Summary
本プロトコルは、マイクロダイアリシス技術を用いたラット心臓血液のリアルタイムかつ動的収集のための簡便かつ効率的な方法を記載する。
Abstract
血液成分の動的分析は、心筋梗塞、不整脈、アテローム性動脈硬化症、心原性肺水腫、肺塞栓症、脳塞栓症などの心血管疾患およびそれらに関連する疾患を理解する上で非常に重要です。同時に、生きたラットにおける連続心臓採血技術を突破して、独特の民族医学療法の有効性を評価することが急務である。この研究では、血液微小透析プローブをラットの右頸静脈に正確かつ非侵襲的な外科的処置で移植しました。次に、オンラインマイクロ透析サンプル収集システムに接続することにより、心臓血液サンプルを2.87 nL /分から2.98 mL / minの速度で収集しました。さらに重要なことに、取得した血液サンプルは、4°Cのマイクロ透析容器に一時的に保存できます。 ラット心臓からの微小透析ベースのオンライン連続採血プログラムは、血液サンプルの品質を大幅に保証し、全身性心血管疾患に関する研究の科学的合理性を進歩および活性化し、血液学の観点から民族医学療法を評価しています。
Introduction
生活のペースの加速と心理的圧力の増加に伴い、心血管疾患(CVD)は若年、中年、高齢者に発生する傾向があります1,2。CVDの罹患率と死亡率は高く、急性発症、急速な進行、および病気の長期経過の特徴があり、患者の安全に深刻な影響を及ぼします3。CVDの発生は、コレステロール、血清脂質、血糖値、心筋酵素、プロテインキナーゼK 4,5,6などの一部の血液成分の変化と密接に関連している可能性があります。患者の関連する状況は、定期的な血液検査項目を分析することによって最も迅速に管理することができます。したがって、血液サンプルの品質が検査結果の精度を決定します。しかし、従来の採血方法には避けられない欠点があり、外傷面積が大きい、採血量が少ない、オペレーターの要件が高い、薬物の変化をリアルタイムで反映できない、血液サンプルの前処理が面倒、実験動物の大量消費、動物の倫理要件を満たさないなど、実験結果に深刻な影響を及ぼします7,8,9.医療技術の継続的な進歩に伴い、採血の質もより高い要件を提唱しています。したがって、上記の欠点を克服するための新しい採血技術の開発が急務です。
マイクロ透析は、透析の原則10に基づくin vivoサンプリング技術です。非平衡条件下では、測定される化合物は、濃度勾配に沿って組織から組織に埋め込まれた微小透析プローブに拡散および灌流され、透析液とともに連続的に除去され、生体組織からサンプリングする目的を達成する11、12。従来のサンプリング方法と比較して、マイクロ透析技術は次の点で素晴らしい利点を持っています13,14,15:血液中のさまざまな化合物の変化の継続的なリアルタイム追跡。サンプリングは面倒な前処理を必要とせず、サンプリングサイトでのターゲット化合物の濃度を真に表すことができます。プローブを体のさまざまな部分に埋め込んで、標的化合物の吸収、分布、代謝、排泄、毒性を調べることができます。取得したサンプルには、生物学的高分子(>20 kD)は含まれていません。したがって、高品質の血液サンプルは、CVDと民族医学によって治療されるメカニズムのより良い解釈を保証します。
マイクロ透析サンプリングシステムは、一般に、マイクロインジェクションポンプ、接続チューブ、動物フリームーブメントタンク、マイクロ透析プローブ、およびサンプルコレクター16で構成されています。微小透析システムの装置の最も重要な部分として、一般的な微小透析プローブは、同心プローブ、可撓性プローブ、リニアプローブ、およびシャントプローブ17を備える。これらのうち、フレキシブルプローブは、ソフトで非金属のプローブであり、主に、覚醒し、自由に動く、または麻酔された動物の血管および心臓、筋肉、皮膚、脂肪などの末梢組織からサンプルを収集するために使用される13。血管または組織と接触すると、プローブを柔軟に曲げることができるため、プローブまたはサンプリング部位への不可逆的な損傷を回避できます。プローブ技術の継続的な発展に伴い、さまざまな分野でのマイクロ透析技術の応用も深まっています。この論文では、採血用に設計された柔軟なプローブを介して、非侵襲的マイクロ透析技術によってラットの心臓血液を動的かつ継続的に取得しました。
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Protocol
