzten Isolationsschritte des Protokolls entfernt und konnte in Farbe und Konsistenz leicht vom Gallengangsgewebe unterschieden werden. Abbildung 1B zeigt die isolierte Probe im Vergleich zu einer Millimeterskala. Die Länge des EBD (gemessen von der Gallenblase bis zur Zwölffingerdarmpapille) beträgt weniger als 10 mm. Der Durchmesser des sehr empfindlichen Ductus choledochus variierte zwischen 0,05 und 0,2 mm. Abbildung 2 zeigt die Hämatoxylin-Eosin-Färbung eines Längsschnitts des EBDS mit offenem Lumen. Die Cholangiozyten, die das Lumen umgeben, können als Monoschicht identifiziert und dunkler gefärbt werden. Die Mikroskopie wurde mit 20-facher Vergrößerung durchgeführt. Die Zahlen zeigen, dass der Bediener mit dem beschriebenen Dissektionsprotokoll das EBDS in der Nähe der Ränder des Kanals mikroskopisch sezieren kann, auch bei neonatalen Mäusen. Die Proben wurden von 9 Tage alten murinen Neugeborenen genommen.
Abbildung 1: EBDS-Dissektion . (A) Endgültige EBDS-Probe eines murinen Neugeborenen. (1) Gallenblase, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinister, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Zwölffingerdarm. Maßstabsbalken = 500 μm. (B) Größenmaß des zerlegten EBDS im Vergleich zu einer Millimeterskala. Maßstabsbalken = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Längsschnitt des EBDS. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigt EBDS, das ein offenes Lumen enthält. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Gewichtsentwicklung von C57BL/6-Neugeborenen bis zum neunten Lebenstag. Neugeborene wurden bis zu zweimal täglich gewogen. Die bereitgestellten Daten zeigen das Gewicht der Kontrolltiere (n = 5). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Dieser Artikel berichtete und diskutierte die Entwicklung und Validierung eines neuen chirurgischen Ansatzes zur Entfernung des EBDS von euthanasierten Neugeborenenmäusen. Mikroskopische und histologische Befunde zeigen, dass der Ansatz EBDs schnell erkennt und sie in der Nähe der Ränder des Kanals seziert, selbst bei neugeborenen Mäusen. Für das beschriebene Protokoll werden lediglich chirurgische Instrumente und ein Mikroskop mit einer 20-fachen Vergrößerung benötigt. Darüber hinaus ermöglicht der Ansatz die Isolierung des gesamten EBDS. Die Technik ist hocheffizient, unkompliziert und einfach zu replizieren.
Für die Untersuchung von Gallengangserkrankungen wie Gallenatresie, PSC und PBC ist häufig die mechanische Extraktion des gesamten Gallengangssystems erforderlich. Aufgrund der geringen Größe, insbesondere bei Neugeborenen, ist es schwierig zu sezieren, zu verarbeiten und zu analysieren. Die Isolierung von extrahepatischen duktalen Zellen von 1 Tag alten neugeborenen Maus-EBDs wurde bereits etabliert, die Methode wurde jedoch als schwierig beschrieben. Im Allgemeinen kämpfen Personen, die neu in diesem Verfahren sind, aufgrund technischer Herausforderungen mit den Präparationstechniken sowie der Reinigung der kleinen Gallengänge5. Daher untersuchte die operative Arbeitsgruppe eine neuartige Strategie zur Vorbereitung des EBDS in einem neonatalen Mausmodell. In der vorliegenden Studie ermöglicht die Technik eine effiziente Zerlegung jeder Probe. Neugeborene wurden im Alter von 9 Tagen geopfert und Gallenwege wurden wie im Protokoll beschrieben entnommen. Darüber hinaus war die Technik auch bei jüngeren Neugeborenen anwendbar. Einige Individuen starben oder mussten vor Erreichen des neunten Tages geopfert werden, darunter Neugeborene mit einem Gewicht von weniger als 2 g (ergänzende Abbildung 1). Betreiber sollten aufgrund des neonatalen Entwicklungsstadiums eine längere Betriebszeit in Betracht ziehen. Die Gewebedifferenzierung ist nicht übermäßig fortgeschritten, was die Vorbereitung erschwert und die Schwierigkeit im Vergleich zur Vorbereitung von adulten Proben erhöht.
Ein weiterer Nebeneffekt hinsichtlich der Schwierigkeit der Herstellung ist die hohe Wahrscheinlichkeit unerwünschter Zellen in der Probe, die zu einer Kontamination in Zellkulturen führen könnten. Im Gegensatz dazu ermöglicht die neuartige Dissektionstechnik unerfahrenen Bedienern mit der notwendigen Ausrüstung, das EBDS so sauber wie möglich zu entfernen. Daher ist es noch wichtiger, den besten Ansatz für die EBD-Dissektion bei neonatalen Mäusen zu verwenden. Bei Verwendung wie im Protokoll angegeben, wird die atraumatische Ausrüstung, begleitet von einer Schaumstoffmatte, den Gallengang nicht oder nur sehr leicht verletzen. Das Schaumstoffpolster wirkt sanft den Bewegungen des Bedieners entgegen, während es das unerwünschte Gewebe seziert und Zellen wie Hepatozyten und Fibroblasten des EBD enthält, ohne es zu schädigen. In der Tat kann sogar die Galle konserviert werden. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll den sicheren Zugang zum Gallengangssystem durch vorsichtiges Voranschreiten Schicht für Schicht. Infolgedessen werden angeborene Anomalien und peritoneale Adhäsionen sichtbar, bevor Gewebe beschädigt wird.
