Summary
Il presente protocollo descrive un metodo semplice ed efficace per la raccolta dinamica e in tempo reale del sangue del cuore di ratto utilizzando la tecnica della microdialisi.
Abstract
L'analisi dinamica dei componenti del sangue è di grande importanza per comprendere le malattie cardiovascolari e le loro malattie correlate, come l'infarto miocardico, l'aritmia, l'aterosclerosi, l'edema polmonare cardiogeno, l'embolia polmonare e l'embolia cerebrale. Allo stesso tempo, è urgente superare la tecnica di campionamento continuo del sangue cardiaco nei ratti vivi per valutare l'efficacia della terapia di medicina etnica distintiva. In questo studio, una sonda di microdialisi del sangue è stata impiantata nella vena giugulare destra dei ratti in una procedura chirurgica precisa e non invasiva. I campioni di sangue cardiaco sono stati quindi raccolti a una velocità compresa tra 2,87 nL / min e 2,98 ml / min collegandosi a un sistema di raccolta di campioni di microdialisi online. Ancora più importante, i campioni di sangue acquisiti possono essere temporaneamente conservati in contenitori di microdialisi a 4 °C. Il programma di raccolta continua del sangue online basato sulla microdialisi dal cuore di ratto ha notevolmente garantito la qualità dei campioni di sangue, facendo progredire e rinvigorire la razionalità scientifica della ricerca sulle malattie cardiovascolari sistemiche e valutando la terapia etnomedica dal punto di vista dell'ematologia.
Introduction
Con l'accelerazione del ritmo di vita e l'aumento della pressione psicologica, le malattie cardiovascolari (CVD) tendono a verificarsi nelle persone giovani, di mezza età e anziane 1,2. La morbilità e la mortalità delle CVD sono elevate, con le caratteristiche di insorgenza acuta, rapida progressione e un lungo decorso della malattia, che influiscono seriamente sulla sicurezza dei pazienti3. L'insorgenza di CVD può essere strettamente correlata ai cambiamenti in alcuni componenti del sangue, come colesterolo, lipidi sierici, glicemia, enzimi miocardici e protein chinasi K 4,5,6. La situazione rilevante del paziente può essere gestita più rapidamente analizzando gli elementi di esame del sangue di routine. Quindi, la qualità dei campioni di sangue determina l'accuratezza dei risultati del test. Tuttavia, i metodi convenzionali per la raccolta del sangue presentano alcuni inevitabili inconvenienti, che influiscono seriamente sui risultati sperimentali, come l'ampia area traumatizzata, il piccolo volume di raccolta del sangue, gli elevati requisiti per gli operatori, l'incapacità di riflettere i cambiamenti del farmaco in tempo reale, il pretrattamento ingombrante del campione di sangue, il grande consumo di animali da esperimento e il mancato rispetto dei requisiti etici degli animali 7,8,9 . Con i continui progressi della tecnologia medica, anche la qualità della raccolta del sangue ha avanzato requisiti più elevati. Pertanto, è urgente sviluppare una nuova tecnologia di prelievo del sangue per superare le carenze di cui sopra.
La microdialisi è una tecnica di campionamento in vivo basata sui principi della dialisi10. In condizioni di non equilibrio, i composti da misurare sono diffusi e perfusi dal tessuto lungo il gradiente di concentrazione nella sonda di microdialisi incorporata nel tessuto nel dializzato, che viene continuamente rimosso insieme al dializzato, raggiungendo lo scopo di campionamento dal tessuto vivente11,12. Rispetto ai metodi di campionamento tradizionali, la tecnica di microdialisi presenta splendidi vantaggi nei seguenti aspetti13,14,15: monitoraggio continuo in tempo reale delle variazioni dei vari composti nel sangue; il campionamento non richiede noiose operazioni preliminari e può rappresentare realmente la concentrazione del composto bersaglio nel sito di campionamento; le sonde possono essere impiantate in diverse parti del corpo per studiare l'assorbimento, la distribuzione, il metabolismo, l'escrezione e la tossicità dei composti bersaglio; il campione acquisito non contiene macromolecole biologiche (>20 kD). Pertanto, i campioni di sangue di qualità superiore garantiscono una migliore interpretazione delle CVD e del meccanismo trattato dalla medicina etnica.