動物プロトコルは、成都中医薬大学の管理委員会によって承認されています(記録番号:2021-11)。特定無病原菌雄性Sprague Dawley(SD)ラット(8-10週,260-300g)を独立した換気ケージで飼育し,実験室環境を22°C,相対湿度65%に維持し,本研究に用いた。動物は商業的な供給源から入手した( 材料表を参照)。すべてのラットは、期間中、遊離水と食事で1週間の適応給餌に慣れていました。
1. 実験準備
- 図1に示すように、採血のマイクロダイアリシスに関与する機器を組み立てます(材料の表を参照)。
- 微小透析採血用の灌流液として、3.50 mmol / Lのクエン酸塩、7.50 mmol / Lのクエン酸ナトリウム、および13.60 mmol / Lのグルコースを含む抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液(ACD)を準備します( 材料の表を参照)。
- 使用前に、0.22μmの膜ろ過ユニットでACDをろ過し、超音波で気泡を除去してください。SDラットの刺激を減らすために、ACDを37°Cに保ちます。
2. 微小透析配管システムの開通性検査
- 透析ユニットのプローブの入口をシリンジ針、チューブアダプター、およびfepチューブに取り付けます(材料表を参照)。
注:マイクロダイアリシスプローブの青い端は流体の流入用で、透明な端は流体の流出用です。 - ACDs 18を2μL/minの速度で配管システムに灌流し、微小透析配管システムの開通性を確認します。
注:ACDがサンプル収集サイトから流れる場合、妨げられないマイクロ透析システムを使用して、さらなる心臓採血を行うことができます。そうでない場合は、血液プローブに漏れの破損がないか、パイプとパイプのジョイントが密閉されていないかどうかを確認する必要があります。
3.マイクロダイアリシスプローブの移植
- 0.6 L / minの空気と酸素の混合物に2%イソフルランでラットを麻酔し、完全に意識不明のラットを手術台に固定し、動物の温度維持装置を使用して体温を37°Cに維持します( 材料の表を参照)。
- 電気かみそりで首から毛皮を取り除き、ベタジンと70%アルコールの3ラウンドを交互に投与して手術部位を消毒します。ブピバカイン(1.5 mg / kg)をラットに注射します。.首の正中線に沿って1.5cmの切開を通して軟部組織と血管周囲筋膜を鈍く解剖することによって右頸静脈を露出させる。
注:実験で使用するすべての手術器具とツールは、オートクレーブ滅菌によって事前に滅菌する必要があります。滅菌手袋と外科用ドレープを使用してください。実験操作全体は無菌環境で実施する必要があります。麻酔および鎮痛レジメンについては、地元の動物使用ガイドラインに従ってください。. - 心臓遠位端の右頸静脈に4-0の外科用縫合糸を使用して取り外し可能なスリップノットを作成し、一時的に血流を遮断し、心臓近くの右頸静脈を1.5cm切開します。
- ラット心臓の近位端に向かって右頸静脈に針状のカテーテルスタイレット(長さ25mm、直径0.7mm、 材料表参照)を挿入し、血液微小透析プローブ(プローブ全長24mm、膜長10mm)をカテーテルに挿入し、カテーテルスタイレット19の斜め切開に沿って眼科鉗子をプローブに移植する。
- ガイドカテーテルスタイレットを取り外し、プローブの半透膜(膜長10 mm、膜径0.5 mm)を右頸静脈に完全に浸します。心臓の遠位端にある取り外し可能なスリップノットを解き、右頸静脈の血流を回復させます。
- 4-0の外科用縫合糸を使用してプローブを右頸静脈で結紮し、プローブテールチューブを首の後ろに皮下通します。具体的なプローブ注入手順については 、図2 を参照してください。
注:この研究で使用された血液微小透析プローブによる分子カットオフは>20kDです。採取した血液サンプルには、分子量20kD未満の物質が含まれています。
4. マイクロダイアリシスサンプリング
- 微小透析プローブ移植の1週間後、外科的外傷から回復したラットは微小透析サンプリングを受ける。覚醒しているラットを自由に動くタンクに入れ( 材料の表を参照)、プローブをマイクロ透析システムに接続します。ACDを2 μL/minの速度で1時間灌漑することにより、プローブ透析膜を平衡化します。
- 微量透析血液サンプルを2 μL/minの流量で採取し、4°Cのフラクショナル容器に一時的に保管します。
注:得られた血液サンプルは、室温で10分間20,000 x g で遠心分離することにより、直接テストできます。または、次のテストのために-80°Cで保存することもできます。サンプルを収集するときは、プローブが脱出および/または漏れていないかどうかを常に観察することが重要です。
5. ポストサンプリング操作
- SDラットを空気と酸素の混合物に2%イソフルランを0.6 L /分で麻酔します。.
