Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

HPLC kombinert med kjemisk fingeravtrykk for flermønstergjenkjenning for å identifisere ektheten til Clematidis armandii Caulis

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64690
Automatic Translation
*1, *1, *2, 2, 2, 2, 1
1School of Pharmacy, The Second Class Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutics, National Administration of Traditional Chinese Medicine, Chengdu Medical College, 2Pengzhou Second People's Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å etablere høyytelses væskekromatografi (HPLC), kombinert med kjemisk fingeravtrykkgjenkjenning av flere mønstre, som gir en ny strategi for effektivt å identifisere de ekte varianter av Clematidis Armandii Caulis og dens adulterants.

Abstract

En metode for å identifisere kinesiske medisinske materialer og deres relaterte adulterants ble konstruert ved å ta Clematidis Armandii Caulis (Chuanmutong, en universelt brukt tradisjonell kinesisk medisin) som et eksempel. Ti partier med ekte Chuanmutong-varianter og fem batcher av relaterte adulteranter ble analysert og sammenlignet basert på høyytelses væskekromatografi (HPLC) fingeravtrykk kombinert med kjemometri, inkludert klyngeanalyse (CA), hovedkomponentanalyse (PCA) og ortogonal partiell minste kvadraters diskrimineringsanalyse (OPLS-DA). I tillegg ble innholdet av β-sitosterol bestemt. Det kontrollkjemiske fingeravtrykket til Chuanmutong ble etablert, og 12 vanlige topper ble identifisert. Likheten mellom fingeravtrykket til 10 partier ekte Chuanmutong-varianter og kontrollfingeravtrykket var 0,910-0,989, mens likheten mellom fem partier med adulterants bare var 0,133-0,720. Basert på de vanlige toppene i kromatogrammet, ble 15 batcher av prøver klassifisert i tre innholdsnivåer av PCA, og ble samlet i fire kategorier av CA, og oppnådde et klart skille mellom autentiske Chuanmutong og adulterants av Chuanmutong. Videre ble syv differensialkomponenter som effektivt kan identifisere autentiske Chuanmutong og adulterants av Chuanmutong funnet gjennom OPLS-DA. β-sitosterolinnholdet i 10 partier av ekte Chuanmutong-varianter var 97,53-161,56 μg / g, mens β-sitosterolinnholdet i de fem batchene av adulterants varierte sterkt, blant annet β-sitosterolinnholdet i Clematis peterae Hand.-Mazz. og Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils. var betydelig lavere enn for autentiske varianter av Chuanmutong. HPLC-indekskomponentinnholdet og kjemisk fingeravtrykkgjenkjenningsmetode for flere mønstre etablert i denne studien gir en ny strategi for effektivt å identifisere autentiske kinesiske medisinske materialer og relaterte adulteranter.

Introduction

Chuanmutong, tørr Caulis av Clematis armandii Franch. eller Clematis montana Buch.-Ham., er en tradisjonell kinesisk medisin som vanligvis brukes i klinikker 1,2,3. Det brukes til behandling av urinproblemer, ødem, sår på tungen og munnen, redusert melkesekresjon, leddstivhet og muskelsmerter forårsaket av fuktig varme4. Chuanmutong har alltid blitt hentet fra ville varianter, hovedsakelig distribuert i sørvest-Kina, spesielt i Sichuan, hvor den beste kvaliteten finnes 5,6. Det er vanskelig å skille mellom autentiske varianter og deres nært beslektede adulterants på grunn av deres lignende egenskaper 7,8,9,10. Kvalitetsstandarden til Chuanmutong i 2020-utgaven av kinesisk farmakopé fastsetter bare egenskapene, mikroskopisk identifikasjon og tynnsjiktsidentifikasjon uten innholdsbestemmelse, som ikke effektivt kan identifisere adulteranter, og dermed har potensielle risikoer. Videre er det få rapporter som sammenligner og identifiserer Chuanmutong og relaterte planter. Følgelig er en kvalitetskontrollmetode for å sikre ektheten av Chuanmutong verdig videre studier.

De kjemiske bestanddelene i Chuanmutong består hovedsakelig av pentacykliske triterpenoider av oleanane-typen og deres glykosider, flavonoider og organiske syrer11,12,13,14. Blant dem har oleanolsyre, β-sitosterol, stigmasterol og ergosterol vanndrivende effekter av forskjellige intensiteter, noe som kan være potensielle farmakodynamiske stoffer for å fremme diurese og lindre stranguria15,16. Kjemiske fingeravtrykk oppnås ved å separere og oppdage mange kjemiske komponenter som finnes i prøver ved høyytelses væskekromatografi (HPLC), gasskromatografi (GC), etc. Vedta hensiktsmessige statistiske analysemetoder for å analysere egenskapene til Chuanmutong kan bestemme den generelle kvalitetskontroll og vitenskapelig identifikasjon av tradisjonell kinesisk medisin17,18,19.

I denne studien ble 10 partier Chuanmutong autentiske varianter og fem partier med adulterants samlet. Kvaliteten ble sammenlignet og analysert ved hjelp av HPLC-fingeravtrykksmetoden kombinert med multimønstergjenkjenning, inkludert klyngeanalyse (CA), hovedkomponentanalyse (PCA), ortogonal partiell minste kvadraters diskrimineringsanalyse (OPLS-CA) og innholdsbestemmelse av den farmakodynamiske komponenten. Denne protokollen etablerer en metode for å identifisere autentiske varianter med høy spesifisitet, en ny strategi for vitenskapelig identifisering av autentiske varianter og adulterants av kinesiske medisinske materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Metoder for kjemisk fingeravtrykksdeteksjon