I sistemi di campionamento per microdialisi sono generalmente costituiti da pompe di microiniezione, tubi di collegamento, vasche di movimentazione prive di animali, sonde di microdialisi e collettori di campioni16. Come parte più critica del dispositivo del sistema di microdialisi, le comuni sonde di microdialisi comprendono sonde concentriche, sonde flessibili, sonde lineari e sonda shunt17. Tra queste, le sonde flessibili sono sonde morbide e non metalliche, utilizzate principalmente per raccogliere campioni da vasi sanguigni e tessuti periferici come cuore, muscoli, pelle e grasso di animali svegli e liberamente in movimento o anestetizzati13. A contatto con vasi sanguigni o tessuti, la sonda può essere piegata in modo flessibile, evitando così danni irreversibili alla sonda o al sito di campionamento. Con il continuo sviluppo della tecnologia delle sonde, anche l'applicazione della tecnologia di microdialisi in vari campi si sta approfondendo. In questo articolo, il sangue del cuore di ratto è stato acquisito dinamicamente e continuamente dalla tecnologia di microdialisi non invasiva attraverso la sonda flessibile progettata per la raccolta del sangue.
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Protocol
Il protocollo sugli animali è stato approvato dal Comitato amministrativo dell'Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu (numero di registrazione: 2021-11). I ratti maschi specifici di Sprague Dawley (SD) privi di agenti patogeni (8-10 settimane, 260-300 g) sono stati allevati in gabbie di ventilazione indipendenti, mantenendo l'ambiente di laboratorio a 22 °C e al 65% di umidità relativa, e sono stati utilizzati per il presente studio. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). Tutti i ratti erano abituati all'alimentazione adattiva per 1 settimana con acqua e dieta gratuite durante il periodo.
1. Preparazione sperimentale
- Assemblare l'apparecchiatura coinvolta nella microdialisi del prelievo di sangue (vedere Tabella dei materiali), come mostrato nella Figura 1.
- Preparare la soluzione di destrosio citrato anticoagulante (ACD), contenente 3,50 mmol/L di citrato, 7,50 mmol/L di citrato di sodio e 13,60 mmol/L di glucosio, come liquido di perfusione per la raccolta del sangue in microdialisi (vedere Tabella dei materiali).
- Prima dell'uso, filtrare gli ACD con un'unità di filtrazione a membrana da 0,22 μm e rimuovere le bolle ad ultrasuoni. Mantenere gli ACD a 37 °C per ridurre la stimolazione per i ratti SD.
2. Ispezione della pervietà del sistema di tubazioni di microdialisi
- Collegare l'ingresso della sonda dell'unità di dialisi con l'ago della siringa, l'adattatore per tubi e il tubo fep (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: L'estremità blu della sonda di microdialisi è per l'afflusso di fluido e l'estremità trasparente è per il deflusso del fluido. - Controllare la pervietà del sistema di tubazioni in microdialisi perfondendo ACD18 nel sistema di tubazioni ad una velocità di 2 μL/min.
NOTA: Se gli ACD fluiscono dal sito di raccolta dei campioni, il sistema di microdialisi senza ostacoli può essere utilizzato per un'ulteriore raccolta di sangue cardiaco. In caso contrario, la sonda del sangue deve essere controllata per verificare la presenza di perdite rotte o se il giunto tubo-tubo è stato sigillato.
3. Impianto della sonda di microdialisi
- Anestetizzare i ratti con isoflurano al 2% in una miscela aria-ossigeno di 0,6 L/min, fissare i ratti completamente incoscienti sul tavolo operatorio e mantenere la temperatura corporea a 37 °C utilizzando un mantenitore della temperatura animale (vedi Tabella dei materiali).
- Rimuovere la pelliccia dal collo con un rasoio elettrico e disinfettare il sito chirurgico con tre cicli alternati di betadine e alcol al 70%. Iniettare bupivacaina (1,5 mg/kg) nel ratto. Esporre la vena giugulare destra mediante dissezione smussata dei tessuti molli e della fascia perivascolare attraverso un'incisione di 1,5 cm lungo la linea mediana del collo.