- プローブが右頸静脈にあることを再確認するために解剖します。微小透析プローブを右頸静脈から取り外し、超純水に入れます。
- 最後に、5%イソフルランを吸入してラットを安楽死させる。
- プローブをパイプラインに接続し、超純水で2 μL/minの速度で一晩すすぎ、パイプとプローブ内の残留塩分を完全に洗い流します。
- プローブを取り外し、超純水に浸します。プローブ透析膜が収縮するのを防ぐために4°Cで保存してください。
注意: 透析液の量が灌流液の量と一致しない場合、プローブは凝固した血液によってブロックされる可能性があります。プローブは、可視物質がプローブ膜の先端から剥がれるまで膵臓タンパク質溶液に入れることができます。
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Representative Results
本プロトコールにより、意識のあるラットから心臓血液を微小透析装置に設定されたサンプリングパラメータに従って得ることができた。正常な血液サンプルは真っ赤でなければなりませんが、低酸素症、潜在的な血栓、または貧血症の動物は濃い紫色または濃い赤を持っている可能性があります。血液マイクロダイアリシス法で得られたサンプルは無色透明透明で、高速液体クロマトグラフィーや質量分析法を用いることで、さまざまな疾患の血清マーカーや薬物や代謝物の血液分布の分析に利用できます。パラメータセットおよび採取した単血の量を 表1に示す。
図1:血液マイクロダイアリシスに必要な機器・装置 。 (A)動物麻酔システム。(B)手術器具。(C)手術台。(D)サンプル収集チューブ。(E)血液微小透析プローブ、カテーテル、および注射針。(F)マイクロインジェクションポンプ。(g)マイクロインジェクションシリンジ。(h)マイクロダイアリシスプローブ インビトロ スタンド。(I)ラット用の自由移動タンク。(J)冷蔵留分コレクター。(k)ラットの全血サンプルおよび微小透析支援血液サンプル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ラットの右内頸静脈に移植した血液微小透析プローブの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| パラメーター | 価値 |
| 灌流率 | 2 μL/分 |
| サンプリングレート | 2 μL/分 |
| サンプリング温度 | 4 °C |
| 単一採血量 | 12 μL |
表1:微小透析採血システムのパラメータを設定します。
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Discussion
CVDは、中国で徐々に発生率が増加している診療所で一般的な慢性疾患であり、発症年齢は若くなる傾向があり、ほとんどの患者の懸念とパニックを引き起こします20,21。世界の主要な死因であるCVDは、脳梗塞やその他の死亡率の高い疾患を誘発し、患者の健康生活を深刻に脅かす可能性があります22。虚血性心疾患、心筋症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、脳卒中、および心不全を含むCVDは、心臓に血液を供給する動脈が狭くなったり硬化したりすると発生します23,24。CVDを診断するための多くの手段が存在しますが、血液検査は依然として最も便利で最速です。CVDに関連する早期マーカーの正確で高感度かつ迅速な決定は、疾患の病態生理学的状態を迅速に診断および理解することができます。したがって、CVD患者の診断ニーズの高まりは、高品質で代表的な血液サンプルを収集することを必要とします25。動物実験で一般的に使用される採血方法には、尾切断、尾静脈、内眼窩、腹部大動脈、舌下静脈、頸動脈動静脈、断頭、注射器心臓獲得、および大腿動静脈採血が含まれます26。従来の採血は、in vivo薬物分析に最も一般的に使用されるサンプリング方法です。しかし、複雑な血液組成と多くの内因性障害のために、分離および精製プロセスはコカマミーで退屈であり、このプロセスでは薬物の損失と汚染の可能性があります27。動物倫理の要件を考慮することに加えて、より大きな組織損傷を伴う長期採血はまた、動物の死につながり、指標28の試験結果を誤解させる可能性があります。同時に、高品質で許容可能な血液サンプルは、動物の血液中の民族ハーブに由来する有効成分の動的変化の定性的および定量的検出を確実にする上でも決定的です。
