Summary
En protokoll er skissert for å utføre live sanntidsavbildning for å kvantifisere hvordan tilbehørsproteinet TnpB påvirker transposisjonsdynamikken i individuelle levende Escherichia coli-celler .
Abstract
Her skisseres en protokoll for å utføre live, sanntidsavbildning av transponibel elementaktivitet i levende bakterieceller ved hjelp av en serie fluorescerende reportere koblet til transponering. Spesielt demonstrerer det hvordan sanntidsbilder kan brukes til å vurdere effekten av tilbehørsproteinet TnpB på aktiviteten til det transponerbare elementet IS608, et medlem av IS200 / IS605-familien av transponerbare elementer. IS200/IS605-familien av transponerbare elementer er rikelig med mobile elementer forbundet med et av de mest utallige gener som finnes i naturen, tnpB. Sekvens homologier foreslår at TnpB-proteinet kan være en evolusjonær forløper til CRISPR / Cas9-systemer. I tillegg har TnpB fått fornyet interesse, etter å ha vist seg å fungere som en Cas-lignende RNA-guidet DNA-endonuklease. Effektene av TnpB på transposisjonshastighetene til IS608 er kvantifisert, og det er vist at uttrykket av TnpB av IS608 resulterer i ~ 5x økt transposonaktivitet sammenlignet med celler som mangler TnpB-uttrykk.
Introduction
Transponerbare elementer (TEs) er genetiske elementer som mobiliserer i vertsgenomene ved eksisjon eller katalyseringskopiering etterfulgt av genomisk reintegrasjon. TEer finnes i alle livets domener, og transposisjon omstrukturerer vertsgenomet, muterer kodings- og kontrollområder1. Dette genererer mutasjoner og mangfold som spiller en viktig rolle i evolusjon2,3, utvikling4,5 og flere menneskelige sykdommer6, inkludert kreft7.
Ved å bruke nye genetiske konstruksjoner som par aspekter av transposisjonell aktivitet til fluorescerende reportere, beskrev vårt tidligere arbeid utviklingen av et eksperimentelt system basert på bakteriell TE IS608, en representant for den utbredte IS200 / IS605-familien av TEer, som muliggjør sanntidsvisualisering av transposisjon i individuelle levende celler8 (figur 1). TE-systemet vises i figur 1A. TE består av transposasekodingssekvensen, tnpA, flankert av venstre ende (LE) og høyre ende (RE) ufullkomne palindromiske repetisjoner (IP-er), som er gjenkjennings- og eksisjonsstedene for TnpA. tnpA uttrykkes ved hjelp av promotoren PLTetO1, som undertrykkes av tet-repressoren og kan induseres med anhydrotetracyklin (aTc)9. TE deler -10 og -35 sekvensene av en konstitutiv PlacIQ1 promotor10 for den blå reporteren mCerulean311. Som vist i figur 1C, når produksjonen av tnpA induseres, kan TE skåret ut, noe som fører til rekonstituering. Den produserte cellen uttrykker mCerulean3 og fluoresces blå. N-enden av TnpA er smeltet sammen med den gule reporteren Venus12, slik at måling av TnpA-nivåene ved gul fluorescens.
IS608 og andre medlemmer av IS200/IS605-familien av transposoner koder også vanligvis for et annet gen av den hittil ukjente funksjonen, tnpB13. TnpB-proteinene er en enormt rikelig, men ufullkommen karakterisert familie av nukleaser kodet av flere bakterielle og arkeale TEs14,15, som ofte består av bare tnpB16. Videre har nyere studier fornyet interessen for TnpB ved å finne at TnpB fungerer som en CRISPR / Cas-lignende programmerbar RNA-guidet endonuklease som vil gi enten dsDNA eller ssDNA pauser under forskjellige forhold17,18. Det er imidlertid fortsatt uklart hvilken rolle TnpB kan spille i regulering av transponering. For å utføre sanntidsvisualisering av effekten av TnpB på IS608-transposisjon, ble det opprettet en versjon av transposonet, inkludert kodingsområdet til TnpB med en N-terminal fusjon til det røde fluorescerende proteinet mCherry.
I tillegg til mer detaljerte bulknivåstudier utført av Kuhlman-laboratoriet19, vises det her hvordan sanntidsavbildning av transposonaktivitet kvantitativt kan avsløre virkningen av TnpB eller andre tilbehørsproteiner på transposisjonsdynamikk. Ved å fusjonere TnpB til mCherry identifiseres de enkelte transposisjonelle hendelsene ved blå fluorescens og korreleres med ekspresjonsnivåer av TnpA (gul fluorescens) og TnpB (rød fluorescens).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av bakteriekulturer
- Dyrk E. coli-stamme MG1655 med plasmidtransposonkonstruksjoner (tidligere beskrevet i Kim et al.8) over natten i LB med passende antibiotika (25 μg / ml kanamycin, se materialtabell) ved 37 ° C.