  1. Kromatografiske forhold
    1. Forbered acetonitril (A) / vann (B) mobilfasen. Sett et gradientprogram som følger i HPLC-programvaren: 0-20 min, 3% A-10% A; 20-25 min, 10% A-13% A; 25-65 min, 13% A-25% A; 65-75 min, 25% A-40% A; 75-76 min, 40% A-3% A; 76-85 min, 3% A-3% A.
    2. Oppretthold strømningshastigheten til mobilfasen på 1,0 ml / min.
    3. Utfør kromatografisk separasjon på en C18-kolonne (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) opprettholdt ved 30 °C.
    4. Sett injeksjonsvolumet til 10 μL.
    5. Oppdag prøvene ved en bølgelengde på 205 nm.
      MERK: For de spesifikke innstillingene for kromatografiske forhold, se driftsprosedyrene til arbeidsprogramvaren for høyytelses væskekromatografi (materialtabell).
  2. Fremstilling av prøveoppløsningen
    1. Slip råmaterialene til jevn partikkelstørrelse ved å føre dem gjennom et nylonnett med en indre diameter på 850 μm ± 29 μm.
    2. Plasser 2 g av jordråmaterialet (nøyaktig veid) i en 50 ml konisk kolbe med en propp og tilsett 50 ml metanol. Plasser proppen på kolben og ultralydet (600 W, 40 kHz) i 30 minutter.
    3. Avkjøl deretter kolben til romtemperatur (RT). Vei prøvene igjen, og gjør opp for startvekten ved å erstatte det tapte ekstraksjonsmiddelet.
    4. Hell 4 ml av metanoloppløsningen som inneholder medisinske ekstrakter i en 10 ml volumetrisk kolbe. Tilsett 6 ml H2O, bland, og la den slå seg til ro i 10 minutter.
    5. Til slutt filtrerer du supernatanten gjennom en 0,45 μm filtermembran og plasserer den i standby.
  3. Validering av metoder for deteksjon av fingeravtrykk
    1. Klargjør prøven som beskrevet ovenfor (trinn 1.2) og utsett den for HPLC-analyse (trinn 1.1) seks ganger om dagen. For å evaluere presisjonen beregner du det relative standardavviket (RSD) for relativ retensjonstid og relative toppområder som beskrevet i trinn 1.3.5.
    2. Evaluer stabiliteten til prøveløsningen ved å analysere den samme prøveløsningen som er lagret ved RT i 0, 2, 4, 6, 8, 12 og 24 timer, og beregne RSD for relativ retensjonstid og relative toppområder som beskrevet i trinn 1.3.5.
    3. Ta seks replikasjoner av den samme prøven (CMT-4), klargjør prøveløsningen i henhold til prosedyren ovenfor (trinn 1.2), og oppdag fingeravtrykket i HPLC etter trinn 1.1. Beregn RSD for relativ retensjonstid og relative toppområder, og evaluer repeterbarheten som beskrevet i trinn 1.3.5.
    4. Bruk deretter topp nummer 10 i figur 1B som referansetopp og beregn RSD for den relative retensjonstiden og det relative toppområdet for hver felles topp som beskrevet i trinn 1.3.5.
    5. Bruk formlene nevnt nedenfor til å beregne den relative retensjonstiden og det relative toppområdet for hver felles topp:
      T re = T karakteristisk/Treferanse
      A re = Enegenskap/A-referanse
      Hvor T re =relativ retensjonstid, T-karakteristikk = karakteristisk toppretensjonstid, T-referanse = referansetoppretensjonstid, A re = relativt toppområde, A karakteristikk = karakteristisk toppområde og Areferanse = referansetoppområde.
      MERK: Etablering av tradisjonell kinesisk medisin fingeravtrykk krever generelt å velge en kromatografisk topp som er lett å få tak i og har høy oppløsning. Dette brukes som en referansetopp for å identifisere fingeravtrykkene og undersøke deres stabilitet og reproduserbarhet.

2. Etablering av Chuanmutong fingeravtrykk og likhetsanalyse

  1. Bruk 10 partier med autentiske prøver og fem partier med adulterants som Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) WT Wang (CC), Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. (DC), Clematis peterae Hand.-Mazz. (DE), Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils (XS), og Clematis finetiana Levl. et Vaniot. (SMT) som prøver for fingeravtrykksanalyse.
  2. Klargjør prøveløsningene som beskrevet i trinn 1.2. Utfør fingeravtrykksanalyse av alle prøveløsninger av HPLC i henhold til forholdene beskrevet under trinn 1.1.
  3. Importer relevante data til likhetsevalueringssystemet for kromatografiske fingeravtrykk av tradisjonell kinesisk medisin (SESCF-TCM, 2012 versjon). Systemet vil betegne toppene med rimelig høyde og god oppløsning i kromatogrammene til alle prøvene som vanlige topper.
    MERK: SESCF-TCM-programvaren kan lastes ned etter registrering på nettstedet til den kinesiske farmakopékommisjonen (http://114.247.108.158:8888/login).
    1. I programvaren klikker du på Set Reference Spectrum-knappen i menyen.
    2. Sett deretter tidsvindubredden til 0,5 i vinduet Parameterinnstillinger, og velg Kontrollspektrumgenereringsmetode som medianmetode.
    3. Klikk på Flerpunktskalibrering i hovedmenyen, og velg deretter Peak Matching som Full Spectrum Peak Matching.
    4. Til slutt klikker du på Generer kontroll for å generere referansekromatografisk fingeravtrykk av den autentiske arten Chuanmutong.
  4. Importer oppbevaringstiden og toppområdet på 10 batcher med autentiske Chuanmutong-prøver og fem batcher med adulterants til SESCF-TCM for analyse. De spesifikke operasjonene er som følger:
    1. I programvaren klikker du på Set Reference Spectrum-knappen i hovedmenyen.
    2. I vinduet Parameterinnstillinger angir du referansekromatografisk fingeravtrykk for den autentiske Chuanmutong-arten som referanse, velger kontrollspektrumgenereringsmetoden som medianmetode og setter tidsvindubredden til 0,5.
    3. Klikk på Flerpunktskalibrering i hovedmenyen, og velg deretter Peak Matching som Full Spectrum Peak Matching.
    4. Til slutt klikker du på Beregn likhet for å beregne likheten basert på referansekromatogramfingeravtrykkene til Chuanmutong. Til slutt beregner du likheten av fingeravtrykk ved hjelp av Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System (2012-versjonen).
      MERK: For de spesifikke operasjonene, se driftsspesifikasjonene for Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System (2012-versjonen).