この研究で使用されたマイクロ透析サンプリング技術は、過去20年間に開発された新しい生検サンプリング技術であり、民族漢方薬の薬理学的研究に徐々に適用されています29。血液微小透析に関しては、体液を失うことなく個々の動物から大量のサンプルを継続的に取得できる選択透過性膜です。さらに注目すべきことに、マイクロダイアリシスベースの採血技術は、体液の動的バランスを維持し、従来の採血技術によって引き起こされる血流低下の問題を回避し、検査結果に対する薬物分布の影響を排除します30,31。オンラインマイクロダイアリシスによる血液取得は、標的部位32,33の意識のある動物の血中薬物濃度のリアルタイム検出を達成し、特に深部組織および重要な臓器のin vivo研究に適していることは言及に値する。マイクロダイアリシス技術のますます成熟した応用に伴い、新しい組織特異的プローブの出現は、脳内の単一の部位の最初の検出から、肝臓、皮膚/皮膚フラップ、骨格筋、眼などの複数の部位に徐々に発展し、複数の組織および器官における民族ハーブの薬理学的作用の調査を拡大しています33。34。
マイクロ透析サンプリング技術には、従来のサンプリング技術と比較して独自の利点がありますが、独自の制限もあります35。第一に、微小透析は、半透膜に不可逆的に結合する可能性のあるタンパク質生体高分子や薬物の検出など、すべての物質のサンプル収集には適していません。第二に、プローブの特性、灌流物の特性、およびプローブ注入操作により、プローブのリサイクルと再利用が制限されます。第三に、高価なプローブとオンライン複合機器の高コストにより、マイクロ透析技術の使用がある程度制限されています。結論として、マイクロ透析技術の応用は、CVDの探索における民族医学の促進において間違いなく大きな役割を果たすでしょう。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(82104533)、中国ポスドク科学基金会(2020M683273)、四川省科学技術局(2021YJ0175)、および四川省科学技術計画の主要研究開発プロジェクト(2022YFS0438)の支援を受けました。一方、著者らは、TRI-ANGELS D&H TRADING PTEのシニア機器エンジニアであるYuncheng Hong氏に感謝の意を表します。LTD.(シンガポール市、シンガポール)、マイクロダイアリシス技術の技術サービスを提供するため。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Blood microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 251275 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Glucose | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | G8270 | |
| Hemostatic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F21020-16 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Micro scissors | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | FS221 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Microporous filter membrane | Merck Millipore Ltd. | R0DB36622 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Operating table | Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd | 30153 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Sodium citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 1613859 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd | SYXK( )2019-049 |
|
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
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