MERK: Sekvensene av konstruksjonene som brukes og de relaterte sekvensene er tilgjengelige som GenBank20 tiltredelsesnumre OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 og OP717085. - For å oppnå steady-state eksponentiell vekst, fortynnet kulturer ≥100 ganger inn i M63-mediet (100 mM KH 2PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4] 2SO 4, 0,5 μg / ml tiamin [vitamin B1]) supplert med en karbonkilde (0,5% w / v glukose her) og passende antibiotika (se materialtabell).
- Dyrk kulturer ved 37 ° C til den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) når ~ 0,2. Kulturene er klare til bruk.
2. Skyv forberedelse
- Forbered et lysbilde ved å koke M63 med 0,5% w / v glukose og 1,5% w / v agarose i mikrobølgeovnen for å smelte agarose og sikre at den er helt smeltet og godt blandet.
- La blandingen avkjøles til ~ 55 ° C før du tilsetter antibiotika og induktorer (25 μg / ml Kanamycin og 10 ng / μL anhydrotetracyklin [aTc], se materialtabell).
- Plasser et mikroskop lysbilde på arbeidsbenken. Stable to lysbilder til vinkelrett på den første og plasser en annen på toppen, parallelt med det nederste lysbildet. Forsikre deg om at det er et gap som tilsvarer en glidetykkelse mellom bunn- og topplysbildene. Pipette ~ 1 ml av M63 agaroseblandingen inn i dette gapet mellom lysbildene sakte for å skape en liten gelkvadrat.
- Når gelen har størknet (~ 10-15 min), skyv det øverste lysbildet for å fjerne det. Trim agaroseputen med et barberblad eller kniv. Deretter pipetter 2,5 μL av kulturen (trinn 1.3) og legg dekselet på toppen.
- Forsegl mellomrommet mellom lysbildet og dekselet med epoksy (se Materialtabell). La epoksyen tørke og cellene slå seg ned på agaroseputen i minst 1 time ved 37 °C.
3. Timelapse fluorescensmikroskopi
- Plasser den forberedte prøven (trinn 1.3) på et fluorescensmikroskop (se materialtabell) i et miljø som er oppvarmet og vedlikeholdt ved 37 °C.
- Still inn eksponeringstidene som passer for kameraet som brukes til bildeopptak. Juster belysningsintensiteten for å minimere fotobleking.
MERK: En eksponeringstid på 2 s for hver bølgelengde ble brukt for denne studien. - For hver bølgelengde, finn et synsfelt (FOV) som inneholder minimal fluorescens. Skaff bilder som skal brukes under analysen for bakgrunnssubtraksjon.
- Still inn eksponeringstidene som passer for kameraet som brukes til bildeopptak. Juster belysningsintensiteten for å minimere fotobleking.
- Sett opp en protokoll for å hente bilder i et rutenett med forskjellige bølgelengder og med jevne tidsintervaller.
- Kod timelapse-fotografering i protokollen. Sett innsamlingsfrekvensen til ønsket tidsintervall (20 min her) og total timelapse-varighet til ønsket lengde (24 timer).
- Kod passende bølgelengder inn i protokollen (avhengig av konstruksjonen som brukes).
MERK: mCherry-eksitasjonstoppen er på 587 nm og utslippstoppen på 610 nm21; mVenus er på 515 nm og 527 nm12, mens mCerulean3 er på 433 nm og 475 nm11. - Angi rutenettstørrelsen for å fange mellom ønsket antall FOVer.
MERK: De representative dataene som vises her, brukte 8 x 8 FOVer.
4. Bildeanalyse
- Utfør bakgrunnssubtraksjon på hver fargekanal ved å bruke de respektive bakgrunnsbildene som ble tatt i trinn 3.1.2. For alle analysetrinnene bruker vi standardmoduler i open source-plattformen Fiji22 (se Materialtabell).
- Tilnærmet den totale populasjonen på hvert tidspunkt ved å tømme mCerulean-kanalen og dele terskelområdet med det gjennomsnittlige celleområdet.
- For å telle de unike excision-hendelsene, ta deg tid til å avlede mCerulean3-kanalen. Utfør dette ved å trekke fra påfølgende bilder i mCerulean3-kanalen. Eksisjonshendelsene vil bli detektert i tidsderivatet som et lysglimt av fluorescens.
- Terskel stabelen av excision hendelser for å eliminere uønsket fluorescens. Merk at denne prosessen vil terskel ut deler av excisions selv. For å fikse dette, utvide bildene for å gjenopprette excisions til sine opprinnelige størrelser.
