Summary
Le présent protocole décrit une méthode simple et efficace pour la collecte dynamique et en temps réel du sang de cœur de rat à l’aide de la technique de microdialyse.
Abstract
L’analyse dynamique des composants sanguins est d’une grande importance pour comprendre les maladies cardiovasculaires et leurs maladies connexes, telles que l’infarctus du myocarde, l’arythmie, l’athérosclérose, l’œdème pulmonaire cardiogénique, l’embolie pulmonaire et l’embolie cérébrale. Dans le même temps, il est urgent de percer la technique de prélèvement sanguin cardiaque continu chez les rats vivants afin d’évaluer l’efficacité de la thérapie de médecine ethnique distinctive. Dans cette étude, une sonde de microdialyse sanguine a été implantée dans la veine jugulaire droite de rats lors d’une intervention chirurgicale précise et non invasive. Des échantillons de sang cardiaque ont ensuite été prélevés à un débit de 2,87 nL/min à 2,98 mL/min en se connectant à un système de prélèvement d’échantillons de microdialyse en ligne. Plus important encore, les échantillons de sang acquis peuvent être stockés temporairement dans des récipients de microdialyse à 4 ° C. Le programme de collecte continue de sang en ligne basé sur la microdialyse sur le cœur de rat a grandement garanti la qualité des échantillons de sang, faisant progresser et dynamisant la rationalité scientifique de la recherche sur les maladies cardiovasculaires systémiques et évaluant la thérapie ethnomédicale du point de vue de l’hématologie.
Introduction
Avec l’accélération du rythme de vie et l’augmentation de la pression psychologique, les maladies cardiovasculaires (MCV) ont tendance à survenir chez les jeunes, les personnes d’âge moyen et les personnes âgées 1,2. La morbidité et la mortalité des MCV sont élevées, avec les caractéristiques d’apparition aiguë, de progression rapide et d’évolution longue de la maladie, qui affectent gravement la sécurité des patients3. L’apparition de MCV peut être étroitement liée aux changements dans certains composants sanguins, tels que le cholestérol, les lipides sériques, la glycémie, les enzymes myocardiques et la protéine kinase K 4,5,6. La situation pertinente du patient peut être gérée plus rapidement en analysant les éléments d’examen sanguin de routine. Par conséquent, la qualité des échantillons de sang détermine la précision des résultats des tests. Cependant, les méthodes conventionnelles de prélèvement sanguin présentent des inconvénients inévitables, qui affectent sérieusement les résultats expérimentaux, tels qu’une grande zone de traumatisme, un petit volume de collecte de sang, des exigences élevées pour les opérateurs, l’incapacité de refléter les changements de médicaments en temps réel, un prétraitement fastidieux des échantillons de sang, une consommation importante d’animaux de laboratoire et le non-respect des exigences éthiques animales 7,8,9 . Avec les progrès continus de la technologie médicale, la qualité de la collecte de sang a également mis en avant des exigences plus élevées. Par conséquent, il est urgent de développer une nouvelle technologie de prélèvement sanguin pour surmonter les lacunes ci-dessus.
La microdialyse est une technique d’échantillonnage in vivo basée sur les principes de dialyse10. Dans des conditions de non-équilibre, les composés à mesurer sont diffusés et perfusés du tissu le long du gradient de concentration dans la sonde de microdialyse intégrée dans le tissu dans le dialysat, qui est continuellement éliminée avec le dialysat, atteignant le but d’échantillonnage du tissu vivant11,12. Par rapport aux méthodes d’échantillonnage traditionnelles, la technique de microdialyse présente de splendides avantages dans les aspects suivants13,14,15: suivi continu en temps réel des changements de divers composés dans le sang; l’échantillonnage ne nécessite aucun prétraitement fastidieux et peut réellement représenter la concentration du composé cible sur le site d’échantillonnage; les sondes peuvent être implantées dans différentes parties du corps pour étudier l’absorption, la distribution, le métabolisme, l’excrétion et la toxicité des composés cibles; l’échantillon acquis ne contient pas de macromolécules biologiques (>20 kD). Par conséquent, les échantillons de sang de meilleure qualité assurent une meilleure interprétation des MCV et du mécanisme traité par la médecine ethnique.