3. Multi-mønster anerkjennelse analyse av Chuanmutong fingeravtrykk

  1. Klyngeanalyse (CA)
    1. Bruk toppområdene til 12 vanlige topper i fingeravtrykkene til 10 batcher av autentiske Chuanmutong-prøver og deres fem batcher av adulterants som variabler, og skriv dem inn i statistisk analyseprogramvare for systematisk klyngeanalyse (CA).
    2. Velg Between-Groups-metoden og bruk Pearson-korrelasjonskoeffisienten som klassifiseringsgrunnlag for å tegne et klyngeanalysediagram over Chuanmutong og dets adulteranter. De spesifikke operasjonene er som følger:
      1. I programvaren for statistisk analyse klikker du på Fil for å importere data.
      2. Klikk på Analyse i menyen og klikk deretter på System Clustering i Classification.
      3. Velg det vanlige toppområdet som en variabel, og angi antall klynger til fire.
      4. Klikk på Metode, velg klyngemetoden som Inter-Group Connection, velg måleintervallet som Pearson Correlation, og klikk på OK for å tegne CA-kartet.
  2. Prinsipal komponentanalyse (PCA)
    1. Importer det relative felles toppområdet for de autentiske variantene og deres adulterants i analyseprogramvaren for PCA-analyse, og bruk PCA-scorekartet til å evaluere scorematrisekartet over prøveforskjeller. De spesifikke operasjonene er som følger:
      1. Åpne dataanalyseprogramvaren, klikk på Fil på menyen og opprett et nytt vanlig prosjekt. Importer toppområdet på 12 vanlige topper i et regneark (f.eks. Excel-format) fra HPLC-systemet. Klikk deretter på Fullfør for å fullføre dataimporten.
      2. Klikk på Ny for å lage en ny modell for å angi modelltypen med PCA. Klikk på Autotilpass og Legg til for å passe til dataene, og klikk deretter på Poeng for å få PCA-poengsumkartet.
  3. Ortogonal partiell minste kvadraters diskrimineringsanalyse (OPLS-DA)
    1. Bruk den ortogonale partielle minste kvadraters diskrimineringsanalysemetoden med tilsynsmodus for ytterligere å analysere de relative vanlige topparealtoppene til de autentiske Chuanmutong-varianter og adulteranter og tegne et OPLS-DA-klassifiseringspoengkart over alle prøver. De spesifikke operasjonene er som følger:
      1. I dataanalyseprogramvare klikker du på Fil i menyen for å importere en fil og opprette et nytt vanlig prosjekt. Importer toppområdet på 12 vanlige topper i et regneark fra HPLC-systemet, og klikk deretter på Fullfør for å fullføre dataimporten.
      2. Klikk på Ny for å lage en ny modell for å angi modelltypen med PCA. Klikk på Autotilpassing og Legg til for å passe til dataene. Klikk deretter på Score for å få PCA-poengsumkartet.
      3. Klikk på Ny og velg Ny som modell for å angi modelltypen med OPLS-DA.
      4. Klikk på Skala og angi type med Par for alle. Klikk på Autofit først, og klikk deretter på Scores for å få OPLS-DA-poengsumkartet.
    2. For å bestemme innflytelsen av hver felles topp i Chuanmutong på klassifiseringsresultatene og forskjellen mellom autentiske Chuanmutong-materialer og relaterte adulterants, bruk variabelen betydning i projeksjonen (VIP) for analyse.
    3. Tegn VIP-kartet over de forskjellige komponentene i Chuanmutong. Bruk det resulterende VIP-kartet til å vurdere virkningen av hver variabel på klassifiseringen og for å sile ut komponenter som bidrar betydelig til forskjellene mellom gruppene. De spesifikke operasjonene er som følger:
      1. I dataanalyseprogramvaren klikker du på Analyser i menyen og klikker på Permutasjoner, setter antall permutasjoner til 200, og får R 2 og Q2 på OPLS-DA-poengkartet.
      2. Klikk på VIP og velg VIP Predictive for å få VIP-kartet.

