Summary
El presente protocolo describe un método simple y eficiente para la recolección dinámica y en tiempo real de sangre de corazón de rata utilizando la técnica de microdiálisis.
Abstract
El análisis dinámico de los componentes sanguíneos es de gran importancia para comprender las enfermedades cardiovasculares y sus enfermedades relacionadas, como el infarto de miocardio, la arritmia, la aterosclerosis, el edema pulmonar cardiogénico, la embolia pulmonar y la embolia cerebral. Al mismo tiempo, es urgente romper la técnica de muestreo continuo de sangre cardíaca en ratas vivas para evaluar la efectividad de la terapia de medicina étnica distintiva. En este estudio, se implantó una sonda de microdiálisis sanguínea en la vena yugular derecha de ratas en un procedimiento quirúrgico preciso y no invasivo. Luego se recolectaron muestras de sangre cardíaca a una velocidad de 2.87 nL / min a 2.98 ml / min conectándose a un sistema de recolección de muestras de microdiálisis en línea. Aún más trascendental, las muestras de sangre adquiridas pueden almacenarse temporalmente en contenedores de microdiálisis a 4 °C. El programa de recolección continua de sangre en línea basado en microdiálisis de corazón de rata ha garantizado en gran medida la calidad de las muestras de sangre, avanzando y vigorizando la racionalidad científica de la investigación sobre enfermedades cardiovasculares sistémicas y evaluando la terapia de etnomedicina desde la perspectiva de la hematología.
Introduction
Con la aceleración del ritmo de vida y el aumento de la presión psicológica, las enfermedades cardiovasculares (ECV) tienden a ocurrir en personas jóvenes, de mediana edad y ancianos 1,2. La morbilidad y mortalidad de las ECV son altas, con características de inicio agudo, progresión rápida y evolución prolongada de la enfermedad, que afectan seriamente la seguridad de los pacientes3. La aparición de ECV puede estar estrechamente relacionada con los cambios en algunos componentes de la sangre, como el colesterol, los lípidos séricos, la glucosa en sangre, las enzimas miocárdicas y la proteína quinasa K 4,5,6. La situación relevante del paciente se puede manejar más rápidamente mediante el análisis de los elementos de examen de sangre de rutina. Por lo tanto, la calidad de las muestras de sangre determina la precisión de los resultados de la prueba. Sin embargo, los métodos convencionales para la recolección de sangre tienen algunos inconvenientes inevitables, que afectan seriamente los resultados experimentales, como un área de trauma grande, un volumen de recolección de sangre pequeño, altos requisitos para los operadores, incapacidad para reflejar los cambios de medicamentos en tiempo real, pretratamiento engorroso de muestras de sangre, gran consumo de animales de experimentación y falta de cumplimiento de los requisitos éticos de los animales 7,8,9 . Con los continuos avances en la tecnología médica, la calidad de la recolección de sangre también ha presentado requisitos más altos. Por lo tanto, es urgente desarrollar una nueva tecnología de muestreo de sangre para superar las deficiencias anteriores.
La microdiálisis es una técnica de muestreo in vivo basada en los principios de diálisis10. En condiciones de no equilibrio, los compuestos a medir son difundidos y perfundidos desde el tejido a lo largo del gradiente de concentración hacia la sonda de microdiálisis incrustada en el tejido en el dializado, que se elimina continuamente junto con el dializado, logrando el propósito de muestreo del tejido vivo11,12. En comparación con los métodos de muestreo tradicionales, la técnica de microdiálisis tiene espléndidas ventajas en los siguientes aspectos13,14,15: seguimiento continuo en tiempo real de los cambios de diversos compuestos en la sangre; el muestreo no requiere un tedioso procesamiento previo y puede representar verdaderamente la concentración del compuesto objetivo en el lugar de muestreo; Se pueden implantar sondas en diferentes partes del cuerpo para investigar la absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicidad de los compuestos objetivo; la muestra adquirida no contiene macromoléculas biológicas (>20 kD). Por lo tanto, las muestras de sangre de mayor calidad aseguran una mejor interpretación de las ECV y el mecanismo tratado por la medicina étnica.
Los sistemas de muestreo de microdiálisis generalmente consisten en bombas de microinyección, tubos de conexión, tanques de movimiento libre de animales, sondas de microdiálisis y colectores de muestras16. Como la parte más crítica del dispositivo del sistema de microdiálisis, las sondas de microdiálisis comunes comprenden sondas concéntricas, sondas flexibles, sondas lineales y sonda de derivación17. Entre estas, las sondas flexibles son sondas blandas y no metálicas, utilizadas principalmente para recolectar muestras de vasos sanguíneos y tejidos periféricos como corazón, músculo, piel y grasa de animales despiertos y en movimiento libre o anestesiados13. Cuando está en contacto con vasos sanguíneos o tejidos, la sonda se puede doblar de forma flexible, evitando así daños irreversibles en la sonda o en el sitio de muestreo. Con el desarrollo continuo de la tecnología de sonda, la aplicación de la tecnología de microdiálisis en diversos campos también se está profundizando. En este documento, la sangre del corazón de la rata se adquirió de forma dinámica y continua mediante la tecnología de microdiálisis no invasiva a través de la sonda flexible diseñada para la recolección de sangre.