MERK: Analyser ved bruk av lignende terskel- og bildeanalyseteknikker kan også utføres på de andre fluorescenskanalene (f.eks. korrelere eksisjonshendelser med nivåer av transposase TnpA [gul Venusfluorescens] og TnpB [rød mCherry-fluorescens].
- Terskel stabelen av excision hendelser for å eliminere uønsket fluorescens. Merk at denne prosessen vil terskel ut deler av excisions selv. For å fikse dette, utvide bildene for å gjenopprette excisions til sine opprinnelige størrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden for å visualisere transposonaktivitet i levende celler ved fluorescensmikroskopi, mens den har lavere gjennomstrømning enn bulkfluorescensmålinger, tillater direkte visualisering av transposonaktivitet i individuelle levende celler. Transposoneksisjonshendelser resulterer i rekonstituering av promotoren for mCerulean3 (figur 1), slik at celler som gjennomgår transposonaktivitet kan identifiseres ved lyseblå fluorescens (figur 2, TnpB+: Supplementary Movie 1 og TnpB-: Supplementary Movie 2).
Det er funnet at celler som uttrykker tilbehørsproteinet TnpB (figur 3, oransje) opplever 4-5 ganger høyere nivåer av transposonaktivitet sammenlignet med de som ikke gjør det (figur 3, blå), i samsvar med de mer detaljerte bulknivåstudiene19. Dette er spesielt bemerkelsesverdig ettersom inkluderingen av kodesekvensen til mCherry-tnpB øker lengden på transposonen med ~ 2,000 bp, mens tidligere studier har funnet at IS608 transposon eksisjon er en eksponentielt avtagende funksjon av transposon lengde23.
En fordel med sanntidsavbildning er at når de er identifisert, kan celler som gjennomgår transposisjonelle hendelser spores videre og analyseres for å bestemme andre karakteristiske parametere, for eksempel vekstrate, for å bestemme fordelingen av kondisjonseffekter eller ekspresjonsnivået av tilbehørsproteiner for å bestemme deres innvirkning på transposisjonell aktivitet. I TnpB+-celler har for eksempel celler som gjennomgår transposoneksisjonshendelser høyere ekspresjonsnivåer av mCherry-TnpB enn den generelle befolkningen (figur 4A). For celler som gjennomgår eksisjonshendelser (figur 4B, mørk gul), uttrykker TnpB+-celler (figur 4B, nederst) bare marginalt høyere nivåer av Venus-TnpA-transposase enn TnpB-celler (figur 4B, øverst) (TnpB- 158,3 ± 68,2 AU, TnpB+: 193 ± 79,9 AU), som er høyere enn den gule fluorescensen til den generelle befolkningen (figur 4B , lys gul). Samlet sett antyder disse dataene at TnpB-protein er ansvarlig for de observerte høyere nivåene av transposisjonell aktivitet.
Figur 1: Genetiske konstruksjoner for avbildning av sanntids transposondynamikk. (A) mCerulean3-promotoren forstyrres av TE, hvis ender er flankert av venstre ende og høyre ende defekte palindromiske sekvenser (LE IP og RE IP). Transposasen, tnpA (grå), uttrykkes fra PLtetO1, som reguleres av tet-repressoren (grå) og kan induseres med anhydrotetracyklin (aTc). Sekvensene til Promoter/TE-krysset og promotoren -10 og -35 sekvenser (røde bokser) og TnpA-spaltesteder vises med piler. (B) TnpB+-konstruksjonen er der mCherry-tnpB har blitt transkripsjonelt smeltet sammen til venus-tnpA slik at begge transkriberes som et polycistronisk mRNA, som etterligner den naturlige konfigurasjonen av IS608. (C) Ved eksisjon repareres mCerulean3-promotoren, og cellen viser blå fluorescens. Den rekonstituerte promotorsekvensen vises under diagrammet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Visualisering av transposon excision hendelser. Eksempelfeltet for TnpB+ med celler (A) rett før og (B) etter påvisning av transposoneksisjonshendelser ved blå fluorescens. Hvite piler indikerer eksisjonshendelser. Tidsforskjellen mellom de to rammene er 20 min. Skala bar = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: TnpB øker transposon excision rate. Eksisjonshastigheten for TnpB+-celler (oransje) og TnpB- (blå) celler. Gjennomsnittsraten fra tre replikasjoner vises som punkter med skyggelagte områder med 95 % konfidensintervall. Dataene er justert slik at cellene begynner å fjerne ved t = 0. Maksimal målt hastighet for TnpB+-celler var 5,1 ± 2,4 x 10-2 hendelser per celle per time, mens for TnpB- var 1,4 ± 0,48 x 10-2 hendelser per celle per time. Gjennomsnittlig hastighet over hele intervallet som ble vist var 2,6 ± 1,8 x 10-2 hendelser per celle per time for TnpB+-celler og 5,3 ± 2,9 x 10-3 hendelser per celle per time for TnpB-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Proteinuttrykksstatistikk for excising celler versus total cellepopulasjon. Hver ramme ble delt inn i 64 like blokker, og