4. Bestemmelse av β-sitosterol i Chuanmutong av HPLC

  1. Kromatografiske tilstander (se trinn 1.1)
    1. Forbered mobilfasen: metanol-vann (97:3).
    2. Still strømningshastigheten til mobilfasen til 1,0 ml/min.
    3. Utfør kromatografisk separasjon på en C18-kolonne (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) opprettholdt ved 30 °C.
    4. Sett injeksjonsvolumet til 10 μL.
    5. Oppdag komponenten ved en bølgelengde på 204 nm.
  2. Fremstilling av prøveoppløsningen
    1. Klargjør stamstandardoppløsningen av β-sitosterol (0,1 mg/ml) ved å oppløse en nøyaktig veid mengde av den tilsvarende referansestandarden i metanol.
    2. Slip analyseprøven av råmaterialet til jevn partikkelstørrelse ved å føre prøven gjennom nylonnettet med en indre diameter på 180 μm ± 7,6 μm.
    3. Plasser 2 g av bakken råmateriale (nøyaktig veid) i en rundbunnet kolbe og tilsett 50 ml kloroform til den.
    4. Koble kolben til en reflukskondensator og varm den i et kokende vannbad (moderat koking) i 60 minutter. Filtrer ekstraksjonsløsningen med et 15-20 μm filterpapir.
    5. Fordamp filtratet til nær tørrhet på et kokende vannbad (moderat koking) i ca 10 minutter.
    6. Oppløs resten og gjør opp volumet til 5 ml ved bruk av metanol. Til slutt, pass supernatanten gjennom en 0,45 μm filtermembran, og legg den i standby.
  3. Metode validering
    1. Ta stamløsningen av β-sitosterol fremstilt i undertrinn 4.2.1, fortynn den med 100% metanol, og lag løsninger med 100 μg / ml, 80 μg / ml, 60 μg / ml, 50 μg / ml, 40 μg / ml, 30 μg / ml og 20 μg / ml konsentrasjoner.
    2. Injiser prøvene under de kromatografiske forholdene beskrevet i trinn 4.1 for å bestemme toppområdet, utfør regresjonsanalyse med toppområdet til injeksjonsvolumet, og oppnå regresjonsligningen og korrelasjonskoeffisienten for å evaluere lineariteten.
    3. Klargjør prøvene som beskrevet ovenfor (trinn 4.2) og utsett dem for HPLC-analyse (trinn 4.1) seks ganger samme dag. Beregn deretter RSD av toppområder for å evaluere presisjonen.
    4. Evaluer stabiliteten til prøveløsningen ved å analysere de samme prøveløsningene som er lagret ved RT i 0, 2, 4, 6, 8, 12 og 24 timer, som beskrevet i trinn 4.1. Beregn deretter RSD for toppområder som beskrevet i trinn 1.3.5.
    5. Undersøk repeterbarheten ved å oppløse den samme prøven (CMT-4) i sekstuplicate, utarbeidet som beskrevet i trinn 4.2, og utsette dem for HPLC-analyse som beskrevet i trinn 4.1. Beregn deretter RSD av β-sitosterolinnhold i seks prøver.
    6. Vurder metodens nøyaktighet ved å bruke standard addisjonsmetode. For dette legger du til referanseløsningene β-sitosterol til prøvene ved 80%, 100% og 120% av β-sitosterolinnholdet og gjentar hver tilstand tre ganger som beskrevet i trinn 4.1. Evaluer metodens nøyaktighet ved å beregne gjennomsnittlig utvinning og RSD.
      MERK: Beregningsformelen for utvinningsgraden (RR) er som følger:
      RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
      Hvor M t = kvaliteten på β-sitosterol etter tilsetning av standarden, M 0 = kvaliteten på prøveløsningen, og Ms = kvaliteten på β-sitosterol tilsatt.
  4. Bestemmelse av β-sitosterolinnhold i prøver
    1. Ta 10 batcher autentiske kinesiske medisinske materialer og fem batcher med relaterte adulterants for å forberede prøveløsninger i henhold til trinn 4.2.
    2. Injiser deretter hver prøveløsning og β-sitosterolreferanseløsning for å bestemme toppområdet under forholdene beskrevet i trinn 4.1, og beregne β-sitosterolinnholdet i hver prøve ved hjelp av den eksterne standard ettpunktsmetoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kromatografisk fingeravtrykk av Chuanmutong og likhetsanalyse (SA)
RSD-verdiene for den relative retensjonstiden for presisjon, repeterbarhet og stabilitet var henholdsvis under 0,46 %, 1,65 % og 0,53 %. RSD-verdiene for det relative toppområdet var henholdsvis under 4,23 %, 3,56 % og 3,96 %. Som vist i figur 1A, B, var det 12 forskjellige vanlige topper (fra topp 1 til topp 12) i HPLC-fingeravtrykkene i de 10 autentiske Chuanmutong-prøvene. Siden toppområdet på nr. 10 var relativt stort, var oppløsningen god; Siden det var en komponent tilstede i hver prøve, ble den brukt som en referansetopp for å undersøke stabiliteten og reproduserbarheten til fingeravtrykket. Deretter ble topp nr. 10 tatt som referansetopp (S), og den relative retensjonstiden for de resterende 11 toppene ble beregnet.

I likhetsanalyse, jo nærmere korrelasjonskoeffisienten er til 1, desto høyere er likheten mellom prøvene. Som vist i tabell 1 var likhetsgradene på 10 partier Chuanmutong 0,910-0,989. Disse resultatene viste at de 10 partiene med Chuanmutong hadde høy likhet og god konsistens, som kan brukes til å evaluere den generelle kvaliteten på Chuanmutong. Som vist i figur 1C ble fingeravtrykkene til fem partier av dens adulterants oppnådd. Likheten mellom fingeravtrykkene til fem partier med adulterants og kontrollfingeravtrykkene til Chuanmutong var bare 0,133-0,720 (tabell 1), noe som indikerer at det er åpenbare forskjeller mellom de autentiske prøvene og de relaterte adulterantene. Forskjellene var hovedsakelig konsentrert i de kromatografiske topptallene på kromatogrammet ved 28-55 min. Dermed kan kontrollfingeravtrykkene til Chuanmutong effektivt skille de autentiske prøvene fra de relaterte adulterantene.

SPSS 26 statistisk programvare ble brukt til CA-analyse i dette eksperimentet (figur 2A); 15 partier med prøver ble delt inn i to kategorier når klassifiseringsavstanden var 20. Den første kategorien var 10 partier Chuanmutong og dens vanlige adulterants (CC). Den andre kategorien var adulterants av Chuanmutong, inkludert DC, DE, XS og SMT. Når klassifiseringsavstanden var fire, ble alle prøvene delt inn i fire kategorier. Den første kategorien var 10 partier Chuanmutong, den andre kategorien var CC, den tredje kategorien var SMT og XS, og den fjerde kategorien var DC og DE. Klassifiseringsresultatene viste at kvaliteten på de autentiske varianter av Chuanmutong i utgangspunktet var den samme, og det var åpenbare forskjeller med alle adulterantene. Samtidig, sammenlignet med andre adulterants, var CC nærmere den autentiske varianten av Chuanmutong, men det kan fortsatt skilles når klassifiseringsavstanden er innsnevret.