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Protocol
El protocolo animal ha sido aprobado por el Comité Administrativo de la Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu (Número de registro: 2021-11). Las ratas macho Sprague Dawley (SD) libres de patógenos especificados (8-10 semanas, 260-300 g) se criaron en jaulas de ventilación independientes, manteniendo el ambiente de laboratorio a 22 ° C y 65% de humedad relativa, y se utilizaron para el presente estudio. Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Todas las ratas se habituaron a la alimentación adaptativa durante 1 semana con agua y dieta gratis durante el período.
1. Preparación experimental
- Ensamble el equipo involucrado en la microdiálisis de muestras de sangre (ver Tabla de materiales), como se muestra en la Figura 1.
- Prepare una solución anticoagulante de citrato dextrosa (ACD), que contenga 3.50 mmol / L de citrato, 7.50 mmol / L de citrato de sodio y 13.60 mmol / L de glucosa, como el líquido de perfusión para la recolección de sangre de microdiálisis (ver Tabla de materiales).
- Antes de su uso, filtre los ACD con una unidad de filtración de membrana de 0,22 μm y elimine las burbujas por ultrasonido. Mantener los ACD a 37 °C para reducir la estimulación de las ratas SD.
2. Inspección de permeabilidad del sistema de tuberías de microdiálisis
- Acople la entrada de la sonda de la unidad de diálisis con la aguja de la jeringa, el adaptador de tubo y el tubo fep (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: El extremo azul de la sonda de microdiálisis es para la entrada de fluido, y el extremo transparente es para la salida de líquido. - Compruebe la permeabilidad del sistema de tuberías de microdiálisis mediante la perfusión de ACD18 en el sistema de tuberías a una velocidad de 2 μL/min.
NOTA: Si las ACD fluyen desde el sitio de recolección de muestras, el sistema de microdiálisis sin obstáculos se puede usar para la recolección adicional de sangre cardíaca. De lo contrario, se debe revisar la sonda de sangre para detectar fugas rotas o si la junta tubo-tubería estaba sellada.
3. Implantación de sonda de microdiálisis
- Anestesiar a las ratas con isoflurano al 2% en una mezcla aire-oxígeno de 0,6 L/min, sujetar a las ratas completamente inconscientes en la mesa de operaciones y mantener la temperatura corporal a 37 °C utilizando un mantenedor de temperatura animal (ver Tabla de materiales).
- Retire el pelaje del cuello con una afeitadora eléctrica y desinfecte el sitio quirúrgico con tres rondas alternas de betadina y alcohol al 70%. Inyecte bupivacaína (1,5 mg/kg) en la rata. Exponga la vena yugular derecha mediante la disección roma del tejido blando y la fascia perivascular a través de una incisión de 1,5 cm a lo largo de la línea media del cuello.
NOTA: Todos los instrumentos y herramientas quirúrgicas utilizados en el experimento deben esterilizarse por adelantado mediante autoclave. Use guantes estériles y cortinas quirúrgicas. Toda la operación experimental debe llevarse a cabo en un ambiente estéril. Siga las pautas locales de uso de animales para el régimen de anestesia y analgesia. - Haga un nudo deslizante desmontable usando una sutura quirúrgica 4-0 en la vena yugular derecha en el extremo distal del corazón para bloquear temporalmente el flujo sanguíneo y haga una incisión de 1.5 cm en la vena yugular derecha cerca del corazón.
- Inserte un estilete de catéter en forma de aguja (longitud 25 mm, diámetro 0.7 mm, ver Tabla de materiales) en la vena yugular derecha hacia el extremo proximal del corazón de la rata, inserte la sonda de microdiálisis sanguínea (longitud total de la sonda 24 mm, longitud de la membrana 10 mm) en un catéter e implante la sonda con fórceps oftálmicos a lo largo de la incisión oblicua del estilete del catéter19.
- Retire el estilete del catéter guiado y sumerja completamente la membrana semipermeable de la sonda (longitud de la membrana 10 mm, diámetro de la membrana 0,5 mm) en la vena yugular derecha. Desenrede el nudo deslizante desmontable en el extremo distal del corazón para restaurar el flujo sanguíneo en la vena yugular derecha.
