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Biology

ट्रांसपोसन गतिविधि पर IS200/IS605 परिवार-संबद्ध TNPB के प्रभावों का वास्तविक समय परिमाणीकरण

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64825
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2,3
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Microbiology Program, University of California, 3Biophysics Program, University of California
* These authors contributed equally

Summary

लाइव रियल-टाइम इमेजिंग करने के लिए एक प्रोटोकॉल को रेखांकित किया गया है ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि सहायक प्रोटीन टीएनपीबी व्यक्तिगत जीवित एस्चेरिचिया कोलाई कोशिकाओं में ट्रांसपोज़ेशन की गतिशीलता को कैसे प्रभावित करता है।

Abstract

यहां, एक प्रोटोकॉल को ट्रांसपोज़ेशन के लिए युग्मित फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के सूट का उपयोग करके जीवित जीवाणु कोशिकाओं में ट्रांसपोसेबल तत्व गतिविधि की लाइव, रीयल-टाइम इमेजिंग करने के लिए रेखांकित किया गया है। विशेष रूप से, यह दर्शाता है कि ट्रांसपोसेबल तत्व आईएस 608 की गतिविधि पर सहायक प्रोटीन टीएनपीबी के प्रभावों का आकलन करने के लिए वास्तविक समय इमेजिंग का उपयोग कैसे किया जा सकता है, जो ट्रांसपोसेबल तत्वों के आईएस 200 / आईएस 605 परिवार का सदस्य है। ट्रांसपोसेबल तत्वों का आईएस 200 / आईएस 605 परिवार प्रकृति में पाए जाने वाले सबसे असंख्य जीनों में से एक, टीएनपीबी से जुड़े प्रचुर मात्रा में मोबाइल तत्व हैं। अनुक्रम होमोलॉजी का प्रस्ताव है कि टीएनपीबी प्रोटीन सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 सिस्टम के लिए एक विकासवादी अग्रदूत हो सकता है। इसके अतिरिक्त, टीएनपीबी को नए सिरे से रुचि प्राप्त हुई है, जिसे कैस जैसे आरएनए-निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लिज़ के रूप में कार्य करने के लिए दिखाया गया है। IS608 की ट्रांसपोज़ेशन दरों पर TnpB के प्रभावों को परिमाणित किया जाता है, और यह प्रदर्शित किया जाता है कि IS608 के TNPB की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप TNPB अभिव्यक्ति की कमी वाली कोशिकाओं की तुलना में ~ 5x ट्रांसपोसन गतिविधि में वृद्धि होती है।

Introduction

ट्रांसपोसेबल तत्व (टीई) आनुवंशिक तत्व हैं जो जीनोमिक पुन: एकीकरण के बाद नकल को छांटने या उत्प्रेरित करके अपने मेजबान जीनोम के भीतर जुटाते हैं। टीई जीवन के सभी डोमेन में मौजूद हैं, और मेजबान जीनोम को ट्रांसपोज़िशन पुनर्गठित करता है, कोडिंग और नियंत्रणक्षेत्रों को परिवर्तित करता है। यह उत्परिवर्तन और विविधता उत्पन्न करता है जो विकास2,3, विकास 4,5, और कई मानव रोगों 6 में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें कैंसर 7 भी शामिल है।

फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के लिए ट्रांसपोजिशनल गतिविधि के कुछ पहलुओं को जोड़ने वाले नए आनुवंशिक निर्माणों का उपयोग करते हुए, हमारे पिछले काम ने बैक्टीरियल टीई आईएस 608 पर आधारित एक प्रयोगात्मक प्रणाली के विकास का वर्णन किया, जो टीई के व्यापक आईएस 200 / आईएस 605 परिवार का प्रतिनिधि है, जो व्यक्तिगत जीवित कोशिकाओं में ट्रांसपोज़ेशन के वास्तविक समय के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है8 (चित्रा 1)। टीई प्रणाली चित्रा 1 ए में प्रदर्शित किया गया है। टीई में ट्रांसपोसेस कोडिंग अनुक्रम, टीएनपीए शामिल है, जो लेफ्ट एंड (एलई) और राइट एंड (आरई) इम्परफेक्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट (आईपी) से घिरा हुआ है, जो टीएनपीए के लिए मान्यता और एक्सिशन साइटें हैं। टीएनपीए को प्रमोटर पीएलटीईटीओ 1 का उपयोग करके व्यक्त किया जाता है, जिसे टेट रिप्रेसर द्वारा दमित किया जाता है और यह एनहाइड्रोटेट्रासाइक्लिन (एटीसी) 9 के साथ इंड्यूसेबल होता है। टीई ब्लू रिपोर्टर एमसेरुलियन 3 11 के लिए एक संवैधानिक पीलासीक्यू 1 प्रमोटर10 के -10 और-35 अनुक्रमों को विभाजित करता है। जैसा कि चित्रा 1 सी में दिखाया गया है, जब टीएनपीए का उत्पादन प्रेरित होता है, तो टीई को उत्पादित किया जा सकता है, जिससे प्रमोटर पुनर्गठन होता है। उत्पादित कोशिका mCerulean3 और फ्लोरेसेस नीले रंग को व्यक्त करती है। टीएनपीए के एन-टर्मिनस को पीले रिपोर्टर वीनस12 से जोड़ा जाता है, जिससे पीले प्रतिदीप्ति द्वारा टीएनपीए स्तरों के माप की अनुमति मिलती है।

IS608 और IS200/IS605 ट्रांसपोसंस परिवार के अन्य सदस्य भी आमतौर पर अब तक अज्ञात फ़ंक्शन, tnpB13 के दूसरे जीन को एन्कोड करते हैं। टीएनपीबी प्रोटीन कई जीवाणु और आर्कियल टीई14,15 द्वारा एन्कोड किए गए न्यूक्लियस का एक जबरदस्त प्रचुर लेकिन अपूर्ण रूप से विशेषता वाला परिवार है, जिसमें अक्सर केवल टीएनपीबी16 होता है। इसके अलावा, हाल के अध्ययनों ने टीएनपीबी में रुचि को नवीनीकृत किया है, यह पाते हुए कि टीएनपीबी सीआरआईएसपीआर / सीएएस जैसे प्रोग्रामेबल आरएनए-निर्देशित एंडोन्यूक्लिज़ के रूप में कार्य करता है जो विभिन्न परिस्थितियों में डीएसडीएनए या एसएसडीएनए ब्रेक उत्पन्नकरेगा। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि ट्रांसपोज़िशन को विनियमित करने में टीएनपीबी क्या भूमिका निभा सकता है। आईएस 608 ट्रांसपोज़ेशन पर टीएनपीबी के प्रभावों का वास्तविक समय विज़ुअलाइज़ेशन करने के लिए, ट्रांसपोसन का एक संस्करण, जिसमें लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन एमचेरी के लिए एन-टर्मिनल संलयन के साथ टीएनपीबी का कोडिंग क्षेत्र शामिल है, बनाया गया था।

कुहलमैन लैब19 द्वारा किए गए अधिक विस्तृत थोक-स्तरीय अध्ययनों के पूरक के रूप में, यह यहां दिखाया गया है कि ट्रांसपोसन गतिविधि की वास्तविक समय इमेजिंग मात्रात्मक रूप से ट्रांसपोजिशनल गतिशीलता पर टीएनपीबी या किसी अन्य सहायक प्रोटीन के प्रभाव को कैसे प्रकट कर सकती है। टीएनपीबी को एमचेरी में फ्यूज करके, व्यक्तिगत ट्रांसपोजिशनल घटनाओं को नीले प्रतिदीप्ति द्वारा पहचाना जाता है और टीएनपीए (पीले प्रतिदीप्ति) और टीएनपीबी (लाल प्रतिदीप्ति) के अभिव्यक्ति स्तरों के साथ सहसंबद्ध किया जाता है।