Ein wichtiges Operationsprinzip bei Operationen mit dem Ziel der Entfernung (z.B. Tumorresektion oder Cholezystektomie bei lebenden Personen) ist es, möglichst viel gesundes Gewebe zu schonen. Die Anwendbarkeit dieses Prinzips muss für die Durchführung der chirurgischen Vorbereitung bei euthanasierten Mäusen beantragt werden. Für die EBD-Dissektion wurde entschieden, das Lebergewebe nicht zu schonen, sondern ein EbR des EBDS-, Leber- und Zwölffingerdarmkorpus durchzuführen, was sich als großer technischer Vorteil erwies und weniger schwierig war, als das EBD ausschließlich aus der Bauchhöhle zu entfernen. Nach dem EbR wurde die en-bloc-Probe auf eine Schaumstoffmatte überführt, um Lebergewebe zu bewegen und Reste zu kontaminieren.
Die Verwendung alternativer chirurgischer Techniken zur Entfernung des gesamten extrahepatischen Gallengangsystems kann für die Mausvorbereitung nach Euthanasie nicht in Betracht gezogen werden. Der Grund dafür ist die Abfolge der Operationsbewegungen; Die Top-Down-Vorbereitung beginnt, wie der Name schon sagt, an der Spitze (in diesem Fall der Gallenblase) und schreitet bis zur Verbindung des Zwölffingerdarms und des Ductus choledochus voran. Entfernen Sie zunächst die Gallenblase aus dem Lebergewebe, dann den Zystengang und schließlich den gemeinsamen Leber- und Ductus Choledochus bis zur Verbindung von Zwölffingerdarm und Ductus Choledochus. Diese Isolationstechnik, die intraoperativ im Abdomen von neonatalen Mäusen angewendet wurde, führte zu Gallengangsverletzungen oder Spiralungen des isolierten Gallengangs. Das Aufwickeln wurde dadurch verursacht, dass der Griff zu locker war. Es ist äußerst schwierig, den Gallengang nach dem Aufwickeln zu lokalisieren. Bei dem Versuch, die Wicklung in weiteren Dissektionen zu vermeiden, wurde der Gallengang oder das damit verbundene falciforme Band fester angezogen, was unerwünschte Wicklungen stoppt, aber zu Zellschäden mit schlechten Ergebnissen bei der anschließenden histologischen Untersuchung führen kann. Für die Dissektion der einzelnen Gallenblase wird eine Top-Down-Dissektion empfohlen.
Bei einer alternativen Technik erfolgt die Bottom-up-Vorbereitung in umgekehrter Reihenfolge. Die Zubereitung beginnt an der Verbindung des Zwölffingerdarms und des Ductus choledochus. Zweitens muss der Zwölffingerdarm mit einer atraumatischen Pinzette mit der rechten Hand kaudal nach unten gezogen werden, wodurch eine Dehnung des hepatoduodenalen Bandes verursacht wird und somit der Gallengang sichtbar wird. Verwenden Sie in der Zwischenzeit die atraumatische Pinzette in der linken Hand, um auf den Schleimbeutel zuzugreifen und die Spannung am hepatoduodenalen Band aufrechtzuerhalten. Beginnend mit dem Zwölffingerdarm ist eine genaue Vorbereitung bis zum Zusammenfluss des zystischen und des gemeinsamen Lebergangs erreichbar. Während des weiteren Sezierens des Zystengangs und der Gallenblase der Leber kann sich jedoch an einem Punkt eine Spannung aufbauen, was dazu führt, dass der Gallengang reißt und sich zusammenrollt. Die Experimente zeigten, dass eine Bottom-up-Vorbereitung nur für die Dissektion des Ductus choledochus bei neugeborenen Mäusen empfohlen wird.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Top-down- und Bottom-up-Präparate signifikante Nachteile bei der Vorbereitung neugeborener Mäuse zeigten. Daher wurde das neue Modell entwickelt, um die Dissektion des kompletten EBDS einfacher zu erreichen, was es ermöglicht, Gallengangsstellen zuverlässig und effizient zu identifizieren und in später untersuchte histologische Zusammenhänge zu übertragen.
Neben mechanischen und chirurgischen Ansätzen hat die enzymatische Verdauung in der Gewebeverarbeitung in den letzten Jahrzehnten an Relevanz gewonnen 5,12. Hochgereinigte Enzyme bieten eine präzise Alternative zu gezielten Strukturen, ohne die für weitere Experimente ausgewählten Zellen zu schädigen.
Die Isolierung von extra- und intrahepatischen Cholangiozyten wurde erfolgreich bei Mäusen und Ratten 5,13,14,15,16 etabliert. Beide Techniken ermöglichen jedoch die Isolierung einzelner Zellen, wenn ein intakter Gallengang für bestimmte Techniken - insbesondere histologische Ansätze - kritisch ist. Darüber hinaus erfordern alle veröffentlichten Studien selbst für Zellkulturansätze einen mechanischen Dissektionsschritt vor dem enzymatischen Aufschluss, ohne ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll bereitzustellen. Die vorangegangene Dissektion führt zu einer Verringerung der Zellkulturkontamination, was beweist, dass die Dissektionstechnik für histologische und verschiedene experimentelle Ansätze von Vorteil ist.
Am Anfang kann die Technik etwas Zeit für das Training benötigen. Das Üben erhöht die Geschwindigkeit und das Ergebnis. Bediener können sicher sein, dass das einfache Befolgen des schrittweisen Ansatzes zu einfacher Reproduzierbarkeit und genauer Isolierung führt.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Die Autoren danken Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl und Magdalena Trochimiuk für ihre Beiträge. Hans Christian Schmidt wurde gefördert durch das iPRIME-Stipendium der Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
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