Summary
本协议描述了一种使用微透析技术实时和动态收集大鼠心脏血液的简单有效的方法。
Abstract
血液成分的动态分析对于了解心血管疾病及其相关疾病,如心肌梗塞、心律失常、动脉粥样硬化、心源性肺水肿、肺栓塞和脑栓塞等具有重要意义。同时,亟待突破活鼠心脏血液采样技术,评价特色民族药物治疗的有效性。在这项研究中,通过精确且无创的外科手术将血液微透析探针植入大鼠的右颈静脉。然后通过连接到在线微透析样本收集系统,以2.87 nL/min至2.98 mL / min的速率收集心脏血液样本。更重要的是,获得的血液样本可以暂时储存在4°C的微透析容器中。 基于微透析的大鼠心脏在线连续采血方案极大地保证了血液样本的质量,推进和激发了全身性心血管疾病研究的科学合理性,并从血液学的角度评价民族医学治疗。
Introduction
随着生活节奏的加快和心理压力的增加,心血管疾病(CVD)多见于青年、中、老年人1,2。心血管疾病的发病率和死亡率高,具有发病急、进展快、病程长等特点,严重影响患者安全3.CVD的发生可能与某些血液成分的变化密切相关,如胆固醇、血脂、血糖、心肌酶、蛋白激酶K4,5,6。通过分析常规血液检查项目,可以最快速地管理患者的相关情况。因此,血液样本的质量决定了测试结果的准确性。然而,传统的采血方法存在一些不可避免的弊端,严重影响实验结果,如创伤面积大、采血量小、对操作人员要求高、无法实时反映药物变化、血样预处理繁琐、实验动物消耗量大、不符合动物伦理要求等7,8,9.随着医疗技术的不断进步,采血质量也提出了更高的要求。因此,迫切需要开发一种新的血液采样技术来克服上述缺点。
微透析是一种基于透析原理的体内采样技术10。在非平衡条件下,待测化合物沿浓度梯度从组织中扩散并灌注到嵌入组织中的微量透析探针中,透析液与透析液一起连续去除,达到从活组织取样的目的11,12。与传统的采样方法相比,微透析技术在以下几个方面具有显著的优势13、14、15:连续实时跟踪血液中各种化合物的变化;取样不需要繁琐的预处理,可以真实地代表取样现场目标化合物的浓度;探针可以植入身体的不同部位,以研究目标化合物的吸收,分布,代谢,排泄和毒性;采集的样品不含生物大分子(>20 kD)。因此,更高质量的血液样本确保了对心血管疾病和民族医学治疗机制的更好解释。
微量透析取样系统通常由微注射泵、连接管、无动物运动罐、微透析探头和样品收集器16组成。作为微透析系统装置中最关键的部分,常见的微透析探头包括同心探头、柔性探头、线性探头和分流探头17。其中,柔性探针是软性和非金属探针,主要用于从清醒和自由移动或麻醉动物的血管和外周组织(如心脏、肌肉、皮肤和脂肪)中采集样品13。当与血管或组织接触时,探头可以灵活弯曲,从而避免对探头或采样部位造成不可逆转的损坏。随着探针技术的不断发展,微透析技术在各个领域的应用也在不断深化。本文通过无创微透析技术通过专为采血设计的柔性探针动态连续获取大鼠心脏血液。
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Protocol
该动物方案已获得成都中医药大学管委会批准(备案号:2021-11)。将指定的无病原体雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(8-10周,260-300g)饲养在独立的通风笼中,将实验室环境保持在22°C和65%相对湿度,并用于本研究。这些动物是从商业来源获得的(见 材料表)。在此期间,所有大鼠均习惯于适应性喂养1周,并有自由水和饮食。
1. 实验准备
- 组装涉及血液采样微透析的设备(见 材料表),如图 1所示。
- 制备抗凝剂柠檬酸盐葡萄糖溶液(ACD),含有3.50 mmol/L柠檬酸盐,7.50 mmol/L柠檬酸钠和13.60 mmol/L葡萄糖,作为微透析采血的灌注液(见 材料表)。
- 使用前,用0.22μm膜过滤装置过滤ACD,并通过超声波去除气泡。将ACD保持在37°C以减少对SD大鼠的刺激。
2. 微透析管道系统的通畅性检查
- 将透析单元探头的入口与注射器针头、管道适配器和 fep 管道连接(参见 材料表)。
注意:微量透析探头的蓝色端用于液体流入,透明端用于流体流出。 - 通过将ACD18 以2μL/min的速度注入管道系统来检查微透析管道系统的通畅性。
注意:如果ACD从样本采集部位流出,则畅通无阻的微透析系统可用于进一步的心脏血液采集。如果没有,则必须检查血液探头是否有破裂的泄漏或管管接头是否密封。
3. 微透析探针植入
- 在0.6L / min的空气 - 氧气混合物中用2%异氟醚麻醉大鼠,将完全失去知觉的大鼠固定在手术台上,并使用动物温度维持剂将体温保持在37°C(见 材料表)。