NOTA: Tutti gli strumenti chirurgici e gli strumenti utilizzati nell'esperimento devono essere sterilizzati in anticipo mediante autoclave. Utilizzare guanti sterili e teli chirurgici. L'intera operazione sperimentale deve essere eseguita in un ambiente sterile. Seguire le linee guida locali sull'uso degli animali per l'anestesia e il regime di analgesia. - Fai un nodo staccabile usando una sutura chirurgica 4-0 nella vena giugulare destra all'estremità distale del cuore per bloccare temporaneamente il flusso sanguigno e fai un'incisione di 1,5 cm nella vena giugulare destra vicino al cuore.
- Inserire uno stiletto per catetere a forma di ago (lunghezza 25 mm, diametro 0,7 mm, vedere Tabella dei materiali) nella vena giugulare destra verso l'estremità prossimale del cuore di ratto, inserire la sonda di microdialisi del sangue (lunghezza totale della sonda 24 mm, lunghezza della membrana 10 mm) in un catetere e impiantare la sonda con una pinza oftalmica lungo l'incisione obliqua dello stiletto del catetere19.
- Rimuovere lo stiletto del catetere guidato e immergere completamente la membrana semipermeabile della sonda (lunghezza della membrana 10 mm, diametro della membrana 0,5 mm) nella vena giugulare destra. Sbroglia il nodo staccabile all'estremità distale del cuore per ripristinare il flusso sanguigno nella vena giugulare destra.
- Legare la sonda con la vena giugulare destra utilizzando suture chirurgiche 4-0 e infilare sottocutaneamente il tubo coda della sonda attraverso la parte posteriore del collo. Vedere la Figura 2 per le fasi specifiche di impianto della sonda.
NOTA: Il cut-off molecolare della sonda di microdialisi del sangue utilizzata in questo studio è di >20 kD. I campioni di sangue raccolti contengono sostanze con un peso molecolare inferiore a 20 kD.
4. Campionamento in microdialisi
- Una settimana dopo l'impianto della sonda di microdialisi, i ratti che si stanno riprendendo da un trauma chirurgico vengono sottoposti a campionamento di microdialisi. Posizionare il ratto sveglio in un serbatoio a movimento libero (vedere Tabella dei materiali) e collegare la sonda al sistema di microdialisi. Equilibrare la membrana di dialisi della sonda irrigando ACD con una velocità di 2 μL/min per 1 ora.
- Raccogliere campioni di sangue in microdialisi ad una velocità di flusso di 2 μL/min e conservarli temporaneamente in un contenitore frazionato a 4 °C.
NOTA: I campioni di sangue ottenuti potrebbero essere testati direttamente centrifugando a 20.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Oppure potrebbe essere conservato a -80 °C per i test successivi. Quando si raccolgono campioni, è sempre importante osservare se la sonda prolasso e / o fuoriesce.
5. Operazione post-campionamento
- Anestetizzare i ratti SD con isoflurano al 2% in una miscela aria-ossigeno a 0,6 L/min.
- Sezionare per riconfermare che la sonda è nella vena giugulare destra. Rimuovere la sonda di microdialisi dalla vena giugulare destra e metterla in acqua ultrapura.
- Infine, eutanasia i ratti per inalazione di isoflurano al 5%.
- Collegare la sonda alla tubazione e risciacquare per una notte a una velocità di 2 μL/min con acqua ultrapura per lavare completamente il sale residuo nel tubo e nella sonda.
- Rimuovere la sonda e immergerla in acqua ultrapura. Conservare a 4 °C per evitare che la membrana di dialisi della sonda si contragga.
NOTA: Se il volume del liquido di dialisi è incoerente con il volume del liquido di perfusione, la sonda può essere bloccata dal sangue coagulato. La sonda può essere posizionata nella soluzione proteica pancreatica fino a quando la sostanza visibile si sfalda dalla punta della membrana della sonda.
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Representative Results
Il presente protocollo ha permesso di ottenere il sangue cardiaco da ratti coscienti secondo i parametri di campionamento impostati nell'apparecchiatura di microdialisi. I campioni di sangue normali devono essere rosso vivo, mentre gli animali con ipossia, potenziali coaguli di sangue o malattie anemiche possono avere viola scuro o rosso scuro. I campioni ottenuti attraverso la tecnica di microdialisi del sangue sono incolori, chiari e trasparenti, che possono essere utilizzati per analizzare i marcatori sierici di diverse malattie e la distribuzione del sangue dei farmaci e dei loro metaboliti utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni o spettrometria di massa. I parametri impostati e il volume di singolo sangue raccolto sono mostrati nella Tabella 1.