- Ligar la sonda con la vena yugular derecha usando suturas quirúrgicas 4-0 y enhebrar subcutáneamente el tubo de cola de la sonda a través de la parte posterior del cuello. Consulte la figura 2 para conocer los pasos específicos de implantación de la sonda.
NOTA: El corte molecular por la sonda de microdiálisis sanguínea utilizada en este estudio es de >20 kD. Las muestras de sangre recogidas contienen sustancias con un peso molecular inferior a 20 kD.
4. Muestreo de microdiálisis
- Una semana después de la implantación de la sonda de microdiálisis, las ratas que se recuperan de un trauma quirúrgico se someten a un muestreo de microdiálisis. Coloque la rata despierta en un tanque de movimiento libre (consulte la Tabla de materiales) y conecte la sonda al sistema de microdiálisis. Equilibrar la membrana de diálisis de la sonda irrigando los ACD con una velocidad de 2 μL/min durante 1 h.
- Recoger muestras de sangre de microdiálisis a un caudal de 2 μL/min y mantenerlas temporalmente en un recipiente fraccionado a 4 °C.
NOTA: Las muestras de sangre obtenidas podrían analizarse directamente centrifugando a 20.000 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. O podría almacenarse a -80 °C para las siguientes pruebas. Al recolectar muestras, es importante observar siempre si la sonda prolapsa y/o se escapa.
5. Operación posterior al muestreo
- Anestesiar a las ratas SD con isoflurano al 2% en una mezcla aire-oxígeno a 0,6 L/min.
- Diseccionar para volver a confirmar que la sonda está en la vena yugular derecha. Retire la sonda de microdiálisis de la vena yugular derecha y colóquela en agua ultrapura.
- Finalmente, eutanasia a las ratas por inhalación de isoflurano al 5%.
- Conecte la sonda a la tubería y enjuague durante la noche a una velocidad de 2 μL / min con agua ultrapura para eliminar completamente la sal residual en la tubería y la sonda.
- Retire la sonda y sumérjala en agua ultrapura. Conservar a 4 °C para evitar que la membrana de diálisis de la sonda se contraiga.
NOTA: Si el volumen de líquido de diálisis es inconsistente con el volumen de líquido de perfusión, la sonda puede estar bloqueada por sangre coagulada. La sonda se puede colocar en la solución de proteína pancreática hasta que la sustancia visible se desprenda de la punta de la membrana de la sonda.
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Representative Results
El presente protocolo permitió obtener la sangre cardíaca de ratas conscientes de acuerdo con los parámetros de muestreo establecidos en el equipo de microdiálisis. Las muestras de sangre normales deben ser de color rojo brillante, mientras que los animales con hipoxia, coágulos sanguíneos potenciales o enfermedad anémica pueden tener púrpura oscuro o rojo oscuro. Las muestras obtenidas mediante la técnica de microdiálisis sanguínea son incoloras, transparentes y transparentes, que pueden utilizarse para analizar los marcadores séricos de diferentes enfermedades y la distribución sanguínea de fármacos y sus metabolitos mediante el empleo de cromatografía líquida de alta resolución o espectrometría de masas. Los parámetros establecidos y el volumen de sangre única recogida se muestran en la Tabla 1.
Figura 1: Equipo y aparato necesario en la microdiálisis sanguínea . (A) Sistema de anestesia animal. (B) Instrumentos quirúrgicos. (C) Mesa de operaciones. (D) Tubo de recolección de muestras. (E) Sonda de microdiálisis de sangre, catéter y aguja de jeringa. (F) Bomba de microinyección. (G) Jeringa para microinyección. (H) Sonda de microdiálisis in vitro stand. (I) Tanque de movimiento libre para ratas. (J) Colector de fracciones refrigeradas. (K) Muestra de sangre completa y muestra de sangre asistida por microdiálisis de rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ilustración esquemática de la sonda de microdiálisis sanguínea implantada en la vena yugular interna derecha de una rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Parámetros | Valor |
| Tasa de perfusión | 2 μL/min |
| Frecuencia de muestreo | 2 μL/min |
| Temperatura de muestreo | 4 °C |
| Volumen de recolección de sangre única | 12 μL |
Tabla 1: Establecer parámetros del sistema de muestreo de sangre de microdiálisis.