- 用电动剃须刀从脖子上去除皮毛,并用三轮贝他定和 70% 酒精交替对手术部位进行消毒。将布比卡因(1.5mg / kg)注射到大鼠中。通过沿颈部中线的 1.5 cm 切口对软组织和血管周围筋膜进行钝性解剖,暴露右颈静脉。
注意:实验中使用的所有手术器械和工具都应通过高压灭菌提前灭菌。使用无菌手套和手术窗帘。整个实验操作应在无菌环境中进行。遵循当地动物使用指南进行麻醉和镇痛方案。 - 在心脏远端的右颈静脉使用4-0手术缝合线进行可拆卸的滑结,以暂时阻止血流,并在心脏附近的右颈静脉上切开1.5厘米的切口。
- 将针状导管探针(长度25mm,直径0.7mm,见 材料表)插入大鼠心脏近端的右颈静脉,将血液微透析探针(总探针长度24mm,膜长度10mm)插入导管中,并用眼科钳植入探针沿着导管探针的斜切口19。
- 取下引导导管样式,将探头的半透膜(膜长度 10 mm,膜直径 0.5 mm)完全浸入右颈静脉中。解开心脏远端的可拆卸滑结,恢复右颈静脉的血流。
- 使用4-0手术缝合线将探头与右颈静脉结扎,并将探头尾管皮下穿过颈部后部。具体探头植入步骤见 图2 。
注意:本研究中使用的血液微透析探针的分子截止值为>20 kD。收集的血液样本含有分子量小于20 kD的物质。
4. 微透析取样
- 微透析探针植入一周后,从手术创伤中恢复的大鼠进行微透析采样。将清醒的大鼠放入自由移动的水箱中(参见 材料表),并将探针连接到微透析系统。通过以2μL / min的速率冲洗ACDs来平衡探针透析膜1小时。
- 以2μL / min的流速收集微透析血液样品,并暂时将其保存在4°C分数容器中。
注意:通过在室温下以20,000× g 离心10分钟,可以直接测试获得的血液样品。或者它可以储存在-80°C进行以下测试。收集样本时,重要的是始终观察探头是否脱垂和/或泄漏。
5. 后采样操作
- 用2%异氟醚在空气 - 氧气混合物中以0.6L / min的速度麻醉SD大鼠。
- 解剖以再次确认探头是否位于右颈静脉中。从右颈静脉取出微透析探针,并将其放入超纯水中。
- 最后,通过吸入5%异氟醚对大鼠实施安乐死。
- 将探头连接到管道,并用超纯水以 2 μL/min 的速率冲洗过夜,以完全洗掉管道和探头中的残留盐。
- 取下探头并将其浸泡在超纯水中。储存在4°C以防止探针透析膜收缩。
注意:如果透析液的体积与灌注液的体积不一致,探头可能会被凝固的血液堵塞。探针可以放置在胰蛋白溶液中,直到可见物质从探针膜的尖端剥落。
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Representative Results
本协议允许根据微透析设备中设置的采样参数从有意识的大鼠获得心脏血液。正常的血液样本必须是鲜红色的,而缺氧、潜在血栓或贫血的动物可能呈深紫色或深红色。通过血液微透析技术获得的样品无色、透明、透明,可用于采用高效液相色谱或质谱分析不同疾病的血清标志物以及药物及其代谢产物的血液分布。参数设置和采集的单血量如 表1所示。
图1:血液微透析所需的设备和装置 。 (A)动物麻醉系统。(二)手术器械。(三)手术台。(四)样品采集管。(E)血液微透析探针、导管和注射器针头。(六)显微注射泵。(G) 显微注射注射器。(H)显微透析探针体 外 支架。(一)大鼠自由移动的水箱。(J) 冷藏馏分收集器。(K)来自大鼠的全血样本和微透析辅助血液样本。 请点击此处查看此图的大图。
图2:将血液微透析探针植入大鼠右颈内静脉的示意图。 请点击此处查看此图的大图。
参数 | 价值 |
灌注率 | 2 微升/分钟 |
采样率 | 2 微升/分钟 |
采样温度 | 4°C |
单次采血量 | 12 微升 |
表1:微透析采血系统的设置参数。
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Discussion
心血管疾病是我国临床上常见的慢性病,发病率逐渐增加,发病年龄趋于年轻化,引起大多数患者的关注和恐慌20,21。心血管疾病是世界上导致死亡的主要原因,可诱发脑梗塞等高死亡率疾病,严重威胁患者健康生命22。CVD,包括缺血性心脏病、心肌病、动脉粥样硬化、高血压、中风和心力衰竭,发生在向心脏供血的动脉变窄或变硬时23,24。尽管有许多方法可以诊断心血管疾病,但验血仍然是最方便和最快的。准确、灵敏、快速地测定与心血管疾病相关的早期标志物,可以快速诊断和了解疾病的病理生理状态。因此,心血管疾病患者日益增长的诊断需求需要收集高质量和代表性的血液样本25。动物实验中常用的采血方法包括切尾、尾静脉、内眦、腹主动脉、舌下静脉、颈动脉静脉、斩首、注射器心脏采集和股动脉静脉采血26。常规血液采样是 体内 药物分析最常用的采样方法。然而,由于血液成分复杂,内源性紊乱多,分离纯化过程繁琐乏味,在此过程中存在药物损失和污染的可能性27。除了考虑动物伦理的要求外,组织损伤较大的长期采血也会导致动物死亡并误导指标28的测试结果。同时,高质量和可接受的血液样本对于确保定性和定量检测动物血液中来自民族草药的活性成分的动态变化也起着决定性作用。