Figura 1: Attrezzature e apparecchiature necessarie per la microdialisi del sangue . (A) Sistema di anestesia animale. (B) Strumenti chirurgici. (C) Tabella operatoria. (D) Provetta per la raccolta dei campioni. (E) Sonda di microdialisi del sangue, catetere e ago della siringa. (F) Pompa di microiniezione. (G) Siringa per microiniezione. (H) Sonda di microdialisi in vitro . (I) Serbatoio a movimento libero per ratti. (J) Collettore di frazioni refrigerate. (K) Campione di sangue intero e campione di sangue di ratto assistito da microdialisi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Illustrazione schematica della sonda di microdialisi del sangue impiantata nella vena giugulare interna destra del ratto. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Parametri | Valore |
| Velocità di perfusione | 2 μL/min |
| Frequenza di campionamento | 2 μL/min |
| Temperatura di campionamento | 4 °C |
| Volume di raccolta del sangue singolo | 12 μL |
Tabella 1: Impostare i parametri del sistema di prelievo del sangue in microdialisi.
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Discussion
Le CVD sono una malattia cronica comune nelle cliniche con incidenza gradualmente crescente in Cina, e l'età di esordio tende ad essere più giovane, causando la preoccupazione e il panico della maggior parte dei pazienti20,21. Essendo la principale causa di morte nel mondo, le malattie cardiovascolari possono indurre infarto cerebrale e altre malattie ad alta mortalità, minacciando seriamente la vita sana dei pazienti22. CVD, tra cui cardiopatia ischemica, cardiomiopatia, aterosclerosi, ipertensione, ictus e insufficienza cardiaca, si verifica quando le arterie che forniscono sangue al cuore si restringono o si induriscono23,24. Sebbene esistano molte misure per diagnosticare le CVD, un esame del sangue è ancora il più conveniente e veloce. Una determinazione accurata, sensibile e rapida dei marcatori precoci correlati alle CVD può diagnosticare e comprendere rapidamente lo stato fisiopatologico della malattia. Pertanto, le crescenti esigenze diagnostiche dei pazienti con CVD richiedono la raccolta di campioni di sangue rappresentativi e di alta qualità25. I metodi di raccolta del sangue comunemente usati negli esperimenti sugli animali comprendono il taglio della coda, la vena della coda, il canto interno, l'aorta addominale, la vena sublinguale, l'artero-venosa carotidea, la decapitazione, l'acquisizione cardiaca della siringa e il prelievo di sangue artero-venoso femorale26. Il prelievo di sangue convenzionale è il metodo di campionamento più comunemente utilizzato per l'analisi dei farmaci in vivo. Tuttavia, a causa della complicata composizione del sangue e di molti disturbi endogeni, il processo di separazione e purificazione è cockamamie e noioso, con la possibilità di perdita di farmaci e contaminazione in questo processo27. Oltre a considerare i requisiti dell'etica animale, la raccolta di sangue a lungo termine con danni tissutali maggiori può anche portare alla morte dell'animale e fuorviare i risultati dei test degli indicatori28. Allo stesso tempo, campioni di sangue di alta qualità e accettabili sono anche decisivi per garantire il rilevamento qualitativo e quantitativo dei cambiamenti dinamici nei principi attivi derivati da erbe etniche nel sangue animale.