Les systèmes d’échantillonnage de microdialyse se composent généralement de pompes de micro-injection, de tubes de raccordement, de réservoirs de mouvement sans animaux, de sondes de microdialyse et de collecteursd’échantillons 16. En tant que partie la plus critique du dispositif du système de microdialyse, les sondes de microdialyse courantes comprennent des sondes concentriques, des sondes flexibles, des sondes linéaires et des sondes de dérivation17. Parmi celles-ci, les sondes flexibles sont des sondes souples et non métalliques, principalement utilisées pour prélever des échantillons dans les vaisseaux sanguins et les tissus périphériques tels que le cœur, les muscles, la peau et la graisse d’animaux éveillés et en mouvement libre ou anesthésiés13. Lorsqu’elle est en contact avec des vaisseaux sanguins ou des tissus, la sonde peut être pliée de manière flexible, évitant ainsi des dommages irréversibles à la sonde ou au site d’échantillonnage. Avec le développement continu de la technologie des sondes, l’application de la technologie de microdialyse dans divers domaines s’approfondit également. Dans cet article, le sang de cœur de rat a été acquis de manière dynamique et continue par la technologie de microdialyse non invasive grâce à la sonde flexible conçue pour la collecte de sang.
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Protocol
Le protocole animal a été approuvé par le Comité administratif de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (Numéro d’enregistrement: 2021-11). Des rats Sprague Dawley mâles (SD) exempts d’agents pathogènes spécifiés (8 à 10 semaines, 260 à 300 g) ont été élevés dans des cages de ventilation indépendantes, maintenant l’environnement de laboratoire à 22 °C et à 65 % d’humidité relative, et ont été utilisés pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Tous les rats ont été habitués à une alimentation adaptative pendant 1 semaine avec de l’eau et un régime gratuits pendant la période.
1. Préparation expérimentale
- Assembler l’équipement utilisé pour la microdialyse ou le prélèvement sanguin (voir le tableau des matières), comme le montre la figure 1.
- Préparer une solution anticoagulante de citrate de dextrose (DCA), contenant 3,50 mmol/L de citrate, 7,50 mmol/L de citrate de sodium et 13,60 mmol/L de glucose, comme liquide de perfusion pour le prélèvement sanguin de microdialyse (voir le tableau des matières).
- Avant utilisation, filtrer les DCA avec une unité de filtration membranaire de 0,22 μm et éliminer les bulles par ultrasons. Maintenir les DCA à 37 °C pour réduire la stimulation chez les rats SD.
2. Inspection par perméabilité du système de tuyauterie de microdialyse
- Fixez l’entrée de la sonde de l’unité de dialyse à l’aide de l’aiguille de la seringue, de l’adaptateur de tubulure et de la tubulure fep (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE: L’extrémité bleue de la sonde de microdialyse est pour l’afflux de liquide, et l’extrémité transparente est pour l’écoulement de liquide. - Vérifiez la perméabilité du système de tuyauterie de microdialyse en perfusant ACDs18 dans le système de tuyauterie à une vitesse de 2 μL/min.
REMARQUE: Si des DCA s’écoulent du site de prélèvement de l’échantillon, le système de microdialyse sans entrave peut être utilisé pour un prélèvement sanguin cardiaque supplémentaire. Si ce n’est pas le cas, la sonde sanguine doit être vérifiée pour détecter les fuites brisées ou si le joint tuyau-tuyau a été scellé.
3. Implantation de sonde de microdialyse
- Anesthésier les rats avec de l’isoflurane à 2 % dans un mélange air-oxygène de 0,6 L/min, fixer les rats complètement inconscients sur la table d’opération et maintenir la température corporelle à 37 °C à l’aide d’un mainteneur de la température animale (voir le tableau des matériaux).