本研究使用的微透析取样技术是近20年来发展起来的一种新的活检取样技术,正在逐渐应用于民族草药的药理学研究29。至于血液微透析,它是一种选择性渗透膜,可以从个体动物身上连续获取大量样品而不会损失体液。更值得注意的是,基于微透析的血液采样技术保持了体液的动态平衡,避免了传统采血技术引起的血流量减少的问题,并消除了药物分布对测试结果的影响30,31。值得一提的是,在线微透析的血液采集实现了目标部位32、33处意识动物血药浓度的实时检测,特别适用于深部组织和重要器官的 体内 研究。随着微透析技术应用的日益成熟,新型组织特异性探针的出现逐渐从最初的脑内单个部位的检测发展到肝脏、皮肤/皮瓣、骨骼肌、眼等多个部位,拓展了民族草药在多个组织器官中的药理作用研究33,34.
虽然微透析取样技术与传统取样技术相比有其独特的优势,但它也有其自身的局限性35。首先,微透析不适合所有物质的样品采集,例如检测蛋白质生物大分子和可以不可逆地结合到半透膜上的药物。其次,探针特性、灌注特性和探针植入操作限制了探针的回收和再利用。第三,昂贵的探头和在线组合仪器的高成本在一定程度上限制了微透析技术的使用。综上所述,微透析技术的应用无疑将对民族医学在心血管疾病的探索中发挥巨大的推动作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金(82104533)、中国博士后科学基金(2020M683273)、四川省科技厅(2021YJ0175)和四川省科技计划重点研发项目(2022YFS0438)的支持。同时,作者要感谢TRI-ANGELS D&H TRADING PTE的高级设备工程师Yuncheng Hong先生。Ltd.(新加坡新加坡市),提供微透析技术服务。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
Blood microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
Catheter | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
Citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 251275 | |
Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
Fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
Glucose | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | G8270 | |
Hemostatic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F21020-16 | |
Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
Micro scissors | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | FS221 | |
Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
Microporous filter membrane | Merck Millipore Ltd. | R0DB36622 | |
Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
Operating table | Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd | 30153 | |
Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
Sodium citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 1613859 | |
Sprague Dawley (SD) rats | Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd | SYXK()2019-049 | |
Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
References
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