La tecnica di campionamento in microdialisi utilizzata in questo studio è una nuova tecnica di campionamento bioptico sviluppata negli ultimi 20 anni e viene gradualmente applicata negli studi farmacologici di erboristeria etnica29. Per quanto riguarda la microdialisi del sangue, è una membrana permeabile selettiva che può acquisire continuamente grandi quantità di campioni dal singolo animale senza perdere liquidi corporei. E più in particolare, la tecnologia di campionamento del sangue basata sulla microdialisi mantiene l'equilibrio dinamico dei fluidi corporei, evita il problema della riduzione del flusso sanguigno causato dalle tradizionali tecnologie di raccolta del sangue ed elimina l'influenza della distribuzione dei farmaci sui risultati dei test30,31. Merita di essere ricordato che l'acquisizione del sangue mediante microdialisi online raggiunge il rilevamento in tempo reale della concentrazione di farmaci nel sangue negli animali coscienti nei siti bersaglio32,33, che è particolarmente adatto per lo studio in vivo dei tessuti profondi e degli organi vitali. Con l'applicazione sempre più matura della tecnologia di microdialisi, l'emergere di nuove sonde tessuto-specifiche si è gradualmente sviluppato dalla rilevazione iniziale di un singolo sito nel cervello a più siti, come il fegato, il lembo cutaneo / cutaneo, il muscolo scheletrico e l'occhio, che espande lo studio dell'azione farmacologica delle erbe etniche in più tessuti e organi33, 34.
Sebbene la tecnologia di campionamento in microdialisi abbia i suoi vantaggi unici rispetto alla tecnologia di campionamento tradizionale, ha anche i suoi limiti35. In primo luogo, la microdialisi non è adatta per la raccolta di campioni di tutte le sostanze, come la rilevazione di biomacromolecole proteiche e farmaci che possono legarsi irreversibilmente alle membrane semipermeabili. In secondo luogo, le caratteristiche della sonda, le proprietà di perfusato e l'operazione di impianto della sonda limitano il riciclaggio e il riutilizzo delle sonde. In terzo luogo, le costose sonde e l'elevato costo degli strumenti combinati online hanno limitato in una certa misura l'uso della tecnologia di microdialisi. In conclusione, l'applicazione della tecnologia di microdialisi svolgerà senza dubbio un ruolo enorme nella promozione della medicina etnica nell'esplorazione delle malattie cardiovascolari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82104533), dalla China Postdoctoral Science Foundation (2020M683273), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia della provincia del Sichuan (2021YJ0175) e dal progetto chiave di ricerca e sviluppo del Piano provinciale di scienza e tecnologia del Sichuan (2022YFS0438). Nel frattempo, gli autori desiderano ringraziare Yuncheng Hong, ingegnere senior delle apparecchiature presso TRI-ANGELS D & H TRADING PTE. LTD. (Singapore city, Singapore), per la fornitura di servizi tecnici per le tecniche di microdialisi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal anesthesia system | Rayward Life Technology Co., Ltd | R500IE | |
| Animal temperature maintainer | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| Blood microdialysis probe | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Catheter | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 251275 | |
| Electric shaver | Rayward Life Technology Co., Ltd | CP-5200 | |
| Fep tubing | CMA Microdialysis AB | 3409501 | |
| Free movement tank for animals | CMA Microdialysis AB | CMA120 | |
| Glucose | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | G8270 | |
| Hemostatic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F21020-16 | |
| Isofluran | Rayward Life Technology Co., Ltd | R510-22 | |
| Micro scissors | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | FS221 | |
| Microdialysis collection tube | CMA Microdialysis AB | 7431100 | |
| Microdialysis collector | CMA Microdialysis AB | CMA4004 | |
| Microdialysis in vitro stand | CMA Microdialysis AB | CMA130 | |
| Microdialysis microinjection pump | CMA Microdialysis AB | 788130 | |
| Microdialysis syringe (1.0 mL) | CMA Microdialysis AB | 8309020 | |
| Microdialysis tubing adapter | CMA Microdialysis AB | 3409500 | |
| Microporous filter membrane | Merck Millipore Ltd. | R0DB36622 | |
| Non-absorbable surgical sutures | Shanghai Tianqing Biological Materials Co., Ltd | S19004 | |
| Operating table | Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd | 30153 | |
| Ophthalmic forceps | Rayward Life Technology Co., Ltd | F12016-15 | |
| Sodium citrate | Merck Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd | 1613859 | |
| Sprague Dawley (SD) rats | Chengdu Dossy Experimental Animals Co., Ltd | SYXK( )2019-049 |
|
| Surgical scissors | Rayward Life Technology Co., Ltd | S14014-15 | |
| Surgical scissors | Shanghai Bingyu Fluid technology Co., Ltd | BY-103 | |
| Syringe needle | CMA Microdialysis AB | T55347 | |
| Ultrasonic cleaner | Guangdong Goote Ultrasonic Co., Ltd | KMH1-240W8101 |
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