De vanlige toppområdene for de 15 prøvepartiene ble importert til dataanalyseprogramvare for PCA-analyse, og skårmatrisen (R 2 x = 0,994, Q2 = 0,961) (figur 2B) viste at klyngeeffekten av de 15 prøvepartiene var uttalt. På høyre side av Y-aksen var 10 partier Chuanmutong og CC. Blant dem var CC lokalisert i den første kvadranten, som er forskjellig fra de autentiske varianter av Chuanmutong. Venstre side av Y-aksen var adulterantene, inkludert SMT, XS, DE og DC. Blant dem var SMT og XS lokalisert i den andre kvadranten, og DE og DC var lokalisert i den tredje kvadranten. Mens man sammenligner de autentiske varianter av Chuanmutong og de konvensjonelle adulterants, er forskjellen mellom CC og autentiske varianter relativt liten, mens forskjellen mellom autentiske og andre adulterants er åpenbar.

Det vanlige toppområdet for Chuanmutong og dets adulteranter ble brukt som en variabel, importert til dataanalyseprogramvaren for OPLS-DA, og deretter ble scorematrisen tegnet (figur 3A). R 2 x [1] av OPLS-DA-modellen var 0,695, og R 2 x [2] var 0,605, som begge er større enn 0,5, noe som indikerer at modellen er stabil og pålitelig og kan brukes til å skille autentiske prøver fra adulterants.

Det fremgår av figur 3A at prøvepunktene til de autentiske og andre adulterantene var helt adskilt, og det var ikke noe skjæringspunkt mellom prøvepunktene. Alle prøvene ble delt inn i tre deler. De autentiske varianter av Chuanmutong og CC var like. Prøvene av XS, DC og DE ble gruppert i en klasse, og prøven av SMT var den siste klassen. Videre ble skjønnsmetoden av variabel betydning i projeksjonen (VIP) (figur 3B) brukt til å skjerme toppene til forskjellige komponenter i fingeravtrykket til hver prøve. VIP > 1.0 ble tatt som standard for å sile ut sevebvariabler som bidro sterkt til klassifiseringen mellom utvalgsgruppene. Ifølge screeningresultatene var de viktigste markørkomponentene som forårsaket forskjellen i sammensetning mellom autentiske prøver og adulterants toppene nr. 9, nr. 5, nr. 7, nr. 6, nr. 10, nr. 3 og nr. 2. VIP-verdien av de resterende toppene var mindre enn 1, noe som hadde liten effekt på diskriminering av prøver.

Det lineære forholdet mellom toppområdet β-sitosterol og dets løsningskonsentrasjon ble funnet ved hjelp av regresjonsanalyse. Denne avhengigheten adlød en ligning Y = 5,4918 X-4,5563, hvor Y er det β-sitosterol-toppområdet og X er β-sitosterolinnholdet i μg / ml. Samtidig er korrelasjonskoeffisienten r = 0,9995, som oppfyller kravene. RSD for presisjonstesten, stabilitetstesten og repeterbarhetstesten var henholdsvis 1,76 %, 4,22 % og 3,85 %. Resultatene viser at bestemmelsesmetoden for β-sitosterolinnhold hadde god linearitet, presisjon og repeterbarhet, og prøveløsningen var stabil innen 24 timer. Gjennomsnittlig prosentvis utvinning på tre nivåer var 101,50 %, 101,90 % og 100,72 %; tilsvarende RSD var henholdsvis 2,56 %, 1,56 % og 1,68 %. Gode samsvar mellom teoretiske og faktiske fastsatte verdier bekreftet nøyaktigheten og anvendeligheten av analysemetoden. Væskekromatogrammet av β-sitosterol er vist i figur 4, og innholdet av β-sitosterol i 15 batcher av prøver ble bestemt (tabell 2). Resultatene viste at konsentrasjonen av β-sitosterol i 10 partier autentiske prøver var i området 97,53-161,56 μg / g (relativt stabil). Denne komponenten ble påvist i alle fem batchene av adulterants, men innholdet varierte sterkt.

Figure 1
Figur 1: Fingeravtrykk av Chuanmutong og deres adulterants. (A) Fingeravtrykk av 10 partier autentiske Chuanmutong-prøver (S1: CMT-1, S2: CMT-2, S3: CMT-3, S4: CMT-4, S5: CMT-5, S6: CMT-6, S7: CMT-7, S8: CMT-8, S9: CMT-9, S10: CMT-10). (B) Referansekromatogramfingeravtrykk av autentiske Chuanmutong-prøver; relativ retensjonstid var 0,18 (topp nr.1), 0,22 (topp nr. 2), 0,29 (topp nr. 3), 0,72 (topp nr. 4), 0,75 (topp nr. 5), 0,82 (topp nr. 6), 0,86 (topp nr. 7), 0,92 (topp nr. 8), 0,96 (topp nr. 9), 1,00 (topp nr. 10), 1,02 (topp nr. 11), 1,37 (topp nr. 12). (C) Fingeravtrykk av fem partier Chuanmutong adulterants (S1: CC, S2: DC, S3: DE, S4: XS, S5: SMT). (D) Sammenligning mellom referansekromatogramfingeravtrykk av autentiske Chuanmutong-prøver og de fem batchene av deres adulterants (S1: referansekromatogramfingeravtrykk, S2: CC, S3: DC, S4: DE, S5: XS, S6: SMT). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: CA- og PCA-analyse av 10 batcher av autentiske Chuanmutong-prøver og fem batcher av adulterants. (A) CA-analyse. (B) PCA-analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: OPLS-DA score kart og VIP score kart over 10 grupper av autentiske Chuanmutong prøver og fem grupper av adulterants. (A) OPLS-DA score kart. (B) VIP score kart. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Det flytende kromatogrammet av β-sitosterol. S1: β-sitosterol, S2: CMT-4, S3: XS, S4: DC, S5: SMT, S6: CC, S7: DE. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Prøver Navn Likheten
de ekte varianter av Chuanmutong CMT-1 0.947
CMT-2 0.910
CMT-3 0.989
CMT-4 0.937
CMT-5 0.989
CMT-6 0.988
CMT-7 0.956
CMT-8 0.959
CMT-9 0.939
CMT-10 0.966
ekteskapsbrytere CC 0.599
DC 0.720
DE 0.133
XS 0.694
SMT 0.180