- Retirez la fourrure du cou avec un rasoir électrique et désinfectez le site chirurgical avec trois cycles alternés de bétadine et d’alcool à 70%. Injecter de la bupivacaïne (1,5 mg/kg) au rat. Exposer la veine jugulaire droite par dissection contondante des tissus mous et du fascia périvasculaire à travers une incision de 1,5 cm le long de la ligne médiane du cou.
NOTE: Tous les instruments et outils chirurgicaux utilisés dans l’expérience doivent être stérilisés à l’avance par autoclavage. Utilisez des gants stériles et des champs chirurgicaux. Toute l’opération expérimentale doit être réalisée dans un environnement stérile. Suivez les directives locales d’utilisation des animaux pour l’anesthésie et le régime analgésique. - Faites un slipknot détachable en utilisant une suture chirurgicale 4-0 dans la veine jugulaire droite à l’extrémité distale du cœur pour bloquer temporairement le flux sanguin, et faites une incision de 1,5 cm dans la veine jugulaire droite près du cœur.
- Insérer un stylet de cathéter en forme d’aiguille (longueur 25 mm, diamètre 0,7 mm, voir le tableau des matériaux) dans la veine jugulaire droite vers l’extrémité proximale du cœur du rat, insérer la sonde de microdialyse sanguine (longueur totale de la sonde 24 mm, longueur de la membrane 10 mm) dans un cathéter et implanter la sonde avec une pince ophtalmique le long de l’incision oblique du stylet du cathéter19.
- Retirez le stylet du cathéter guidé et immergez complètement la membrane semi-perméable de la sonde (longueur de la membrane 10 mm, diamètre de la membrane 0,5 mm) dans la veine jugulaire droite. Démêlez le nœud détachable à l’extrémité distale du cœur pour rétablir le flux sanguin dans la veine jugulaire droite.
- Ligature de la sonde avec la veine jugulaire droite à l’aide de sutures chirurgicales 4-0 et enfiler sous-cutanéement le tube de queue de la sonde à l’arrière du cou. Voir la figure 2 pour les étapes spécifiques d’implantation de la sonde.
REMARQUE : La coupure moléculaire par la sonde de microdialyse sanguine utilisée dans cette étude est de >20 kD. Les échantillons de sang prélevés contiennent des substances dont le poids moléculaire est inférieur à 20 kD.
4. Échantillonnage par microdialyse
- Une semaine après l’implantation de la sonde de microdialyse, les rats qui se remettent d’un traumatisme chirurgical subissent un prélèvement de microdialyse. Placez le rat éveillé dans un réservoir en mouvement libre (voir le tableau des matériaux) et connectez la sonde au système de microdialyse. Équilibrer la membrane de dialyse de la sonde en irriguant les DCA à un débit de 2 μL/min pendant 1 h.
- Prélever des échantillons de sang de microdialyse à un débit de 2 μL/min et les conserver temporairement dans un contenant fractionné à 4 °C.
REMARQUE: Les échantillons de sang obtenus peuvent être testés directement par centrifugation à 20 000 x g pendant 10 minutes à température ambiante. Ou il pourrait être conservé à -80 °C pour les tests suivants. Lors du prélèvement d’échantillons, il est important de toujours observer si la sonde prolapsus et/ou fuit.
5. Opération de post-échantillonnage
- Anesthésier les rats SD avec de l’isoflurane à 2 % dans un mélange air-oxygène à 0,6 L/min.
- Disséquer pour confirmer à nouveau que la sonde est dans la veine jugulaire droite. Retirez la sonde de microdialyse de la veine jugulaire droite et mettez-la dans de l’eau ultrapure.
- Enfin, euthanasier les rats par inhalation d’isoflurane à 5%.