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Protocol

1. बैक्टीरियल कल्चर की तैयारी

  1. ई कोलाई स्ट्रेन एमजी 1655 को प्लास्मिड ट्रांसपोसन संरचनाओं (पहले किम एट अल.8 में वर्णित) के साथ रात भर एलबी में उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं (25 μg / mL कानामाइसिन, सामग्री की तालिका देखें) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं।
    नोट: उपयोग किए गए निर्माणों के अनुक्रम और संबंधित अनुक्रम जेनबैंक20 परिग्रहण संख्या OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 और OP717085 के रूप में उपलब्ध हैं।
  2. स्थिर-अवस्था घातीय वृद्धि प्राप्त करने के लिए, पतला संस्कृतियां ≥एम 63 माध्यम (100 एमएम केएच2पीओ4, 1 एमएम एमजीएसओ4, 1.8 μM FeSO4, 15 mM [NH4]2SO4, 0.5 μg / mL थियामिन [विटामिन B1]) में 100 गुना कार्बन स्रोत (0.5% w / v ग्लूकोज यहां देखें) और उपयुक्त एंटीबायोटिक्स ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक हैं।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को विकसित करें जब तक कि 600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व ~ 0.2 तक नहीं पहुंच जाता। संस्कृतियां उपयोग के लिए तैयार हैं।

2. स्लाइड तैयारी

  1. अगारोस को पिघलाने के लिए माइक्रोवेव में 0.5% डब्ल्यू / वी ग्लूकोज और 1.5% डब्ल्यू / वी अगारोस के साथ एम 63 उबालकर एक स्लाइड तैयार करें और यह सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से पिघला हुआ और अच्छी तरह से मिश्रित है।
  2. एंटीबायोटिक्स और इंड्यूसर (25 μg / mL Kanamycin और 10 ng / μL एनहाइड्रोटेट्रासाइक्लिन [aTC], सामग्री की तालिका देखें) जोड़ने से पहले मिश्रण को ~ 55 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
  3. वर्कबेंच पर एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें। पहले के लंबवत दो और स्लाइड्स को स्टैक करें और नीचे की स्लाइड के समानांतर, शीर्ष पर एक और रखें। सुनिश्चित करें कि नीचे और शीर्ष स्लाइड के बीच एक स्लाइड मोटाई के बराबर अंतर है। एक छोटा जेल वर्ग बनाने के लिए धीरे-धीरे स्लाइड्स के बीच इस अंतर में एम 63 अगारोस मिश्रण का पिपेट ~ 1 एमएल।
  4. एक बार जेल जम जाने के बाद (~ 10-15 मिनट), इसे हटाने के लिए शीर्ष स्लाइड को स्लाइड करें। एगारोस पैड को रेजर ब्लेड या चाकू से ट्रिम करें। फिर संस्कृति (चरण 1.3) के 2.5 μL को पिपेट करें और कवरस्लिप को शीर्ष पर रखें।
  5. एपॉक्सी के साथ स्लाइड और कवरस्लिप के बीच की जगह को सील करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एपॉक्सी को सूखने दें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए अगारोस पैड पर बसने दें।

3. टाइमलैप्स फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी

  1. तैयार नमूने (चरण 1.3) को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें) एक वातावरण में गर्म और 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाए।
    1. छवि अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले कैमरे के लिए उपयुक्त एक्सपोज़र समय सेट करें। फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए रोशनी की तीव्रता समायोजित करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए 2 सेकंड का एक्सपोजर समय उपयोग किया गया था।
    2. प्रत्येक तरंगदैर्ध्य के लिए, न्यूनतम प्रतिदीप्ति युक्त एक फील्ड ऑफ व्यू (एफओवी) खोजें। पृष्ठभूमि घटाव के लिए विश्लेषण के दौरान उपयोग करने के लिए छवियां प्राप्त करें।
  2. विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर और नियमित समय अंतराल पर एक ग्रिड में छवियों को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल सेट करें।
    1. प्रोटोकॉल में टाइमलैप्स फोटोग्राफी को एन्कोड करें। अधिग्रहण आवृत्ति को वांछित समय अंतराल (यहां 20 मिनट) और कुल टाइमलैप्स अवधि को वांछित लंबाई (24 घंटे) पर सेट करें।
    2. प्रोटोकॉल में उपयुक्त तरंग दैर्ध्य को एन्कोड करें (उपयोग किए गए निर्माण के आधार पर)।
      नोट: एमचेरी उत्तेजना शिखर 587 एनएम पर है और उत्सर्जन शिखर 610 एनएम21 पर है; mVenus 515 nm और 527 nm12 पर है, जबकि mCerulean3 433 nm और 475 nm11 पर है।
    3. एफओवी की वांछित संख्या के बीच कैप्चर करने के लिए ग्रिड आकार सेट करें।
      नोट: यहां दिखाए गए प्रतिनिधि डेटा ने 8 x 8 एफओवी का उपयोग किया।

4. छवि विश्लेषण

  1. चरण 3.1.2 में प्राप्त संबंधित पृष्ठभूमि छवियों का उपयोग करके प्रत्येक रंग चैनल पर पृष्ठभूमि घटाव करें। सभी विश्लेषण चरणों के लिए, हम ओपन-सोर्स प्लेटफॉर्म फिजी22 में मानक मॉड्यूल का उपयोग करते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. mCerulean चैनल को थ्रेसहोल्ड करके और औसत सेल क्षेत्र से दहलीज क्षेत्र को विभाजित करके समय के प्रत्येक बिंदु पर कुल आबादी का अनुमान लगाएं।
  3. अद्वितीय छांटने की घटनाओं की गणना करने के लिए, mCerulean3 चैनल का समय व्युत्पन्न लें। mCerulean3 चैनल में क्रमिक छवियों को घटाकर ऐसा करें। प्रतिदीप्ति के उज्ज्वल फ्लैश के रूप में समय व्युत्पन्न में छांटने की घटनाओं का पता लगाया जाएगा।
    1. अवांछित प्रतिदीप्ति को खत्म करने के लिए एक्सिशन घटनाओं के ढेर को दहलीज करें। ध्यान दें कि यह प्रक्रिया स्वयं एक्सिशन के कुछ हिस्सों को सीमाबद्ध करेगी। इसे ठीक करने के लिए, एक्सिशन को उनके मूल आकार में पुनर्स्थापित करने के लिए छवियों को पतला करें।
      नोट: इसी तरह की थ्रेशोल्डिंग और छवि विश्लेषण तकनीकों का उपयोग करके विश्लेषण अन्य प्रतिदीप्ति चैनलों पर भी किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, ट्रांसपोसेस टीएनपीए [पीले शुक्र प्रतिदीप्ति] और टीएनपीबी [लाल एमचेरी फ्लोरेसेंस] के स्तर के साथ एक्सिशन घटनाओं को सहसंबंधित करें)।

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Representative Results

फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं में ट्रांसपोसन गतिविधि की कल्पना करने की यह विधि, जबकि थोक प्रतिदीप्ति माप की तुलना में कम थ्रूपुट है, व्यक्तिगत जीवित कोशिकाओं में ट्रांसपोसन गतिविधि के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती है। ट्रांसपोसन एक्सिशन घटनाओं के परिणामस्वरूप mCerulean3 (चित्रा 1) के लिए प्रमोटर का पुनर्गठन होता है, जिससे उज्ज्वल नीले प्रतिदीप्ति (चित्रा 2, TnpB +: पूरक मूवी 1 और TnpB-: पूरक मूवी 2) द्वारा ट्रांसपोसन गतिविधि से गुजरने वाली कोशिकाओं की पहचान की अनुमति मिलती है।

यह पाया गया है कि सहायक प्रोटीन TnpB (चित्रा 3, नारंगी) को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं उन लोगों की तुलना में ट्रांसपोसन गतिविधि के 4-5 गुना अधिक स्तर का अनुभव करती हैं जो नहीं करते हैं (चित्रा 3, नीला), अधिक विस्तृत थोक-स्तरीय अध्ययन19 के अनुरूप। यह विशेष रूप से उल्लेखनीय है क्योंकि एमचेरी-टीएनपीबी के कोडिंग अनुक्रम को शामिल करने से ट्रांसपोसन की लंबाई ~ 2,000 बीपी बढ़ जाती है, जबकि पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि आईएस 608 ट्रांसपोसन एक्सिशन ट्रांसपोसन लंबाई23 का तेजी से घटता कार्य है।

वास्तविक समय इमेजिंग का एक लाभ यह है कि एक बार पहचाने जाने के बाद, ट्रांसपोजिशनल घटनाओं से गुजरने वाली कोशिकाओं को अन्य विशिष्ट मापदंडों, जैसे विकास दर, फिटनेस प्रभावों के वितरण या एक्सेसरी प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर को निर्धारित करने के लिए ट्रैक और विश्लेषण किया जा सकता है ताकि ट्रांसपोजिशनल गतिविधि पर उनके प्रभाव को निर्धारित किया जा सके। उदाहरण के लिए, TnpB + कोशिकाओं में, ट्रांसपोसन एक्सिशन घटनाओं से गुजरने वाली कोशिकाओं में सामान्य आबादी की तुलना में mCherry-TnpB का उच्च अभिव्यक्ति स्तर होता है (चित्रा 4 ए)। इसके अलावा, एक्सिशन घटनाओं (चित्रा 4 बी, गहरे पीले) से गुजरने वाली कोशिकाओं के लिए, टीएनपीबी + कोशिकाएं (चित्रा 4 बी, नीचे) टीएनपीबी- कोशिकाओं (चित्रा 4 बी, शीर्ष) (टीएनपीबी - 158.3 ± 68.2 एयू, टीएनपीबी +: 193 ± 79.9 एयू) की तुलना में शुक्र-टीएनपीए ट्रांसपोसेस के केवल मामूली उच्च स्तर को व्यक्त करती हैं, जो सामान्य आबादी के पीले प्रतिदीप्ति से अधिक है (चित्रा 4 बी) , हल्का पीला)। एक साथ लिया गया, इन आंकड़ों से पता चलता है कि टीएनपीबी प्रोटीन ट्रांसपोजिशनल गतिविधि के देखे गए उच्च स्तर के लिए जिम्मेदार है।

Figure 1
चित्र 1: वास्तविक समय ट्रांसपोसन गतिशीलता की इमेजिंग के लिए आनुवंशिक संरचनाएं। (A) mCerulean3 प्रमोटर TE द्वारा बाधित होता है, जिसके छोर बाएं छोर और दाएं छोर दोषपूर्ण पैलिंड्रोमिक अनुक्रमों (LE IP और RE IP) से घिरे होते हैं। ट्रांसपोसेस, टीएनपीए (ग्रे), पीएलटीईटीओ 1 से व्यक्त किया जाता है, जिसे टेट रिप्रेसर (ग्रे) द्वारा विनियमित किया जाता है और यह एनहाइड्रोटेट्रासाइक्लिन (एसी) के साथ इंड्यूसेबल होता है। प्रमोटर/टीई जंक्शन और प्रमोटर -10 और -35 अनुक्रमों (लाल बक्से), और टीएनपीए दरार साइटों के अनुक्रम तीर द्वारा दिखाए जाते हैं। (बी) टीएनपीबी + निर्माण वह जगह है जहां एमचेरी-टीएनपीबी को ट्रांसक्रिप्शनल रूप से वीनस-टीएनपीए से जोड़ा गया है, जैसे कि दोनों को आईएस 608 के प्राकृतिक विन्यास की नकल करते हुए पॉलीसिस्ट्रोनिक एमआरएनए के रूप में स्थानांतरित किया जाता है। (सी) छांटने पर, mCerulean3 प्रमोटर की मरम्मत की जाती है, और सेल नीले प्रतिदीप्ति प्रदर्शित करता है। पुनर्गठित प्रमोटर अनुक्रम आरेख के नीचे प्रदर्शित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: ट्रांसपोसन एक्सिशन घटनाओं का विज़ुअलाइज़ेशन। नीले प्रतिदीप्ति द्वारा ट्रांसपोसन एक्सिशन घटनाओं का पता लगाने के तुरंत बाद कोशिकाओं (ए) के साथ टीएनपीबी + के दृश्य का उदाहरण क्षेत्र। सफेद तीर छांटने की घटनाओं का संकेत देते हैं। दो फ्रेम के बीच समय का अंतर 20 मिनट है। स्केल बार = 5 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: टीएनपीबी ट्रांसपोसन एक्सिशन दर को बढ़ाता है। TnpB+ कोशिकाओं (नारंगी) और TnpB- (नीली) कोशिकाओं के लिए छांटने की दर। तीन प्रतिकृतियों से औसत दर को 95% आत्मविश्वास अंतराल के साथ छायांकित क्षेत्रों वाले बिंदुओं के रूप में दिखाया गया है। डेटा को संरेखित किया जाता है ताकि कोशिकाएं टी = 0 पर एक्ससीज़िंग शुरू कर दें। TnpB+ कोशिकाओं के लिए अधिकतम मापित दर प्रति सेल प्रति घंटे 2.4 x 10-2 घटनाओं ± 5.1 थी, जबकि TnpB- के लिए प्रति सेल प्रति घंटे 0.48 x 10-2 घटनाओं ± 1.4 थी। दिखाए गए पूरे अंतराल पर औसत दर टीएनपीबी + कोशिकाओं के लिए प्रति सेल प्रति घंटे 2.6 ± 1.8 x 10-2 घटनाएं और टीएनपीबी- कोशिकाओं के लिए प्रति सेल प्रति घंटे 2.9 x 10-3 घटनाओं के ± 5.3 थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कुल सेल आबादी बनाम कोशिकाओं को निकालने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति के आंकड़े। प्रत्येक फ्रेम को 64 समान ब्लॉकों में विभाजित किया गया था, और प्रतिदीप्ति को ब्लॉक के भीतर और ब्लॉक के भीतर निहित सभी कोशिकाओं के लिए मापा गया था, भले ही छांटने की गतिविधि की परवाह किए बिना। संभाव्यता, जैसा कि वाई-अक्ष पर प्लॉट किया गया है, पिक्सेल की कुल संख्या से विभाजित प्रत्येक सेल प्रकार में संकेतित तीव्रता के पिक्सेल की संख्या के रूप में मापा जाता है। प्रत्येक फ्रेम के लिए ब्लॉक आकार 445 x 445 पिक्सेल पर सेट किया गया था। (ए) कोशिकाएं जो एक्सिशन घटनाओं (गहरे लाल) से गुजरती हैं, सामान्य आबादी (हल्के लाल) की तुलना में अधिक टीएनपीबी व्यक्त करती हैं। एक्सीसाइजिंग कोशिकाओं के लिए औसत लाल प्रतिदीप्ति 51.3 ± 15.4 एयू (गहरा लाल) थी, जबकि सभी कोशिकाओं के लिए 42.5 ± 7.4 एयू (हल्का लाल) था। (बी) वीनस-टीएनपीए ट्रांसपोसेस स्तर टीएनपीबी- (ऊपर) और टीएनपीबी + (नीचे) कोशिकाओं में समान हैं। डेटा सेट सामान्यीकृत होते हैं ताकि कुल सेल आबादी (हल्के पीले) के औसत पीले प्रतिदीप्ति 105.7 एयू पर टीएनपीबी + / - के बराबर हों। जिन कोशिकाओं को ट्रांसपोसन एक्सिशन घटनाओं (गहरे पीले) से गुजरने के रूप में पहचाना गया है, वे सामान्य आबादी की तुलना में उच्च पीले प्रतिदीप्ति का प्रदर्शन करते हैं, जिसमें टीएनपीबी- (ऊपर) और टीएनपीबी + (नीचे) के लिए समान वितरण होता है। एक्सीसाइजिंग आबादी के औसत पीले प्रतिदीप्ति टीएनपीबी-: 158.3 ± 68.2 एयू और टीएनपीबी +: 193 ± 79.9 एयू हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फिल्म 1: टीएनपीबी अभिव्यक्ति के साथ आईएस 608 की वास्तविक समय की गतिशीलता। वास्तविक समय आईएस 608 गतिशीलता के 5 घंटे के खंड को दिखाने वाली एक फिल्म; एक फ्रेम को हर 20 मिनट में कैप्चर किया जाता है। IS608 छांटना को उज्ज्वल नीले प्रतिदीप्ति के विकास के रूप में देखा जाता है। इस चलचित्र में दिखाए गए कक्षों में TnpB की अभिव्यक्ति शामिल है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फिल्म 2: टीएनपीबी अभिव्यक्ति के बिना आईएस 608 एक्सिशन की वास्तविक समय की गतिशीलता। वास्तविक समय आईएस 608 गतिशीलता के 5 घंटे के खंड को दिखाने वाली एक फिल्म; एक फ्रेम को हर 20 मिनट में कैप्चर किया जाता है। IS608 छांटना को उज्ज्वल नीले प्रतिदीप्ति के विकास के रूप में देखा जाता है। इस चलचित्र में दिखाए गए कक्षों में TnpB की अभिव्यक्ति शामिल नहीं है. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जीवित कोशिकाओं में ट्रांसपोसेबल तत्व गतिविधि की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए यहां प्रस्तुत अनूठी विधि एक संवेदनशील परख है जो सीधे जीवित कोशिकाओं में और वास्तविक समय में ट्रांसपोज़ेशन का पता लगा सकती है और इस गतिविधि को सहायक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ सहसंबंधित कर सकती है। जबकि थ्रूपुट थोक तरीकों से पूरा किया जा सकता है, यह विधि व्यक्तिगत जीवित कोशिकाओं में टीई गतिविधि और प्रोटीन अभिव्यक्ति के विस्तृत माप प्राप्त करती है।

वास्तविक समय इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप पर सीधे कोशिकाओं को विकसित करने के लिए विभिन्न प्रकार के उपकरण और तकनीकों को नियोजित किया जा सकता है। अगारोस पैड पर सेल विकास के यहां उपयोग की जाने वाली विधि में तेज, सस्ता और प्रदर्शन करने में आसान होने का लाभ है। सेलुलर विकास की स्थिति के आधार पर एक संभावित नुकसान यह है कि अगारोस पैड में सेल विकास का समर्थन करने के लिए उपलब्ध संसाधन सीमित हैं, और इसलिए कोशिकाएं स्वाभाविक रूप से इन संसाधनों को समाप्त कर देंगी और अपेक्षाकृत कम समय (12-24 घंटे) के बाद बढ़ना बंद कर देंगी। नतीजतन, कोशिकाओं को स्थिर अवस्था में विकास में तैयार करने और माप के लिए पर्याप्त समय देने के लिए कम घनत्व पर पैड को टीका लगाने के लिए सावधानी बरतनी चाहिए। माइक्रोफ्लुइडिक्स कोविस्तारित अवधि 24 के लिए स्थिर अवस्था घातीय वृद्धि में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए नियोजित किया जा सकता है, हालांकि इन विधियों को प्रभावी होने के लिए अतिरिक्त विशेषज्ञता, उपकरण और सेटअप की आवश्यकता होती है।

कुहलमैन लैब19 से अधिक विस्तृत कार्य के पूरक के रूप में, यह यहां चित्रित किया गया है कि आईएस 200/ आईएस 605 टीई परिवार से जुड़े प्रोटीन टीएनपीबी आईएस 608 छांटने की दर को पांच गुना तक बढ़ाता है, और यह कि बढ़ी हुई छांटना सीधे टीएनपीबी के उच्च अभिव्यक्ति स्तरों के साथ सहसंबद्ध है। ये विधियां बेहतर परख तकनीकों का एक उदाहरण हैं जो ट्रांसपोसन गतिविधि और उत्परिवर्तन और विकासवादी गतिशीलता पर इसके प्रभाव पर प्रकाश डालने में मदद कर सकती हैं।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस शोध के लिए वित्तीय सहायता कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय से स्टार्टअप फंड द्वारा प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 Ton Clear Epoxy Devcon 31345
Agarose Sigma-Aldrich 5066
Ammonium sulfate Sigma-Aldrich AX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919
Argon Laser Melles Griot 35-IMA-840-015
Blue Filter Cube Chroma Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
Eclipse Ti-E Microscope Nikon Discontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) Eppendorf North America Biotools 22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) Eppendorf North America Biotools 22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 g Fisher Scientific 706834
Fiji Fiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) Fisher Scientific BP9723-2 
Glass Cover Slide Fisher Scientific 12-542B 
Kanamycin Sulfate Sigma-Aldrich 1355006
Magnesium sulfate Cert Ac Fisher Scientific XXM63SP3KG
Microscope Heater World Precision Instruments 96810-1
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific 17001H
ProScan III Stage Prior
Red Filter Cube Chroma Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser Coherent 1170412
Slide, Microscope Fisher Scientific 125535B
Thiamine Hydrochloride Sigma-Aldrich (SIAL) T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch Nikon
Yellow Filter Cube Chroma Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जीव विज्ञान अंक 191
ट्रांसपोसन गतिविधि पर IS200/IS605 परिवार-संबद्ध TNPB के प्रभावों का वास्तविक समय परिमाणीकरण
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Worcester, M., Manoj, F., Kuhlman,… More

Worcester, M., Manoj, F., Kuhlman, T. E. Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity. J. Vis. Exp. (191), e64825, doi:10.3791/64825 (2023).

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