Tabell 1: Resultater av likhet med 10 partier autentiske Chuanmutong-prøver og deres adulterants. Ved å importere de relevante dataene til Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Evaluation System, ble likheten mellom 10 partier autentiske Chuanmutong-prøver og fem partier med adulterants beregnet.

Prøver Navn Innhold (μg/g)
de ekte varianter av Chuanmutong CMT-1 103.5
CMT-2 124.6
CMT-3 131
CMT-4 121.1
CMT-5 97.5
CMT-6 113.8
CMT-7 105.6
CMT-8 161.6
CMT-9 118
CMT-10 123.5
ekteskapsbrytere CC 157.4
DC 165.6
DE 32.9
XS 69.7
SMT 192.2

Tabell 2: Bestemmelsesresultater av β-sitosterolinnhold i de autentiske Chuanmutong-prøvene og deres adulterants.

Supplerende figur 1: Væskekromatografi under forskjellige prøveprepareringsbetingelser og forskjellige kromatografiske forhold. (A) De mobile fasesystemene (S1: acetonitril-0,1% maursyreoppløsning, S2: acetonitril-0,5% eddiksyreoppløsning, S3: acetonitril-rent vann, S4: acetonitril-0,05% fosforsyreoppløsning, S5: metanol-rent vann). (B) Deteksjonsbølgelengdene (S1: 205 nm, S2: 230 nm, S3: 250 nm, S4: 300 nm). (C) Kolonnetemperaturene (S1: 20 °C, S2: 30 °C, S3: 40 °C). (D) Strømningshastighetene (S1: 0,8 ml/min, S2: 0,9 ml/min, S3: 1,0 ml/min). (E) Ekstraksjonsmetodene (S1: ultralydutvinning, S2: refluksekstraksjon). (F) Ekstraksjonsløsningsmidlene (S1: etylacetat, S2: etanol, S3: kloroform, S4: n-butanol, S5: metanol). (G) Avtrekkstiden (S1: 15 min, S2: 30 min, S3: 60 min). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2: Det flytende kromatogrammet av ergosterol, stigmasterol og autentisk Chuanmutong. S1: stigmasterol, S2: ergosterol, S3: CMT-4. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Prøveinnsamlingen for forskning er det første viktige skrittet for å konstruere multimønstergjenkjenning for å identifisere ektheten av kinesiske medisinske materialer. Gjennom markedsundersøkelser fant vi at Sichuan Ya'an, Liangshan og Leshan er de viktigste produksjonsområdene for ville ressurser i Chuanmutong. De beslektede variantene av samme slekt har også samme geografiske utbredelse 6,20; CC, DC, DE, XS og SMT blir ofte misbrukt som Chuangmutong16,21; Derfor ble det i denne studien samlet 10 partier autentisk Chuanmutong og fem batcher av blandede prøver på de ovennevnte opprinnelsesstedene, og nøyaktigheten av varianter ble bekreftet.

Det andre viktige trinnet er å skjerme deteksjonsforholdene til HPLC-fingeravtrykket, som kan vise så mye informasjon som mulig om de kjemiske komponentene. I denne studien, som vist i supplerende figur 1, ble antall og areal av kromatografiske topper oppnådd under forskjellige prepareringsforhold, inkludert ekstraksjonsmetoder, ekstraksjonsløsningsmidler og ekstraksjonstid. Den optimale prepareringsmetoden for Chuanmutong-prøveoppløsningen ble bestemt. På den annen side ble antallet og oppløsningen av kromatografiske topper av prøvene under forskjellige kromatografiske forhold sammenlignet. De mobile fasesystemene, som acetonitril-0,1% maursyreoppløsning, acetonitril-0,5% eddiksyreoppløsning, acetonitrilrent vann, acetonitril-0,05% fosforsyreoppløsning og metanolrent vann, deteksjonsbølgelengdene, som 205 nm, 230 nm, 250 nm og 300 nm, kolonnetemperaturene, som 20 ° C, 30 ° C og 40 ° C, og strømningshastighetene, for eksempel 0,8-1,0 ml / min, ble undersøkt. De optimale kromatografiske forholdene for å analysere prøvene av Chuanmutong ble bestemt. Videre ble dens gjennomførbarhet bekreftet ved metodologisk validering, og deteksjonsmetoden til HPLC-fingeravtrykket til Chuanmutong ble vellykket konstruert.