- Connectez la sonde au pipeline et rincez pendant la nuit à raison de 2 μL/min avec de l’eau ultrapure pour éliminer complètement le sel résiduel dans le tuyau et la sonde.
- Retirez la sonde et trempez-la dans de l’eau ultrapure. Conserver à 4 °C pour éviter que la membrane de dialyse de la sonde ne se contracte.
REMARQUE: Si le volume de liquide de dialyse est incompatible avec le volume de liquide de perfusion, la sonde peut être bloquée par du sang coagulé. La sonde peut être placée dans la solution protéique pancréatique jusqu’à ce que la substance visible s’écaillette de l’extrémité de la membrane de la sonde.
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Representative Results
Le protocole actuel a permis d’obtenir le sang cardiaque de rats conscients selon les paramètres d’échantillonnage définis dans l’équipement de microdialyse. Les échantillons de sang normaux doivent être rouge vif, tandis que les animaux atteints d’hypoxie, de caillots sanguins potentiels ou de maladie anémique peuvent avoir un violet foncé ou un rouge foncé. Les échantillons obtenus par la technique de microdialyse sanguine sont incolores, clairs et transparents, ce qui peut être utilisé pour analyser les marqueurs sériques de différentes maladies et la distribution sanguine des médicaments et de leurs métabolites en utilisant la chromatographie liquide à haute performance ou la spectrométrie de masse. Les paramètres définis et le volume de sang unique collecté sont indiqués dans le tableau 1.
Figure 1 : Équipement et appareils nécessaires à la microdialyse sanguine. (A) Système d’anesthésie animale. B) Instruments chirurgicaux. (C) Table d’opération. D) Tube de prélèvement d’échantillons. (E) Sonde de microdialyse sanguine, cathéter et aiguille de seringue. F) Pompe à micro-injection. G) Seringue de micro-injection. H) Sonde de microdialyse in vitro. i) Citerne libre pour rats. J) Collecteur de fraction réfrigéré. (K) Échantillon de sang total et échantillon de sang assisté par microdialyse provenant d’un rat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Illustration schématique d’une sonde de microdialyse sanguine implantée dans la veine jugulaire interne droite du rat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Paramètres | Valeur |
| Taux de perfusion | 2 μL/min |
| Taux d’échantillonnage | 2 μL/min |
| Température d’échantillonnage | 4 °C |
| Volume de prélèvement sanguin unique | 12 μL |
Tableau 1 : Définir les paramètres du système de prélèvement sanguin de microdialyse.
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Discussion
Les MCV sont une maladie chronique courante dans les cliniques dont l’incidence augmente progressivement en Chine, et l’âge d’apparition a tendance à être plus jeune, provoquant l’inquiétude et la panique de la plupart des patients20,21. Étant la principale cause de décès dans le monde, les MCV peuvent induire un infarctus cérébral et d’autres maladies à forte mortalité, menaçant gravement la vie saine des patients22. Les MCV, y compris les cardiopathies ischémiques, la cardiomyopathie, l’athérosclérose, l’hypertension artérielle, les accidents vasculaires cérébraux et l’insuffisance cardiaque, surviennent lorsque les artères alimentant le cœur en sang se rétrécissent ou durcissent23,24. Bien que de nombreuses mesures existent pour diagnostiquer les MCV, un test sanguin reste le plus pratique et le plus rapide. La détermination précise, sensible et rapide des marqueurs précoces liés aux MCV permet de diagnostiquer et de comprendre rapidement l’état physiopathologique de la maladie. Par conséquent, les besoins diagnostiques croissants des patients atteints de MCV exigent que l’on prélève des échantillons de sang représentatifs et de haute qualité25. Les méthodes de prélèvement sanguin couramment utilisées dans les expériences sur les animaux englobent la coupe de la queue, la veine de la queue, le canthus interne, l’aorte abdominale, la veine sublinguale, l’artérioveineuse carotidienne, la décapitation, l’acquisition cardiaque à la seringue et le prélèvement sanguin artérioveineux fémoral26. Le prélèvement sanguin conventionnel est la méthode d’échantillonnage la plus couramment utilisée pour l’analyse in vivo des médicaments. Cependant, en raison de la composition sanguine compliquée et de nombreuses perturbations endogènes, le processus de séparation et de purification est cafard et fastidieux, avec la possibilité de perte de médicament et de contamination dans ce processus27. En plus de tenir compte des exigences de l’éthique animale, la collecte de sang à long terme avec des lésions tissulaires plus importantes peut également entraîner la mort de l’animal et induire en erreur les résultats des tests des indicateurs28. Simultanément, des échantillons de sang de haute qualité et acceptables sont également décisifs pour assurer la détection qualitative et quantitative des changements dynamiques dans les ingrédients actifs dérivés de plantes ethniques dans le sang animal.
