Summary
Ett protokoll beskrivs för att utföra live realtidsavbildning för att kvantifiera hur tillbehörsproteinet TnpB påverkar dynamiken i införlivandet i enskilda levande Escherichia coli-celler .
Abstract
Här beskrivs ett protokoll för att utföra levande realtidsavbildning av transponerbar elementaktivitet i levande bakterieceller med hjälp av en serie fluorescerande reportrar kopplade till införlivande. I synnerhet visar det hur realtidsavbildning kan användas för att bedöma effekterna av tillbehörsproteinet TnpB på aktiviteten hos det transponerbara elementet IS608, en medlem av IS200 / IS605-familjen av transponerbara element. IS200/IS605-familjen av transponerbara element är rikliga mobila element kopplade till en av de mest otaliga generna som finns i naturen, tnpB. Sekvenshomologier föreslår att TnpB-proteinet kan vara en evolutionär föregångare till CRISPR / Cas9-system. Dessutom har TnpB fått förnyat intresse, efter att ha visat sig fungera som ett Cas-liknande RNA-styrt DNA-endonukleas. Effekterna av TnpB på införlivandehastigheterna för IS608 kvantifieras, och det visas att uttrycket av TnpB av IS608 resulterar i ~ 5x ökad transposonaktivitet jämfört med celler som saknar TnpB-uttryck.
Introduction
Transponerbara element (TEs) är genetiska element som mobiliserar inom sina värdgenom genom excision eller katalyserar kopiering följt av genomisk återintegrering. TEs finns i alla livets domäner, och transponering omstrukturerar värdgenomet, muterar kodnings- och kontrollregioner1. Detta genererar mutationer och mångfald som spelar en viktig roll i evolution2,3, utveckling4,5 och flera mänskliga sjukdomar6, inklusive cancer7.
Med hjälp av nya genetiska konstruktioner som kopplar aspekter av transpositionell aktivitet till fluorescerande rapportörer beskrev vårt tidigare arbete utvecklingen av ett experimentellt system baserat på bakteriella TE IS608, en representant för den utbredda IS200 / IS605-familjen av TEs, som möjliggör visualisering i realtid av införlivande i enskilda levande celler8 (Figur 1). TE-systemet visas i figur 1A. TE består av transposaskodningssekvensen, tnpA, flankerad av vänster ände (LE) och höger ände (RE) ofullkomliga palindromiska upprepningar (IP), som är igenkännings- och excisionsställena för TnpA. tnpA uttrycks med hjälp av promotorn PLTetO1, som undertrycks av tet-repressorn och är inducerbar med anhydrotetracyklin (aTc)9. TE delar upp -10 och -35 sekvenserna av en konstitutiv PlacIQ1 promotor10 för den blå reportern mCerulean311. Som visas i figur 1C kan TE skäras ut när produktionen av tnpA induceras, vilket leder till promotorrekonstituering. Den producerade cellen uttrycker mCerulean3 och fluoresces blå. N-änden av TnpA smälts samman med den gula reportern Venus12, vilket möjliggör mätning av TnpA-nivåerna med gul fluorescens.
IS608 och andra medlemmar av IS200/IS605-familjen av transposoner kodar också vanligtvis för en andra gen av den hittills okända funktionen, tnpB13. TnpB-proteinerna är en oerhört riklig men ofullständigt karakteriserad familj av nukleaser kodade av flera bakteriella och arkeala TEs14,15, som ofta endast består av tnpB16. Dessutom har nyligen genomförda studier förnyat intresset för TnpB genom att finna att TnpB fungerar som ett CRISPR / Cas-liknande programmerbart RNA-styrt endonukleas som kommer att ge antingen dsDNA- eller ssDNA-brott under olika förhållanden17,18. Det är dock fortfarande oklart vilken roll TnpB kan spela för att reglera införlivandet. För att utföra realtidsvisualisering av effekterna av TnpB på IS608-införlivande skapades en version av transposonen, inklusive kodningsregionen för TnpB med en N-terminal fusion till det röda fluorescerande proteinet mCherry.
Som komplement till mer detaljerade studier på bulknivå utförda av Kuhlman-labbet19 visas här hur realtidsavbildning av transposonaktivitet kvantitativt kan avslöja effekten av TnpB eller andra tillbehörsproteiner på transpositionell dynamik. Genom att smälta samman TnpB till mCherry identifieras de enskilda transpositionshändelserna med blå fluorescens och korreleras med uttrycksnivåer av TnpA (gul fluorescens) och TnpB (röd fluorescens).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av bakteriekulturer
- Odla E. coli-stam MG1655 med plasmidtransposonkonstruktioner (tidigare beskrivna i Kim et al.8) över natten i LB med lämpliga antibiotika (25 μg/ml kanamycin, se materialtabell) vid 37 °C.
OBS: Sekvenserna för de använda konstruktionerna och de relaterade sekvenserna är tillgängliga som GenBank20-anslutningsnummer OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 och OP717085. - För att uppnå exponentiell tillväxt i stabilt tillstånd ≥ utspädda kulturer 100 gånger in i M63-mediet (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO4, 1,8 μM FeSO4, 15 mM [NH4]2 SO4, 0,5 μg/ml tiamin [vitamin B1]) kompletterat med en kolkälla (0,5% w/v glukos här) och lämpliga antibiotika (se materialförteckning).
- Odla kulturer vid 37 °C tills den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) når ~ 0,2. Kulturerna är redo att användas.
2. Förberedelse av glid
- Förbered en bild genom att koka M63 med 0,5% w / v glukos och 1,5% w / v agaros i mikrovågsugnen för att smälta agarosen och se till att den är helt smält och väl blandad.
- Låt blandningen svalna till ~55 °C innan antibiotika och inducerare tillsätts (25 μg/ml kanamycin och 10 ng/μl anhydrotetracyklin [aTc], se materialförteckning).
- Placera en mikroskopbild på arbetsbänken. Stapla ytterligare två bilder vinkelrätt mot den första och placera en annan överst, parallellt med den nedre bilden. Se till att det finns ett mellanrum som är lika med en glidtjocklek mellan botten och övre bilden. Pipett ~ 1 ml av M63-agarosblandningen i detta mellanrum mellan glasen långsamt för att skapa en liten gelkvadrat.
- När gelén har stelnat (~ 10-15 min), skjut den övre bilden för att ta bort den. Trimma agaroskudden med ett rakblad eller kniv. Pipettera sedan 2,5 μL av kulturen (steg 1.3) och lägg täckglaset ovanpå.
- Försegla utrymmet mellan bilden och täckglaset med epoxi (se Materialförteckning). Låt epoxin torka och cellerna sätta sig på agarosdynan i minst 1 timme vid 37 °C.
3. Timelapse fluorescensmikroskopi
- Placera det beredda provet (steg 1.3) på ett fluorescensmikroskop (se materialtabellen) i en miljö som värms upp och hålls vid 37 °C.
- Ställ in de exponeringstider som är lämpliga för kameran som används för bildinsamling. Justera belysningsintensiteten för att minimera fotoblekning.
OBS: En exponeringstid på 2 s för varje våglängd användes för denna studie. - För varje våglängd, hitta ett synfält (FOV) som innehåller minimal fluorescens. Hämta bilder som ska användas under analysen för bakgrundssubtraktion.
- Ställ in de exponeringstider som är lämpliga för kameran som används för bildinsamling. Justera belysningsintensiteten för att minimera fotoblekning.
- Ställ in ett protokoll för att hämta bilder i ett rutnät med olika våglängder och med jämna tidsintervall.
- Koda in timelapse-fotografering i protokollet. Ställ in förvärvsfrekvensen till önskat tidsintervall (20 min här) och den totala timelapse-varaktigheten till önskad längd (24 h).
- Koda in lämpliga våglängder i protokollet (beroende på vilken konstruktion som används).
OBS: mCherry excitationstoppen är vid 587 nm och utsläppstoppen vid 610 nm21; mVenus är vid 515 nm och 527 nm12, medan mCerulean3 är vid 433 nm och 475 nm11. - Ställ in rutnätsstorleken för att fånga mellan önskat antal FOV: er.
OBS: De representativa data som visas här använde 8 x 8 FOV.
4. Bildanalys
- Utför bakgrundssubtraktion på varje färgkanal med hjälp av respektive bakgrundsbilder som förvärvades i steg 3.1.2. För alla analyssteg använder vi standardmoduler i open source-plattformen Fiji22 (se Materialförteckning).
- Approximera den totala populationen vid varje tidpunkt genom att tröskel mCerulean-kanalen och dividera tröskelområdet med det genomsnittliga cellområdet.
- För att räkna de unika excisionshändelserna, ta tidsderivatet av mCerulean3-kanalen. Utför detta genom att subtrahera på varandra följande bilder i mCerulean3-kanalen. Excisionshändelserna kommer att detekteras i tidsderivatet som en ljus blixt av fluorescens.
- Tröskel stacken av excisionshändelser för att eliminera oönskad fluorescens. Observera att denna process kommer att begränsa delar av själva excisionerna. För att åtgärda detta, utvidga bilderna för att återställa excisionerna till sina ursprungliga storlekar.
OBS: Analyser med liknande tröskel- och bildanalystekniker kan också utföras på de andra fluorescenskanalerna (t.ex. korrelera excisionshändelser med nivåer av transposas TnpA [gul Venus-fluorescens] och TnpB [röd mCherry-fluorescens].
- Tröskel stacken av excisionshändelser för att eliminera oönskad fluorescens. Observera att denna process kommer att begränsa delar av själva excisionerna. För att åtgärda detta, utvidga bilderna för att återställa excisionerna till sina ursprungliga storlekar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod för att visualisera transposonaktivitet i levande celler genom fluorescensmikroskopi, samtidigt som den har lägre genomströmning än bulkfluorescensmätningar, möjliggör direkt visualisering av transposonaktivitet i enskilda levande celler. Transposon excisionshändelser resulterar i rekonstituering av promotorn för mCerulean3 (figur 1), vilket möjliggör identifiering av celler som genomgår transposonaktivitet genom ljusblå fluorescens (figur 2, TnpB+: kompletterande film 1 och TnpB-: kompletterande film 2).
Det har visat sig att celler som uttrycker tillbehörsproteinet TnpB (figur 3, orange) upplever 4-5 gånger högre nivåer av transposonaktivitet jämfört med de som inte gör det (figur 3, blå), i överensstämmelse med de mer detaljerade bulknivåstudierna19. Detta är särskilt anmärkningsvärt eftersom införandet av kodningssekvensen för mCherry-tnpB ökar transposonens längd med ~ 2,000 bp, medan tidigare studier har funnit att IS608 transposon excision är en exponentiellt minskande funktion av transposonlängd23.
En fördel med realtidsavbildning är att när de väl har identifierats kan celler som genomgår transpositionshändelser spåras och analyseras ytterligare för att bestämma andra karakteristiska parametrar, såsom tillväxthastighet, för att bestämma fördelningen av fitnesseffekter eller uttrycksnivån för tillbehörsproteiner för att bestämma deras inverkan på transpositionsaktivitet. I TnpB+-celler har till exempel celler som genomgår transposonexcisionshändelser högre uttrycksnivåer av mCherry-TnpB än den allmänna populationen (figur 4A). För celler som genomgår excisionshändelser (figur 4B, mörkgul) uttrycker TnpB+-celler (figur 4B, nederst) dessutom endast marginellt högre nivåer av Venus-TnpA-transposas än TnpB-celler (figur 4B, överst) (TnpB- 158,3 ± 68,2 AU, TnpB+: 193 ± 79,9 AU), vilket är högre än den gula fluorescensen hos den allmänna befolkningen (figur 4B , ljusgul). Sammantaget tyder dessa data på att TnpB-protein är ansvarigt för de observerade högre nivåerna av transpositionell aktivitet.
Figur 1: Genetiska konstruktioner för avbildning av realtidstransposondynamik. (A) mCerulean3-promotorn störs av TE, vars ändar flankeras av vänster ände och höger ände felaktiga palindromiska sekvenser (LE IP och RE IP). Transposaset, tnpA (grått), uttrycks från PLtetO1, som regleras av tet-repressorn (grå) och är inducerbar med anhydrotetracyklin (aTc). Sekvenserna för Promoter/TE-korsningen och promotorn -10 och -35 sekvenser (röda rutor) och TnpA-klyvningsplatser visas med pilar. (B) TnpB+-konstruktionen är där mCherry-tnpB har transkriptionellt smälts samman till venus-tnpA så att båda transkriberas som ett polycistroniskt mRNA, vilket efterliknar den naturliga konfigurationen av IS608. (C) Vid excision repareras mCerulean3-promotorn och cellen uppvisar blå fluorescens. Den rekonstituerade promotorsekvensen visas under diagrammet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Visualisering av transposon excisionshändelser. Exempelfältet för TnpB+ med celler (A) omedelbart före och (B) efter detektion av transposonexcisionshändelser genom blå fluorescens. Vita pilar indikerar excisionshändelser. Tidsskillnaden mellan de två ramarna är 20 min. Skalstreck = 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: TnpB förbättrar transposon excisionshastigheten. Excisionshastigheten för TnpB+-celler (orange) och TnpB- (blå) celler. Medelhastigheten från tre replikat visas som punkter med skuggade regioner med ett konfidensintervall på 95 %. Data justeras så att cellerna börjar excitera vid t = 0. Den maximala uppmätta hastigheten för TnpB+-celler var 5,1 ± 2,4 x 10-2 händelser per cell och timme, medan för TnpB- var 1,4 ± 0,48 x 10-2 händelser per cell och timme. Medelhastigheten under hela intervallet som visades var 2,6 ± 1,8 x 10-2 händelser per cell per timme för TnpB+-celler och 5,3 ± 2,9 x 10-3 händelser per cell och timme för TnpB-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Proteinuttrycksstatistik för excising av celler jämfört med den totala cellpopulationen. Varje ram delades in i 64 lika stora block, och