Det tredje viktige trinnet er å analysere og finne informasjonen forskjellig i fingeravtrykkene til autentisk kinesisk medisin og dens adulterants. I denne studien ble for det første likheten av fingeravtrykk analysert ved hjelp av SESCF-TCM (2012-versjonen). Det ble funnet at likheten mellom fingeravtrykkene til 10 partier autentiske Chuanmutong-prøver og kontrollkarakteristikken fingeravtrykk var svært høy. Til sammenligning var likheten mellom fingeravtrykkene til fem partier med adulterants og kontrollkarakteristikken fingeravtrykk signifikant lavere enn for autentiske prøver. CA, PCA og OPLS-DA ble deretter videre introdusert for å analysere den vanlige toppinformasjonen til de kjemiske fingeravtrykkene. Både CA- og PCA-resultater viser at den ofte brukte adulterant CC blant forskjellige adulterants er relativt nærmere den autentiske, noe som er vanskelig å skille. Men når klassifiseringsavstanden til CA er endret til fire, kan den effektive identifikasjonen mellom det autentiske og adulteranten oppnås. Basert på de 12 vanlige toppene av autentiske materialer, ble bidragsverdiene til differensielle topper av adulterants kvantitativt evaluert av OPLS-DA, og oppnådde syv differensielle kromatografiske topper, nemlig topp nr. 9, topp nr. 5, topp nr. 7, topp nr. 6, topp nr. 10, topp nr. 3 og topp nr. 2. Disse kan brukes til effektivt å identifisere de autentiske og falske materialene til Chuanmutong, som er de viktigste merkede komponentene i forskjellen mellom det autentiske og adulteranten.

Den siste utgaven av kinesisk farmakopé har ennå ikke inkludert innholdsbestemmelsen av de effektive komponentene i Chuanmutong. For å forbedre kvalitetskontrollen undersøkte denne studien innholdsbestemmelsesmetoder for aktive komponenter som β-sitosterol, ergosterol, sitosterol og oleanolsyre relatert til vanndrivende virkning i tidligere rapporter 22,23,24,25,26. Som vist i supplerende figur 2 ble ergosterol ikke påvist i autentisk Chuanmutong, og stigmasterol var vanskelig å separere i kromatogrammet og kunne ikke kvantifiseres nøyaktig. Endelig ble innholdsbestemmelsesmetoden for β-sitosterol etablert; deteksjonsresultatene viste at β-sitosterol ble funnet i 10 batcher av autentiske Chuanmutong-prøver og fem batcher av adulterants. Derfor var β-sitosterol ikke unikt for ekte medisinske materialer. Selv om noen opplysninger om kvaliteten på Chuanmutong kan gis, er det fortsatt nødvendig å analysere differensialkromatografiske topper i fingeravtrykkene i fremtiden for å se om de spesifikke komponentene relatert til effekten av Chuanmutong kan bli funnet.

For tiden identifiseres tradisjonelle kinesiske medisiner ofte av likheten i det kjemiske fingeravtrykkspektret. Denne indikatoren er imidlertid en parameter basert på den generelle informasjonen om prøvekromatografiske topper, som ikke kan gi mer informasjon om identifikasjonen og hovedforskjellene i forskjellige prøver. Derfor brukte denne studien videre CA, PCA og OPLS-DA for å identifisere den vanlige toppinformasjonen om kjemiske fingeravtrykk, fant de viktigste differensielle kromatografiske toppene mellom autentiske og forfalskede prøver av Chuanmutong, og identifiserte dem med hell. Til slutt ble HPLC-koblet kjemisk fingeravtrykk for multimønstergjenkjenning konstruert.