La technique d’échantillonnage par microdialyse utilisée dans cette étude est une nouvelle technique d’échantillonnage par biopsie développée au cours des 20 dernières années et qui est progressivement appliquée dans les études pharmacologiques de la phytothérapie ethnique29. Quant à la microdialyse sanguine, il s’agit d’une membrane perméable sélective qui peut acquérir en continu de grandes quantités d’échantillons de l’animal individuel sans perdre de liquide corporel. Et plus particulièrement, la technologie de prélèvement sanguin basée sur la microdialyse maintient l’équilibre dynamique des fluides corporels, évite le problème de la réduction du flux sanguin causé par les technologies traditionnelles de collecte de sang et élimine l’influence de la distribution des médicaments sur les résultats des tests30,31. Il convient de mentionner que l’acquisition de sang par microdialyse en ligne permet de détecter en temps réel la concentration de médicaments sanguins chez les animaux conscients aux sites cibles32,33, ce qui est particulièrement adapté à l’étude in vivo des tissus profonds et des organes vitaux. Avec l’application de plus en plus mature de la technologie de microdialyse, l’émergence de nouvelles sondes spécifiques aux tissus s’est progressivement développée de la détection initiale d’un seul site dans le cerveau à plusieurs sites, tels que le foie, le lambeau cutané, les muscles squelettiques et les yeux, ce qui élargit l’étude de l’action pharmacologique des herbes ethniques dans de multiples tissus et organes33, 34.
Bien que la technologie d’échantillonnage par microdialyse présente des avantages uniques par rapport à la technologie d’échantillonnage traditionnelle, elle a également ses propres limites35. Premièrement, la microdialyse ne convient pas au prélèvement d’échantillons de toutes les substances, telles que la détection de biomacromolécules protéiques et de médicaments capables de se lier irréversiblement à des membranes semi-perméables. Deuxièmement, les caractéristiques de la sonde, les propriétés de perfusat et le fonctionnement de l’implantation de la sonde limitent le recyclage et la réutilisation des sondes. Troisièmement, les sondes coûteuses et le coût élevé des instruments combinés en ligne ont limité l’utilisation de la technologie de microdialyse dans une certaine mesure. En conclusion, l’application de la technologie de microdialyse jouera sans aucun doute un rôle énorme dans la promotion de la médecine ethnique dans l’exploration des MCV.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82104533), la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2020M683273), le Département des sciences et de la technologie de la province du Sichuan (2021YJ0175) et le projet de R&D clé du Plan provincial des sciences et technologies du Sichuan (2022YFS0438). En attendant, les auteurs tiennent à remercier M. Yuncheng Hong, ingénieur principal en équipement chez TRI-ANGELS D&H TRADING PTE. LTD. (Singapour, Singapour), pour avoir fourni des services techniques pour les techniques de microdialyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Blood microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 251275 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Glucose | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | G8270 | |
| Hemostatic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F21020-16 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Micro scissors | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | FS221 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Microporous filter membrane | Merck Millipore Ltd. | R0DB36622 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Operating table | Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd | 30153 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Sodium citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 1613859 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd | SYXK( )2019-049 |
|
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
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