fluorescens mättes för celler som exciserade inom blocket och för alla celler som finns i blocket oavsett excisionsaktiviteten. Sannolikheten, som plottas på y-axeln, mäts som antalet pixlar med den angivna intensiteten i varje celltyp dividerat med det totala antalet pixlar. Blockstorleken för varje ram var inställd på 445 x 445 pixlar. (A) De celler som genomgår excisionshändelser (mörkröd) uttrycker mer TnpB än den allmänna befolkningen (ljusröd). Den genomsnittliga röda fluorescensen för excisingceller var 51,3 ± 15,4 AU (mörkröd), medan den för alla celler var 42,5 ± 7,4 AU (ljusröd). (B) Venus-TnpA-transposasnivåerna är likartade i TnpB- (överst) och TnpB + (nedre) celler. Datamängderna normaliseras så att de genomsnittliga gula fluorescenserna för den totala cellpopulationen (ljusgul) är lika för TnpB+/- vid 105,7 AU. De celler som har identifierats som genomgår transposon excisionshändelser (mörkgul) uppvisar högre gul fluorescens än den allmänna befolkningen, med liknande fördelningar för TnpB- (överst) och TnpB+ (botten). Genomsnittliga gula fluorescenser av de exciserande populationerna är TnpB-: 158,3 ± 68,2 AU och TnpB+: 193 ± 79,9 AU. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande film 1: Realtidsdynamik i IS608-excision med TnpB-uttryck. En film som visar ett 5 timmars segment av IS608-dynamik i realtid; en ram fångas var 20: e minut. IS608 excision visualiseras som utvecklingen av ljusblå fluorescens. Cellerna som visas i den här filmen inkluderar uttrycket av TnpB. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande film 2: Realtidsdynamik för IS608-excision utan TnpB-uttryck. En film som visar ett 5 timmars segment av IS608-dynamik i realtid; en ram fångas var 20: e minut. IS608 excision visualiseras som utvecklingen av ljusblå fluorescens. Cellerna som visas i den här filmen innehåller inte uttrycket av TnpB. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den unika metoden som presenteras här för realtidsavbildning av transponerbar elementaktivitet i levande celler är en känslig analys som direkt kan detektera transponering i levande celler och i realtid och korrelera denna aktivitet med uttrycket av tillbehörsproteiner. Medan genomströmningen är lägre än vad som kan åstadkommas med bulkmetoder, uppnår denna metod detaljerade mätningar av TE-aktivitet och proteinuttryck i enskilda levande celler.
En mängd olika verktyg och tekniker kan användas för att odla celler direkt på mikroskopet för realtidsavbildning. Metoden som används här för celltillväxt på agaroskuddar har fördelen att den är snabb, billig och enkel att utföra. En möjlig nackdel, beroende på det cellulära tillväxttillståndet av intresse, är att resurser som är tillgängliga för att stödja celltillväxt i agarosplattan är begränsade, och därför kommer celler naturligt att uttömma dessa resurser och sluta växa efter en relativt kort tidsperiod (12-24 h). Följaktligen måste man se till att förbereda cellerna i steady state-tillväxt och inokulera dynan med en tillräckligt låg densitet för att ge gott om tid för mätning. Mikrofluidik kan användas för att upprätthålla celler i exponentiell tillväxt i steady state under längre tidsperioder24, även om dessa metoder kräver ytterligare expertis, utrustning och installation för att vara effektiva.
Som komplement till mer detaljerat arbete från Kuhlman lab19 illustreras här att IS200/IS605 TE-familjeassocierade proteinet TnpB ökar hastigheten för IS608-excision med upp till fem gånger, och att ökad excision är direkt korrelerad med högre uttrycksnivåer av TnpB. Dessa metoder är ett exempel på förbättrade analystekniker som kan hjälpa till att belysa transposonaktivitet och dess inverkan på mutations- och evolutionsdynamik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Ekonomiskt stöd för denna forskning tillhandahölls av startfonder från University of California.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
- Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
- Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
- Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
- Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
- Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
- Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
- Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
- Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
- Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
- Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
- Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
- Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
- Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).