Siden det ikke er uvanlig å blande autentiske kinesiske medisinske materialer og deres adulterants, som Fritillaria thunbergii, Herba Asari og Lonicera japonica, vil denne metoden gi en ny strategi for klar og vitenskapelig identifisering av autentiske kinesiske medisinske materialer og deres adulterants. Denne strategien vil være av stor betydning for å sikre kvaliteten på kinesiske legemidler i klinisk anvendelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av prosjektet Sichuan Traditional Chinese Medicine Administration (nr. 2020JC0088, nr. 2021MS203).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017381038
Acetonitrile Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD5243V
β-Sitosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
 C18 column Yuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, China Welch Ultimate LP
Chuanmutong Guoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  19020103 CMT-1
Chuanmutong Hongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-2
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200701 CMT-3
Chuanmutong Hongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-4
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210701 CMT-5
Chuanmutong Haobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  210401 CMT-6
Chuanmutong Xinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China  200901 CMT-7
Chuanmutong Wusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China  201201 CMT-8
Chuanmutong Limin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China  201001 CMT-9
Chuanmutong Yuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210501 CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. Wang Madzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China  - CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils. Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China  - DC
Clematis peterae Hand.-Mazz. Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China  - DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et Wils Mixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  - XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot. Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China  - SMT
Electronic balance Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,  China  FA1204
Ergosterol Meisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China 20210201
Ethanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2021112602
Ethyl acetate Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2017042043
Formic acid Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 2016062901
High performance liquid chromatography Agilent, USA. 1260
IBM SPSS Statistics version 26.0 International Business Machines Corporation, USA -
Methanol Sigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, China WXBD6409V
Methanol Kelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China 202010302
n-butyl alcohol Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020071047
Petroleum ether Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 2020090125
Phosphoric acid Comeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China 20200110
SESCF-TCM version 2012 National Pharmacopoeia Commission, China - http://114.247.108.158:8888/login
Stigmasterol Meisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China 20210201
Trichloromethane Sinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China 20200214
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047 Umetrics, Sweden - https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
Ultrapure water machine Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, China UPH-II-10T
Ultrasonic cleaner Kunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, China KH3200E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chen, C. R. Chinese Medicine Specimen Picture Book. , Shanghai World Book Company. Shanghai. 116 (1935).
  2. Xiong, J., et al. Lignans from the stems of Clematis armandii ("Chuan-Mu-Tong") and their anti-neuroinflammatory activities. Journal of Ethnopharmacology. 153 (3), 737-743 (2014).
  3. Pan, L. L., et al. a lignan from the Chinese medicinal plant Clematis armandii, inhibits A431 cell growth via blocking p70S6/S6 kinase pathway. Integrative Cancer Therapies. 16 (3), 351-359 (2017).
  4. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of The People's Republic of China: (Edition 2020). , The Medicine Science and Technology Press of China. China., Beijing. 38 (2020).
  5. Wang, D. G., Guo, J. L. Textual research on the materia medica and authenticity of Clematidis armandii. Lishizhen Medicine and Materia Medicine Research. 18 (11), 2696 (2007).
  6. Fang, Q. M., Zhang, M., Zhong, Y. Y. The natural resources and exploitation of Caulis Clematidis Armandii in Sichuan. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 20 (5), 404-406 (2005).
  7. Bai, M. N., Dai, Y. X., Wang, Y., Ren, Y. Y., Tan, R. Study on the identification of Caulis Clematidis Armandii. Research and Practice on Chinese Medicines. 31 (3), 13-16 (2017).
  8. Zhou, P. J., Li, X. F., Fu, D. H., Pu, X. Y., Zhu, G. Q. Pharmacognosy identification of Ethnomedicine Clematis ranunculoides Franchet. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 34 (3), 432-436 (2017).
  9. Guo, J. L., Tang, Y., Pei, J., Wang, D. G. Study on random amplified polymorphic DNA and sequence characterized amplified regions of Caulis Clematidis Armandii. Journal of Chengdu Medical College. 6 (4), 283-286 (2011).
  10. Liu, M. Z., Li, M. N., Yao, H., Liu, P. Molecular identification of Clematidis Armandii Caulis and its adulterants and closely related species by ITS2 sequence. Global Traditional Chinese Medicine. 4 (6), 446-450 (2011).
  11. Liu, J. J., Chen, X., Wei, Z. Q., Li, B. Chemical constituents and identification of the caules of Clematis armandii Franch.and Clematis montana Buch.-Ham. Natural Product Research and Development. 22 (6), 998-1000 (2010).
  12. Yang, T. R., Xu, Z., Shi, Y. N. Studies on four compounds from Clematis Montana. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine. 10 (4), 142-143 (2008).
  13. Yan, L. H., Xu, L. Z., Zhou, Z. M., Yang, S. L. Chemical constituents from stems of Clematis armandii(I). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 38 (3), 340-342 (2007).
  14. Li, X., et al. Traditional uses, phytochemistry, pharmacology, and toxicology of Akebiae Caulis and its synonyms: A review. Journal of Ethnopharmacology. 277, 114245 (2021).
  15. Ye, X., et al. Diuretic effect and material basis of Clematidis Armandii Caulis in rats. China Journal of Chinese Materia Medica. 44 (9), 1889-1894 (2019).
  16. Kuang, Y., et al. Consistency study of Caulis Clematidis Armandii and its traditionally used products and counterfeit species based on efficacy and pharmacognosy. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 36 (3), 115-121 (2020).
  17. Li, Y., et al. Quality assessment of Asarum heterotropoides var. mandshuricum based on HPLC multi-component determination and multiple pattern recognition method of fingerprint. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 238-243 (2022).
  18. Li, Y., et al. Determination of multi-components of Paeoniae Alba Radix based on fingerprints and chemical pattern recognition. Chinese Traditional and Herbal Drugs. 53 (1), 231-237 (2022).
  19. Li, H. H., et al. Comparative investigation for raw and processed products of Euodiae Fructus based on high-performance liquid chromatography fingerprints and chemical pattern recognition. Chemistry & Biodiversity. 18 (8), 2100281 (2021).
  20. Dong, L. J., et al. Study on suitable distribution areas of Kawa Kimichi produced in Sichuan province-based on remote sensing and GIS-A case study of Clematis Armandii. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 17 (11), 2398-2404 (2015).
  21. Tang, S. W., Pei, J., Li, F. Y. Morphological and histological identification of Chuanmutong. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 15 (1), 19-21 (2000).
  22. Li, B., Chen, X., Fang, Q. M., Zhang, B. J., Wei, Z. Q. Quality Research of Chuanmutong. Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine. 27 (6), 58-60 (2009).
  23. Wu, W. J., Wan, M. M., Cao, Y. H., Tan, R., Song, L. K. Research on the Quality Standard of Chuanmutong. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine. 33 (2), 313-315 (2015).
  24. Wei, Z. Q., Chen, X., Li, B., Dong, X. P. Determination of stigmasterol in Clematis armandii Franch and Clematis montana Buch-Ham. by HPLC. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 20 (3), 574-575 (2009).
  25. Qing, L. S., et al. Determination of oleanolic acid in Caulis clematidis armandii by HPLC. West China Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (3), 273-274 (2006).
  26. Yang, S. D., Wang, R., Fu, D. Y., Guo, J. J., Tan, W. Y. Determination on oleanolic acid in caulis clematidis armandii by microwave assisted extraction-HPLC/MS. Anhui Academy of Agricultural Sciences. 38 (13), 6929-6931 (2010).

Tags

Kjemi utgave 189 kjemisk fingeravtrykk multimønstergjenkjenning klyngeanalyse hovedkomponentanalyse ortogonal delvis minste kvadraters diskrimineringsanalyse kinesiske medisinske materialer Clematidis Armandii Caulis
HPLC kombinert med kjemisk fingeravtrykk for flermønstergjenkjenning for å identifisere ektheten til <em>Clematidis armandii Caulis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng,… More

Wang, F., Qian, Z., Liao, G., Zeng, J., Huang, D., Liu, Q., Xie, X. HPLC Coupled with Chemical Fingerprinting for Multi-Pattern Recognition for Identifying the Authenticity of Clematidis Armandii Caulis. J. Vis. Exp. (189), e64690, doi:10.3791/64690 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter