Summary
보조 단백질 TnpB가 개별 살아있는 대장균 세포의 전이 역학에 어떻게 영향을 미치는지 정량화하기 위해 실시간 이미징을 수행하는 프로토콜이 요약되어 있습니다.
Abstract
여기서, 프로토콜은 전치에 결합된 형광 리포터 제품군을 사용하여 살아있는 박테리아 세포에서 전치 가능한 요소 활성의 실시간 이미징을 수행하는 것으로 요약됩니다. 특히, 실시간 이미징을 사용하여 보조 단백질 TnpB가 전치 가능한 요소의 IS200/IS605 제품군에 속하는 전치 가능한 요소 IS608의 활성에 미치는 영향을 평가하는 방법을 보여줍니다. IS200/IS605 전치 가능한 요소 계열은 자연에서 발견되는 가장 무수한 유전자 중 하나인 tnpB와 연결된 풍부한 이동 요소입니다. 서열 상동성은 TnpB 단백질이 CRISPR/Cas9 시스템의 진화적 전구체일 수 있음을 시사한다. 또한, TnpB는 Cas-유사 RNA 유도 DNA 엔도뉴클레아제로서 작용하는 것으로 밝혀져 새로운 관심을 받았다. IS608의 전이 속도에 대한 TnpB의 효과가 정량화되고, IS608의 TnpB의 발현이 TnpB 발현이 부족한 세포에 비해 ~ 5 배 증가 된 트랜스포존 활성을 초래한다는 것이 입증되었다.
Introduction
전치 가능한 요소(TE)는 절제 또는 촉매 복제에 이어 게놈 재통합에 의해 숙주 게놈 내에서 동원되는 유전 요소입니다. TE는 생명의 모든 영역에 존재하며, 전위는 숙주 게놈을 재구성하여 코딩 및 제어 영역을 돌연변이시킵니다1. 이것은 진화 2,3, 발달 4,5 및 암7을 포함한 여러 인간 질병6에서 중요한 역할을 하는 돌연변이와 다양성을 생성합니다.
전위 활성의 측면을 형광 리포터와 결합하는 새로운 유전자 구조를 사용하여 이전 연구에서는 광범위한 IS200/IS605 TE제품군을 대표하는 박테리아 TE IS608을 기반으로 개별살아있는 세포8에서 전이를 실시간으로 시각화할 수 있는 실험 시스템의 개발에 대해 설명했습니다(그림 1). TE 시스템은 그림 1A에 표시되어 있습니다. TE는 TnpA에 대한 인식 및 절제 부위인 좌측 말단(LE) 및 우단(RE) 불완전 회문 반복(IP)에 의해 측면에 있는 트랜스포아제 코딩 서열 tnpA를 포함한다. tnpA는 프로모터 PLTetO1을 사용하여 발현되며, 이는 tet 억제 자에 의해 억제되고 안하이드로 테트라 사이클린 (aTc)9로 유도 될 수 있습니다. TE는 청색 리포터 mCerulean3 11에 대해 구성적PlacIQ1 프로모터 10의 -10 및 -35 서열을 분할한다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, tnpA의 생산이 유도될 때, TE는 절제될 수 있고, 프로모터 재구성을 유도할 수 있다. 생성 된 세포는 mCerulean을 발현합니다.3 그리고 청색 형광. TnpA의 N- 말단은 황색 리포터 Venus12에 융합되어 황색 형광으로 TnpA 수준을 측정 할 수 있습니다.
IS608 및 트랜스포존의 IS200/IS605 패밀리의 다른 구성원은 또한 전형적으로 지금까지 알려지지 않은 기능의 제2 유전자인 tnpB13을 암호화한다. TnpB 단백질은 엄청나게 풍부하지만 불완전하게 특성화된 뉴클레아제 계열이며, 이는 종종 tnpB16으로만 구성되는 여러 박테리아 및 고고학 TEs14,15에 의해 암호화됩니다. 또한, 최근 연구는 TnpB가 다양한 조건에서 dsDNA 또는 ssDNA 절단을 생성하는 CRISPR / Cas와 같은 프로그래밍 가능한 RNA 유도 엔도 뉴 클레아 제로서 기능한다는 것을 발견함으로써 TnpB에 대한 관심을 새롭게했습니다17,18. 그러나 TnpB가 전치를 조절하는 데 어떤 역할을 할 수 있는지는 불분명합니다. IS608 전치에 대한 TnpB의 효과에 대한 실시간 시각화를 수행하기 위해 적색 형광 단백질 mCherry에 대한 N- 말단 융합을 갖는 TnpB의 코딩 영역을 포함하는 트랜스포존 버전이 생성되었습니다.
Kuhlman 실험실19에 의해 수행된보다 상세한 벌크 레벨 연구를 보완하여, 트랜스포존 활성의 실시간 이미징이 TnpB 또는 다른 보조 단백질이 전위 역학에 미치는 영향을 정량적으로 밝힐 수있는 방법을 보여줍니다. TnpB를 mCherry에 융합시킴으로써, 개별 전위 사건은 청색 형광에 의해 식별되고 TnpA (황색 형광) 및 TnpB (적색 형광)의 발현 수준과 상관 관계가 있습니다.
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Protocol
1. 세균 배양의 제조
- 플라스미드 트랜스포존 구축물(Kim et al.8에 이전에 기술됨)로 대장균 균주 MG1655를 LB에서 적절한 항생제(카나마이신 25μg/mL, 재료 표 참조)와 함께 37°C에서 밤새 성장시킵니다.
참고: 사용된 구축물의 서열 및 관련 서열은 GenBank20 수탁 번호 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 및 OP717085로서 입수가능하다. - 정상 상태 기하 급수적 인 성장을 달성하기 위해, 탄소원 (0.5 % w / v 포도당 여기) 및 적절한 항생제 (재료 표 참조)가 보충 된 M63 배지 (100 mM KH2PO4, 1 mM MgSO 4, 1.8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4] 2SO 4, 0.5 μg / mL 티아민 [비타민 B1])로 배양물을 희석 ≥100 배).
- 37nm(OD600)의 광학 밀도가 ~0.2에 도달할 때까지 600°C에서 배양물을 성장시킵니다. 문화는 사용할 준비가되었습니다.
2. 슬라이드 준비
- 마이크로파에서 M63을 0.5% w/v 포도당과 1.5% w/v 아가로스로 끓여 슬라이드를 준비하여 아가로스를 녹이고 완전히 녹고 잘 혼합되도록 합니다.
- 항생제와 유도제 (25 μg / mL 카나마이신 및 10 ng / μL 무수 테트라 사이클린 [aTc], 재료 표 참조)를 추가하기 전에 혼합물을 ~ 55 ° C로 식히십시오.
- 작업대에 현미경 슬라이드를 놓습니다. 첫 번째 슬라이드에 수직으로 두 개의 슬라이드를 더 쌓고 아래쪽 슬라이드와 평행하게 다른 슬라이드를 맨 위에 놓습니다. 아래쪽 슬라이드와 위쪽 슬라이드 사이에 슬라이드 두께 1개와 같은 간격이 있는지 확인합니다. M63 아가로스 혼합물의 ~1 mL를 슬라이드 사이의 이 틈에 천천히 넣어 작은 젤 사각형을 만듭니다.
- 젤이 굳어지면(~10-15분) 상단 슬라이드를 밀어 제거합니다. 면도날이나 칼로 아가 로스 패드를 다듬습니다. 배양물 2.5 μL를 피펫팅한 다음(단계 1.3) 커버슬립을 그 위에 올려놓는다.
- 슬라이드와 커버슬립 사이의 공간을 에폭시로 밀봉하십시오( 재료 표 참조). 에폭시를 건조시키고 세포를 37°C에서 최소 1시간 동안 아가로스 패드 상에 침전시킨다.
3. 타임랩스 형광 현미경
- 준비된 샘플(단계 1.3)을 37°C로 가열 및 유지되는 환경에서 형광 현미경( 재료 표 참조) 상에 놓습니다.
- 이미지 획득에 사용되는 카메라에 적합한 노출 시간을 설정합니다. 광퇴색을 최소화하기 위해 조명 강도를 조정합니다.
참고: 각 파장에 대해 2초의 노출 시간이 본 연구에 사용되었습니다. - 각 파장에 대해 최소 형광을 포함하는 시야(FOV)를 찾습니다. 배경 빼기를 위해 분석 중에 사용할 이미지를 획득합니다.
- 이미지 획득에 사용되는 카메라에 적합한 노출 시간을 설정합니다. 광퇴색을 최소화하기 위해 조명 강도를 조정합니다.
- 서로 다른 파장과 일정한 시간 간격으로 그리드에서 이미지를 수집하도록 프로토콜을 설정합니다.
- 타임랩스 사진을 프로토콜로 인코딩합니다. 획득 빈도를 원하는 시간 간격(여기서는 20분)으로 설정하고 총 타임랩스 기간을 원하는 길이(24시간)로 설정합니다.
- 적절한 파장을 프로토콜로 인코딩합니다(사용된 구성에 따라 다름).
참고: mCherry 여기 피크는 587nm이고 방출 피크는 610nm21입니다. mVenus는 515nm 및 527nm12에 있는 반면 mCerulean3은 433nm 및 475nm11에 있습니다. - 원하는 FOV 수 사이에서 캡처할 그리드 크기를 설정합니다.
참고: 여기에 표시된 대표 데이터는 8 x 8 FOV를 사용했습니다.
4. 이미지 분석
- 3.1.2단계에서 획득한 각 배경 이미지를 사용하여 각 색상 채널에서 배경 빼기를 수행합니다. 모든 분석 단계에서 오픈 소스 플랫폼 Fiji22 의 표준 모듈을 사용합니다 ( 재료 표 참조).
- mCerulean 채널을 임계값화하고 임계값 영역을 평균 셀 영역으로 나누어 각 시점의 총 모집단을 근사화합니다.
- 고유한 절제 이벤트를 계산하려면 mCerulean3 채널의 시간 미분을 취하십시오. mCerulean3 채널에서 연속 이미지를 빼서 이 작업을 수행합니다. 절제 이벤트는 시간 미분에서 형광의 밝은 섬광으로 감지됩니다.
- 원치 않는 형광을 제거하기 위해 절제 이벤트의 스택을 임계값으로 설정합니다. 이 과정은 절제 자체의 일부를 임계 값으로 표시합니다. 이 문제를 해결하려면 이미지를 확장하여 절제를 원래 크기로 복원하십시오.
참고: 유사한 임계값 및 이미지 분석 기술을 사용하는 분석은 다른 형광 채널에서도 수행할 수 있습니다(예: 절제 이벤트를 트랜스포아제 TnpA[노란색 금성 형광] 및 TnpB[빨간색 mCherry 형광] 수준과 상관 관계).
- 원치 않는 형광을 제거하기 위해 절제 이벤트의 스택을 임계값으로 설정합니다. 이 과정은 절제 자체의 일부를 임계 값으로 표시합니다. 이 문제를 해결하려면 이미지를 확장하여 절제를 원래 크기로 복원하십시오.
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Representative Results
형광 현미경으로 살아있는 세포에서 트랜스포존 활성을 시각화하는 이 방법은 벌크 형광 측정보다 처리량이 낮기 때문에 개별 살아있는 세포에서 트랜스포존 활성을 직접 시각화할 수 있습니다. 트랜스포존 절제 이벤트는 mCerulean3에 대한 프로모터의 재구성을 초래하여(그림 1), 밝은 파란색 형광에 의해 트랜스포존 활성을 받는 세포를 식별할 수 있습니다(그림 2, TnpB+: 보충 영화 1 및 TnpB-: 보충 영화 2).
보조 단백질 TnpB (그림 3, 주황색)를 발현하는 세포는 그렇지 않은 세포에 비해 4-5 배 더 높은 수준의 트랜스포존 활성을 경험하는 것으로 나타났습니다 (그림 3, 파란색), 보다 상세한 벌크 수준 연구19와 일치합니다. 이것은 mCherry-tnpB의 코딩 서열을 포함하면 트랜스포존의 길이가 ~ 2,000 bp 증가하는 반면, 이전 연구에서는 IS608 트랜스포존 절제가 트랜스포존 길이23의 기하 급수적으로 감소하는 기능이라는 것을 발견했기 때문에 특히 주목할 만하다.
실시간 이미징의 장점은 일단 식별되면 전위 이벤트를 겪는 세포를 추가로 추적하고 분석하여 성장 속도와 같은 다른 특성 매개 변수를 결정하여 적합성 효과의 분포 또는 보조 단백질의 발현 수준을 결정하여 전위 활성에 미치는 영향을 결정할 수 있다는 것입니다. 예를 들어, TnpB+ 세포에서 트랜스포존 절제 이벤트를 받는 세포는 일반 집단보다 mCherry-TnpB의 발현 수준이 더 높습니다(그림 4A). 또한, 절제 이벤트(그림 4B, 진한 노란색)를 겪는 세포의 경우 TnpB+ 세포(그림 4B, 하단)는 TnpB-세포(그림 4B, 상단)보다 약간 더 높은 수준의 Venus-TnpA 트랜스포아제만 발현합니다(TnpB- 158.3 ± 68.2 AU, TnpB+: 193 ± 79.9 AU), 이는 일반 인구의 노란색 형광보다 높습니다(그림 4B , 밝은 노란색). 종합하면, 이들 데이터는 TnpB 단백질이 관찰된 더 높은 수준의 전위 활성을 담당한다는 것을 시사한다.
그림 1: 실시간 트랜스포존 역학의 이미징을 위한 유전적 구조. (A) mCerulean3 프로모터는 TE에 의해 교쇄되고, 그 말단은 좌측 말단 및 우측 말단 결함 회문 서열 (LE IP 및 RE IP)에 의해 측면에있다. 전이 효소 인 tnpA (회색)는 PLtetO1에서 표현되며, 이는 tet 억제 기 (회색)에 의해 조절되고 무수 테트라 사이클린 (aTc)으로 유도 될 수 있습니다. 프로모터/TE 접합 및 프로모터 -10 및 -35 서열(빨간색 상자) 및 TnpA 절단 부위의 서열은 화살표로 표시됩니다. (B) TnpB+ 구조체는 mCherry-tnpB가 금성-tnpA에 전사적으로 융합되어 둘 다 IS608의 자연 구성을 모방한 폴리시스트로닉 mRNA로 전사되는 곳입니다. (C) 절제시, mCerulean3 프로모터가 복구되고, 세포는 청색 형광을 나타낸다. 재구성된 프로모터 서열이 다이어그램 아래에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 트랜스포존 절제 이벤트의 시각화. TnpB+의 예제 시야는 파란색 형광으로 트랜스포존 절제 이벤트를 검출하기 직전과 직후(B)의 세포가 있는 것입니다. 흰색 화살표는 절제 이벤트를 나타냅니다. 두 프레임 간의 시간 차이는 20분입니다. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: TnpB는 트랜스포존 절제 속도를 향상시킵니다. TnpB+ 세포(주황색) 및 TnpB-(파란색) 세포의 절제 속도입니다. 세 번의 반복실험의 평균 비율은 95% 신뢰 구간의 음영처리된 영역이 있는 점으로 표시됩니다. 데이터는 세포가 t = 0에서 절제를 시작하도록 정렬됩니다. TnpB+ 셀에 대한 최대 측정 속도는 시간당 셀당 5.1 ± 2.4 x 10-2 이벤트인 반면, TnpB-의 경우 시간당 셀당 1.4 ± 0.48 x 10-2 이벤트였습니다. 표시된 전체 간격에 대한 평균 속도는 TnpB+ 세포의 경우 시간당 세포당 2.6 ± 1.8 x 10-2 이벤트였고 TnpB± 경우 시간당 세포당 5.3 x 10-3 이벤트였습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 절제 세포 대 전체 세포 집단에 대한 단백질 발현 통계. 각 프레임을 64개의 동일한 블록으로 나누고, 절제 활성에 관계없이 블록 내에서 절제하는 세포 및 블록 내에 포함된 모든 세포에 대해 형광을 측정하였다. y축에 표시된 확률은 각 셀 유형에서 표시된 강도의 픽셀 수를 총 픽셀 수로 나눈 값으로 측정됩니다. 각 프레임의 블록 크기는 445 x 445 픽셀로 설정되었습니다. (A) 절제 사건 (진한 빨간색)을받는 세포는 일반 집단 (밝은 빨간색)보다 더 많은 TnpB를 발현합니다. 절제 세포에 대한 평균 적색 형광은 51.3 ± 15.4 AU (진한 빨간색)이었고 모든 세포에 대한 적색 형광은 42.5 ± 7.4 AU (밝은 빨간색)였습니다. (B) 비너스-TnpA 트랜스포아제 수준은 TnpB-(상단) 및 TnpB+(하단) 세포에서 유사합니다. 데이터 세트는 총 세포 집단(밝은 노란색)의 평균 노란색 형광이 105.7AU에서 TnpB+/-에 대해 동일하도록 정규화됩니다. 트랜스포존 절제 사건(진한 노란색)을 겪는 것으로 확인된 세포는 TnpB-(상단) 및 TnpB+(하단)에 대해 유사한 분포를 보이며 일반 집단보다 더 높은 노란색 형광을 나타냅니다. 절제 집단의 평균 황색 형광은 TnpB-: 158.3 ± 68.2 AU 및 TnpB+: 193 ± 79.9 AU입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 동영상 1: TnpB 발현을 이용한 IS608 절제의 실시간 동역학. 실시간 IS608 다이내믹스의 5시간 세그먼트를 보여주는 영화; 프레임은 20분마다 캡처됩니다. IS608 절제는 밝은 파란색 형광의 발달로 시각화됩니다. 이 동영상에 표시된 셀에는 TnpB의 발현이 포함됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 동영상 2: TnpB 발현이 없는 IS608 절제의 실시간 동역학. 실시간 IS608 다이내믹스의 5시간 세그먼트를 보여주는 영화; 프레임은 20분마다 캡처됩니다. IS608 절제는 밝은 파란색 형광의 발달로 시각화됩니다. 이 동영상에 표시된 셀에는 TnpB의 발현이 포함되어 있지 않습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
살아있는 세포에서 전치 가능한 요소 활성의 실시간 이미징을 위해 여기에 제시된 고유한 방법은 살아있는 세포에서 실시간으로 전이를 직접 감지하고 이 활성을 보조 단백질의 발현과 연관시킬 수 있는 민감한 분석입니다. 처리량은 벌크 방법으로 달성할 수 있는 것보다 낮지만 이 방법은 개별 살아있는 세포에서 TE 활성 및 단백질 발현을 자세히 측정합니다.
실시간 이미징을 위해 현미경에서 직접 세포를 성장시키기 위해 다양한 도구와 기술을 사용할 수 있습니다. 여기에서 사용된 아가로스 패드 상의 세포 성장 방법은 빠르고 저렴하며 수행하기 쉽다는 장점이 있습니다. 관심있는 세포 성장 상태에 따라 가능한 단점은 아가 로스 패드에서 세포 성장을 지원할 수있는 자원이 제한되어 있으므로 세포가 자연적으로 이러한 자원을 소진하고 비교적 짧은 기간 (12-24 시간) 후에 성장을 멈춘다는 것입니다. 결과적으로, 세포를 정상 상태 성장으로 준비하고 충분한 측정 시간을 줄 수 있을 만큼 충분히 낮은 밀도로 패드를 접종하는 데 주의를 기울여야 합니다. 미세유체공학은 연장된 기간 동안 세포를 정상 상태 지수 성장으로 유지하기 위해 사용될 수 있지만(24), 이러한 방법이 효과적이기 위해서는 추가적인 전문 지식, 장비 및 설정이 필요합니다.
Kuhlman 실험실19로부터의 보다 상세한 연구를 보완하기 위해, IS200/IS605 TE 계열-관련 단백질 TnpB가 IS608 절제 속도를 최대 5배까지 증가시키고, 증가된 절제는 TnpB의 더 높은 발현 수준과 직접적으로 상관관계가 있음을 여기에서 예시한다. 이러한 방법은 트랜스포존 활성과 돌연변이 및 진화 역학에 미치는 영향을 밝히는 데 도움이 될 수 있는 개선된 분석 기술의 한 예입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구에 대한 재정 지원은 캘리포니아 대학의 창업 자금으로 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
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