fluorescens ble målt for celler som fjernet i blokken og for alle celler som finnes i blokken uavhengig av eksisjonsaktiviteten. Sannsynlighet, som plottet på y-aksen, måles som antall piksler av den angitte intensiteten i hver celletype dividert med totalt antall piksler. Blokkstørrelsen for hver ramme ble satt til 445 x 445 piksler. (A) Cellene som gjennomgår eksisjonshendelser (mørk rød) uttrykker mer TnpB enn den generelle befolkningen (lys rød). Den gjennomsnittlige røde fluorescensen for excising celler var 51,3 ± 15,4 AU (mørk rød), mens den for alle celler var 42,5 ± 7,4 AU (lys rød). (B) Venus-TnpA transposase nivåer er like i TnpB- (øverst) og TnpB + (nederst) celler. Datasettene er normalisert slik at de gjennomsnittlige gule fluorescensene av den totale cellepopulasjonen (lysegul) er like for TnpB +/- ved 105,7 AU. Cellene som har blitt identifisert som gjennomgår transposoneksisjonshendelser (mørk gul) utviser høyere gul fluorescens enn den generelle befolkningen, med lignende fordelinger for TnpB- (øverst) og TnpB + (nederst). Gjennomsnittlig gul fluorescens av excising populasjoner er TnpB-: 158,3 ± 68,2 AU og TnpB +: 193 ± 79,9 AU. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfilm 1: Sanntidsdynamikk for IS608-eksisjon med TnpB-uttrykk. En film som viser et 5-timers segment av sanntids IS608-dynamikk ; En ramme fanges hvert 20. minutt. IS608-eksisjon visualiseres som utviklingen av lyseblå fluorescens. Cellene som vises i denne filmen inkluderer uttrykket til TnpB. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfilm 2: Sanntidsdynamikk for IS608-eksisjon uten TnpB-uttrykk. En film som viser et 5-timers segment av sanntids IS608-dynamikk ; En ramme fanges hvert 20. minutt. IS608-eksisjon visualiseres som utviklingen av lyseblå fluorescens. Cellene som vises i denne filmen, inneholder ikke uttrykket til TnpB. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den unike metoden som presenteres her for sanntidsavbildning av transponibel elementaktivitet i levende celler, er en sensitiv analyse som direkte kan oppdage transposisjon i levende celler og i sanntid og korrelere denne aktiviteten med uttrykket av tilbehørsproteiner. Mens gjennomstrømningen er lavere enn det som kan oppnås ved bulkmetoder, oppnår denne metoden detaljerte målinger av TE-aktivitet og proteinuttrykk i individuelle levende celler.
En rekke verktøy og teknikker kan brukes til å dyrke celler direkte på mikroskopet for sanntidsbilder. Metoden som brukes her for cellevekst på agaroseputer har fordelen av å være rask, billig og enkel å utføre. En mulig ulempe, avhengig av den cellulære veksttilstanden av interesse, er at ressursene som er tilgjengelige for å støtte cellevekst i agaroseputen, er begrensede, og derfor vil cellene naturlig uttømme disse ressursene og slutte å vokse etter en relativt kort periode (12-24 timer). Derfor må det utvises forsiktighet for å forberede cellene i jevn vekst og inokulere puten med lav nok tetthet til å gi god tid til måling. Mikrofluidikk kan brukes til å opprettholde celler i steady state eksponentiell vekst i lengre perioder24, selv om disse metodene krever ytterligere kompetanse, utstyr og oppsett for å være effektive.
I tillegg til mer detaljert arbeid fra Kuhlman-laboratoriet19, er det illustrert her at IS200/IS605 TE-familieassosiert protein TnpB øker hastigheten på IS608-eksisjon med opptil fem ganger, og at økt eksisjon er direkte korrelert med høyere uttrykksnivåer av TnpB. Disse metodene er et eksempel på forbedrede analyseteknikker som kan bidra til å kaste lys over transposonaktivitet og dens innvirkning på mutasjons- og evolusjonær dynamikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Økonomisk støtte til denne forskningen ble gitt av oppstartsmidler fra University of California.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
- Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
- Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
- Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
- Goodier, J. L.
- Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
- Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
- Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
- Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
- Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
- Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
- Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
- Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
- Benson, D. A., et al.
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
- Wang, P., et al.