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Discussion
Las ECV son una enfermedad crónica común en las clínicas con una incidencia gradualmente creciente en China, y la edad de inicio tiende a ser más joven, causando la preocupación y el pánico de la mayoría de los pacientes20,21. Siendo la primera causa de muerte en el mundo, las ECV pueden inducir infarto cerebral y otras enfermedades de alta mortalidad, amenazando seriamente la vida saludable de los pacientes22. Las ECV, incluyendo cardiopatía isquémica, miocardiopatía, aterosclerosis, presión arterial alta, accidente cerebrovascular e insuficiencia cardíaca, ocurren cuando las arterias que suministran sangre al corazón se estrechan o endurecen23,24. Aunque existen muchas medidas para diagnosticar las ECV, un análisis de sangre sigue siendo el más conveniente y rápido. Con precisión, la determinación sensible y rápida de los marcadores tempranos relacionados con las ECV puede diagnosticar y comprender rápidamente el estado fisiopatológico de la enfermedad. Por lo tanto, las crecientes necesidades diagnósticas de los pacientes con ECV requieren recolectar muestras de sangre representativas y de alta calidad25. Los métodos de recolección de sangre comúnmente utilizados en experimentos con animales abarcan corte de cola, vena de cola, canto interno, aorta abdominal, vena sublingual, arteriovenosa carotídea, decapitación, adquisición cardíaca de jeringa y muestreo de sangre arteriovenosa femoral26. El muestreo de sangre convencional es el método de muestreo más utilizado para el análisis de fármacos in vivo. Sin embargo, debido a la complicada composición sanguínea y a muchas alteraciones endógenas, el proceso de separación y purificación es ridículo y tedioso, con la posibilidad de pérdida de drogas y contaminación en este proceso27. Además de considerar los requisitos de la ética animal, la recolección de sangre a largo plazo con mayor daño tisular también puede conducir a la muerte del animal y engañar los resultados de las pruebas de los indicadores28. Al mismo tiempo, las muestras de sangre de alta calidad y aceptables también son decisivas para garantizar la detección cualitativa y cuantitativa de cambios dinámicos en los ingredientes activos derivados de hierbas étnicas en la sangre animal.
La técnica de muestreo de microdiálisis utilizada en este estudio es una nueva técnica de muestreo de biopsia desarrollada en los últimos 20 años y que se está aplicando gradualmente en los estudios farmacológicos de la fitoterapia étnica29. En cuanto a la microdiálisis sanguínea, es una membrana permeable selectiva que puede adquirir continuamente grandes cantidades de muestras del animal individual sin perder líquido corporal. Y más notablemente, la tecnología de muestreo de sangre basada en microdiálisis mantiene el equilibrio dinámico de los fluidos corporales, evita el problema de la reducción del flujo sanguíneo causado por las tecnologías tradicionales de recolección de sangre y elimina la influencia de la distribución de medicamentos en los resultados de las pruebas30,31. Cabe mencionar que la adquisición de sangre por microdiálisis en línea logra la detección en tiempo real de la concentración de fármaco en sangre en animales conscientes en los sitios objetivo32,33, lo que es especialmente adecuado para el estudio in vivo de tejidos profundos y órganos vitales. Con la aplicación cada vez más madura de la tecnología de microdiálisis, la aparición de nuevas sondas específicas de tejido se ha desarrollado gradualmente desde la detección inicial de un solo sitio en el cerebro hasta múltiples sitios, como el hígado, la piel / colgajo de piel, el músculo esquelético y el ojo, lo que amplía la investigación de la acción farmacológica de las hierbas étnicas en múltiples tejidos y órganos33, 34.
Aunque la tecnología de muestreo de microdiálisis tiene sus ventajas únicas en comparación con la tecnología de muestreo tradicional, también tiene sus propias limitaciones35. En primer lugar, la microdiálisis no es adecuada para la recolección de muestras de todas las sustancias, como la detección de biomacromoléculas de proteínas y medicamentos que pueden unirse irreversiblemente a membranas semipermeables. En segundo lugar, las características de la sonda, las propiedades de perfusión y la operación de implantación de la sonda limitan el reciclaje y la reutilización de las sondas. En tercer lugar, las costosas sondas y el alto costo de los instrumentos combinados en línea han limitado el uso de la tecnología de microdiálisis hasta cierto punto. En conclusión, la aplicación de la tecnología de microdiálisis sin duda jugará un papel muy importante en la promoción de la medicina étnica en la exploración de las ECV.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82104533), la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2020M683273), el Departamento de Ciencia y Tecnología de la provincia de Sichuan (2021YJ0175) y el proyecto clave de investigación y desarrollo del Plan Provincial de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2022YFS0438). Mientras tanto, los autores desean agradecer al Sr. Yuncheng Hong, ingeniero senior de equipos de TRI-ANGELS D&H TRADING PTE. LTD. (ciudad de Singapur, Singapur), por la prestación de servicios técnicos para técnicas de microdiálisis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Blood microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 251275 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Glucose | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | G8270 | |
| Hemostatic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F21020-16 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Micro scissors | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | FS221 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Microporous filter membrane | Merck Millipore Ltd. | R0DB36622 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Operating table | Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd | 30153 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Sodium citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 1613859 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd | SYXK( )2019-049 |
|
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
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